Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Немаркированный, нерадиоизотопный метод анализа активности урацил-ДНК-гликозилазы был разработан с использованием масс-спектрометрии MALDI-TOF для прямого анализа апуринового/апиримидинического сайта,содержащего продукт. Анализ оказался довольно простым, специфическим, быстрым и удобным в использовании для измерения ДНК-гликозилазы.
Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) является ключевым компонентом в базовом пути иссечения для коррекции урацила, образующегося в результате гидролитического дезаминирования цитозина. Таким образом, это имеет решающее значение для поддержания целостности генома. Для измерения активности UDG был разработан высокоспецифичный, немаркированный, нерадиоизотопный метод. Синтетический дуплекс ДНК, содержащий сайт-специфический урацил, был расщеплен UDG, а затем подвергнут анализу лазерной десорбции / ионизации во время полета (MALDI-TOF MS). Был установлен протокол для сохранения продукта апуринового/апиримидинового сайта (AP) в ДНК без разрыва цепи. Изменение значения m/z от субстрата к продукту использовалось для оценки гидролиза урацила UDG. Субстрат G:U использовался для кинетического анализа UDG, в результате которого Km = 50 нМ, Vmax = 0,98 нМ/с и Kcat = 9,31 с-1. Применение этого метода к анализу ингибитора урацилгликозилазы (UGI) дало значение IC50 7,6 пМ. Специфичность UDG с использованием урацила в различных положениях в одноцепочечных и двухцепочечных субстратах ДНК продемонстрировала различную эффективность расщепления. Таким образом, этот простой, быстрый и универсальный метод MALDI-TOF MS может стать отличным эталонным методом для различных монофункциональных гликозилаз ДНК. Он также имеет потенциал в качестве инструмента для скрининга ингибиторов ДНК-гликозилазы.
Хотя урацил является нормальным основанием в РНК, он является распространенным и высокомутагенным поражением в геномной ДНК. Урацил может возникать в результате спонтанного/ферментативного гидролитического дезаминирования дезоксицитидина. В каждой живой клетке это дезаминирование происходит 100-500 раз в сутки при физиологических условиях1,2. Если эти изменения не восстанавливаются, может произойти изменение в составе последовательности ДНК, вызывающее мутацию. Поскольку урацил в ДНК предпочитает спариваться с dATP во время репликации, если цитозин деаминтируется в урацил, в двух событиях репликации в половине ДНК потомства будет новая мутация перехода G:C в A:T.
Среди клеточных стратегий для поддержания генетической стабильности восстановление иссечения оснований (BER) является важным механизмом, который восстанавливает поврежденные основания, такие как урацил, в ДНК4. BER является высоко эволюционно сохраненным процессом. Существует два общих пути BER: короткий путь, ведущий к репарации одного нуклеотида, и путь длинного пятна, который производит репарационный тракт по крайней мере из двух нуклеотидов5. BER является скоординированным механизмом, который происходит в несколько этапов. Первым шагом в BER является ферментативный гидролиз поврежденного нуклеотидного основания повреждающей ДНК-гликозилазой для генерации промежуточного сайта апуринина/апиримидинового (AP)6. За этим следует расщепление сахарно-фосфатной основы в месте AP эндонуклеазой, очистка концов ДНК лиазой, заполнение промежутков ДНК-полимеразой и герметизация конечного ника лигазой5.
Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) гидролизует урацил из урацилсодержащей ДНК для BER в Escherichia coli. Обычные анализы UDG с использованием радиомаркированной ДНК с использованием различных методов разделения6,7,8,9,10,11,12,13 обычно являются трудоемкими, трудоемкими, с дорогостоящими реагентами маркировки, сложными процедурами и требуют интенсивной подготовки и практики для снижения рисков воздействия радиоактивных материалов. Фторометрические олигонуклеотидные анализы были разработаны в качестве замены для радиоизотопной маркировки14, в дополнение к молекулярным маякам и технологии резонансного переноса энергии Фёрстера15,16,17,18,19,20. Тем не менее, для всех вышеупомянутых методов требуется специальная маркировка. В последнее время были разработаны безметочные биосенсорные анализы21,22,23 и колориметрические методы, основанные на формировании G-квадруплекса24,25,26. Однако несколько пар A:U или специально разработанные последовательности в зондах усложняют определение ферментной единицы.
MALDI-TOF MS - это технология, которая может быть очень полезна в анализе ДНК. Разработанные приложения включают генотипирование однонуклеотидного полиморфизма27,28, модифицированный нуклеотидный анализ29 и промежуточную идентификацию репарации ДНК30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS должен быть легко принят для анализа ДНК-гликозилазы для обнаружения ПРОДУКТОВ ДНК, содержащих AP-сайт. Однако AP-сайты в ДНК склонны к разрыву нити при многих экспериментальных условиях33. Анализ UDG представлен здесь с использованием MALDI-TOF MS для непосредственного измерения производства на площадке AP без значительного шума разрыва пряди. Этот метод без меток прост в работе и имеет высокий потенциал для фармацевтического применения скрининга ингибиторов ДНК-гликозилазы.
1. Подготовка подложки/шаблона
2. Анализ ДНК-гликозилазы
3. Перенос продуктов реакции UDG на матричную микросхему
4. Настройка параметров анализа на масс-спектрометре
5. Работа масс-спектрометра
6. Просмотр масс-спектров и анализ данных
Шаблоны и подложки
Взяв в качестве примера синтетические олигонуклеотиды с U в центре (U+9) в паре с шаблоном G (рис. 1А), для контроля качества чистоты синтетических олигонуклеотидов может быть использован пустой контроль эквимолярных количеств шаблона и урацил...
В этой статье представлена подробная процедура использования метода анализа UDG MALDI-TOF MS для непосредственного обнаружения ПРОДУКТОВ ДНК, содержащих AP. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что субстраты, содержащие урацил, не содержат этикеток, масштабируемы, просты в р?...
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Мы благодарим NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Тайбэй, Тайвань) и NRPB Pharmacogenomics Lab (Тайбэй, Тайвань) за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня, R.O.C. [номер гранта MOST109-2314-B-002 -186 для K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 для S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 для W.-h.F.]. H.-L.C. является получателем докторской стипендии от Национального университета Тайваня. Финансирование сбора за открытый доступ: Министерство науки и технологий, R.O.C.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. | |
MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены