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Resumo

Um método não-rótulo, não-isotópico não-radio-isotópico para avaliar a atividade uracil-DNA glicosylase foi desenvolvido usando espectrometria de massa MALDI-TOF para análise direta do produto que contém local apurinic/apyrimidinic. O ensaio provou ser bastante simples, específico, rápido e fácil de usar para a medição de glicosilase de DNA.

Resumo

Uracil-DNA glicosylase (UDG) é um componente-chave na via de reparo de excisão base para a correção de uracil formado a partir de deaminação hidrolítica da citosina. Assim, é crucial para a manutenção da integridade do genoma. Um método altamente específico, não rotulado, não-radio-isotópico foi desenvolvido para medir a atividade udg. Um duplex de DNA sintético contendo um uracil específico do local foi cortado pelo UDG e, em seguida, submetido à análise de espectrometria de massa assistida pela Matrix(MALDI-TOF MS). Um protocolo foi estabelecido para preservar o produto apurinic/apyrimidinic (AP) no DNA sem quebra de fios. A alteração do valor m/z do substrato para o produto foi utilizada para avaliar a hidrólise uracil por UDG. Um substrato G:U foi utilizado para análise cinética UDG que produz o Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s e Kcat = 9,31 s-1. A aplicação deste método a um ensaio inibidor de gllicosylase uracil (UGI) rendeu um valor IC50 de 7,6 pM. A especificidade do UDG usando uracil em várias posições dentro de substratos de DNA de fio único e duplamente encalhados demonstrou diferentes eficiências de decote. Assim, este método simples, rápido e versátil MALDI-TOF MS pode ser um excelente método de referência para várias glicosilases de DNA monofuncionais. Também tem o potencial como ferramenta para a triagem inibidora de glicosilase de DNA.

Introdução

Embora o uracil seja uma base normal no RNA, é uma lesão comum e altamente mutagênica no DNA genômico. Uracil pode surgir de deaminação hidrolítica espontânea/enzimática de uma desoxicytidina. Em cada célula viva, essa desaminação ocorre 100-500 vezes por dia sob condições fisiológicas1,2. Se essas alterações não forem reparadas, pode haver uma mudança na composição da sequência de DNA, causando mutação. Como uracil no DNA prefere emparelhar com dATP durante a replicação, se a citosina desaminar para uracil, em dois eventos de replicação, haverá uma nova mutação de transição G:C para A:T em metade do DNA progêneo3.

Entre as estratégias celulares para manter a estabilidade genética, o reparo da excisão de base (BER) é um mecanismo essencial que repara bases danificadas, como uracil, no DNA4. BER é um processo altamente conservado evolutivamente. Existem duas vias ber gerais: a via de remendo curto que leva a um trecho de reparo de um único nucleotídeo e a via de remendo longo que produz um setor de reparo de pelo menos dois nucleotídeos5. BER é um mecanismo coordenado que ocorre em várias etapas. O primeiro passo no BER é a hidrólise enzimática da base nucleotídea danificada por uma glicosilase de DNA específica para gerar um local intermediário apurinic/apyrimidinic (AP) 6. Isso é seguido pelo decote da espinha dorsal do fosfato de açúcar no local ap por uma endonuclease, a limpeza do DNA termina por uma lise, preenchimento de lacunas por uma polimerase de DNA, e selando o corte final por um ligase5.

Uracil-DNA glicosylase (UDG) hidrolisa o uracil de DNA contendo uracil para BER em Escherichia coli. Ensaios convencionais de UDG utilizando DNA radiolabeled envolvendo diferentes técnicas de separação6,7,8,9,10,11,12,13 são geralmente demorados, intensivos em mão-de-obra, com reagentes de rotulagem dispendiosos, procedimentos complicados e que exigem treinamento intensivo e prática para reduzir riscos de exposição a materiais radioativos. Ensaios de oligonucleotídeos fluorométricos foram desenvolvidos como um substituto para a rotulagem de radioisótopos14, além de faróis moleculares e tecnologia de transferência de energia de ressonância Förster15,16,17,18,19,20. No entanto, é necessária rotulagem específica para todos os métodos acima mencionados. Recentemente foram desenvolvidos ensaios biosensores sem rótulo21,22,23 e métodos colorimétricos baseados na formação de um G-quadruplex24,25,26. No entanto, vários pares A:U ou sequências especialmente projetadas nas sondas complicam a definição da unidade enzimápica.

MALDI-TOF MS é uma tecnologia que pode ser de grande utilidade na análise de DNA. As aplicações desenvolvidas incluem genotipismo de nucleotídeo único genotipagem27,28, análise de nucleotídeos modificados29 e identificação intermediária de reparo de DNA30,31,32,33,34. Maldi-TOF MS deve ser prontamente adotado para análise de glicosylase de DNA para detectar produtos de DNA contendo local de AP. No entanto, os ap-sites no DNA são propensos a quebra de fios em muitas condições experimentais33. Um ensaio UDG é apresentado aqui usando MALDI-TOF MS para medir diretamente a produção do local AP sem ruído significativo de quebra de fios. Este método livre de rótulos é fácil de trabalhar e tem um alto potencial para a aplicação farmacêutica do rastreamento inibidor de glicosylase de DNA.

Protocolo

1. Preparação de substrato/modelo

  1. Design uracil substrato/modelo duplex com um conteúdo G+C equilibrado de ~50 ± 10% e temperatura mínima de fusão de 50 °C para a região duplex.
    NOTA: Uma diferença de nucleotídeos entre 18 substratos e 19 modelos nt (Tabela 1 e Figura 1) ajuda a melhor interpretação do sinal de MS e a ressaração adequada. A cadeia de modelo serve como DNA complementar para gerar incompatibilidades A-U ou G-U (Tabela 1), mas também pode ser usada como sinal de referência em medições de MS. O uso de oligonucleotídeos sintéticos purificados pelo HPLC é satisfatório para este estudo.
  2. Dissolver o DNA em 1 mM EDTA e 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C) (TE) a uma concentração de 100 μmol/L como estoque e armazenar a -20 °C. Diluir este estoque de 20 μL com TE para um volume final de 800 μL (diluição de 25 vezes para 4 μmol/L). Meça a absorvância da solução de DNA em um espectrofotômetro visível UV em λ = 260 nm para garantir a concentração atribuída pelo fabricante. Por exemplo: A260 = 0,204 para 4 μmol/L de U+9 e A260 = 0,192 para 4 μmol/L de T1 (Tabela 1).
  3. Realize a análise MALDI-TOF MS (seções 4-6) para controle de qualidade oligonucleotídeo inspecionando sinais de pico únicos nos valores de m/z designados, bem como verificando se a relação sinal-ruído é >100 (Figura 1B e Figura 1D).

2. Ensaio de glicosylase de DNA

  1. Usando um substrato G:U de T1/U+9 duplex (Tabela 1 e Figura 1A) para a reação glicosylase, por exemplo, em um tubo de microcentrifuge estéril de 1,5 mL, adicione 70 μL de H2O, 10 μL de 10x UDG tampão de reação, 5 μL de estoque T1 e 5 μL de ação U+9 (etapa 1.2.).
    NOTA: Escolha o tipo correto de micropipette e siga as instruções dos fabricantes para manusear o volume necessário. Por exemplo, use uma pipeta de 2 μL para dispensar 0,1-2 μL de líquido, use uma pipeta de 10 μL para dispensar 2-10 μL de líquido e use uma pipeta de 100 μL para dispensar 20-100 μL de líquido para garantir a precisão e precisão dos resultados. O volume descrito da mistura de reagentes é para 10 ensaios; ajustar o volume para o número desejado de reações. O buffer de reação 1x UDG contém 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol e 20 mM Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C). Consulte a Tabela de Materiais para obter a fonte do buffer de reação UDG de 10x.
  2. Feche o tubo com segurança; incubar em um banho de água por 30 min a 65 °C, depois por 30 min a 37 °C, e finalmente no gelo por 3 min para garantir o ressarcer adequado do substrato/modelo duplex.
  3. Em um tubo de microcentrifuge estéril de 1,5 mL, adicione 49 μL de tampão de reação UDG 1x gelado e 1 μL de UDG (5.000 unidades/mL; ver a Tabela de Materiais), diluindo para 0,1 unidades/μL. Faça diluições seriais com tampão UDG 1x para as concentrações enzimáticas desejadas de 0,05, 0,02 ou 0,01 unidades/μL. Mantenha sempre o UDG diluído no gelo.
    NOTA: Em uma reação de 10 μL, 0,1 unidades de UDG podem cortar mais de 30 pmol de uracil a partir de um duplex T1/U+9 em 3 min.
  4. Em um tubo de microcentrifuge estéril de 1,5 mL, adicione 9,0 μL de mistura de substrato a partir da etapa 2.2 e pré-ataque do tubo a 37 °C. Adicione 1,0 μL do UDG diluído da etapa 2.3. Use um temporizador para cronometrar a reação e aperte o tubo para misturar o conteúdo.
    NOTA: Para um ensaio de definição de unidade, o tempo de incubação é de 30 minutos. Para um ensaio cinético, utilize uma análise de curso de tempo de 0,5, 1, 2, 3, 5 min para obter a taxa inicial. Para um ensaio de inibição ugi, cronometre a reação para 15 min.
  5. Centrifugar os tubos com a mistura de reação para 3-5 s a 3.200 × g em temperatura ambiente. Em seguida, transfira a reação imediatamente para 37 °C.
  6. Rescisão de reação
    1. Prepare soluções de 0,25 M HCl e base 0,23 M Tris. Em um tubo de ensaio de 15 mL, adicione 10 mL de uma solução de 1 mM EDTA e 20 mM Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C) para imitar 1x tampão de reação UDG. Acidificar com 1 mL de 0,25 M HCl e verificar com um medidor de pH para garantir que o pH seja ~2 ± 0,5. Neutralizar com 1 mL de base 0,23 M Tris e verificar com um medidor de pH para um pH final de 6,5 ± 0,5.
      NOTA: O uso de tiras de teste de pH é uma maneira rápida e fácil de reconfirmar os níveis de pH da mistura de reagentes.
    2. Adicione 1 μL de 0,25 M HCl para acidificar a mistura de reação de 10 μL para inativar a enzima e colocá-la no gelo por 6 minutos. Adicione 1 μL de base tris de 0,23 M para neutralizar os produtos de DNA para evitar a quebra do local ap por exposição prolongada ao ácido. Adicione 13 μL TE para aumentar o volume da mistura do produto para transferência de chips matricial e, em seguida, coloque-o no gelo.
      NOTA: O produto AP é quimicamente instável e deve ser analisado por MALDI-TOF MS dentro de 2 dias. Após armazenamento prolongado por mais de uma semana, o acúmulo de uma porção substancial de quebras de fios ocorre devido a reações de eliminação β/δ dos produtos AP (Figura 1D-G).
  7. Transfira todos os produtos de reação UDG de 25 μL de tubos de microcentrifuuga para uma placa de microtiter de 384 poços.
    NOTA: Altas concentrações de cáções, como sódio ou potássio em tampões, geram interferência na análise MALDI-TOF MS e, portanto, requerem desselga. Como o buffer de reação UDG E. coli contém concentrações muito baixas de cations, a dessação não é necessária. No entanto, modifique este protocolo para medir outras reações de glicosylase de DNA contendo cações metálicas que requerem dessalgação como descrito anteriormente35.

3. Transfira produtos de reação UDG para um chip de matriz

  1. Abra a porta do distribuidor de nanoliter (veja a Tabela de Materiais) e carregue a placa de microtiter de 384 poços da etapa 2.7 para o suporte da placa do convés.
  2. Insira a matriz do chip na posição correspondente da placa de batedor. Coloque a placa de batedor carregada no convés de processamento do distribuidor de nanoliter e feche a porta.
  3. Toque no botão executar na tela de transferência e aguarde que o instrumento comece a distribuir amostras da placa de microtiter de 384 poços para o chip matrix.
  4. Use a opção guia Visão para mostrar a imagem do chip e os volumes de distribuição para cada ponto durante a dispensação. Certifique-se de que o volume manchado no chip esteja na faixa de 5-10 nL.

4. Configure os parâmetros de ensaio no espectrômetro de massa

  1. Use o programa de aplicação (ver a Tabela de Materiais) para preparar um arquivo .xlsx contendo o valor de m/z de sinal previsto para importação.
    NOTA: As configurações em FILE I.xlsx (Tabela 2) são configurações de exemplo para o ensaio UDG do substrato G:U na seção 2.
  2. Use o programa de aplicativos para criar e definir um novo ensaio UDG clicando com o botão direito do mouse no Grupo de Ensaio de Importação em Formato de Designer e selecionando o arquivo .xlsx da lista suspensa (por exemplo, FILE I.xlsx da etapa 4.1).
  3. Clique com o botão direito do cliente:Project:Plate button e clique na parte superior da árvore de opção suspensa para estabelecer uma nova placa de ensaio. Na caixa de diálogo, digite um nome de arquivo (por exemplo, CTT20210620 para o código de laboratório e data de ensaio), e no tipo de placa suspensa, selecione o tipo de placa de 384 poços e pressione OK. Procure uma placa em branco para aparecer à direita da tela.
  4. Clique na opção Ensaio ; selecione o ensaio (por exemplo, ARQUIVO I.xlsx) da lista suspensa.
  5. Para atribuir o ensaio selecionado (por exemplo, FILE I.xlsx) a cada posição de ponto de amostra na placa, mova o cursor para cada posição da placa em branco, clique para destacar o poço e clique com o botão direito do mouse para selecionar Adicionar Plex.
  6. Use um computador desktop ou laptop para preparar uma lista de trabalho em formato .xlsx sem cabeçalho (por exemplo, 0620.xlsx da Tabela 3) para todas as amostras do chip a partir da etapa 2.7. Clique no botão Adicionar novo projeto de amostra ; selecione o arquivo (por exemplo, 0620.xlsx) da lista suspensa para importar a lista de trabalho.
  7. Procure todos os códigos de amostra de teste na lista de trabalho (por exemplo, a partir de 0620.xlsx) à esquerda da tela. Clique no código de amostra na lista de trabalho e clique com o botão direito do mouse na posição correspondente da placa para vincular os testes a cada posição.

5. Operação do espectrômetro de massa

  1. Use o programa de aplicação para vincular o espectrômetro de massa (ver a Tabela de Materiais) ao chip de amostra (da seção 3) a ser analisado.
  2. Clique na configuração padrão. Na caixa de diálogo, digite um nome de arquivo da etapa 4.3 (por exemplo, CTT20210620); no Nome do Experimento, digite o ID do chip no Código de Barras do Chip e salve as configurações.
  3. Inicie o programa de controle de espectrômetro de massa (veja a Tabela de Materiais).
  4. Pressione o botão Entrar/Sair do espectrômetro de massa e deixe o deck se estender. Retire o suporte do chip e insira o chip de amostra da etapa 3.4 no suporte do chip. Coloque o suporte do chip carregado no convés estendido e pressione o botão Entrar/Para que o chip de amostra entre no instrumento.
  5. Clique duas vezes no ícone Adquirir do programa de aplicativo. Na janela Adquirir , clique na guia de execução automática para iniciar o instrumento e adquira espectros de massa das amostras no chip.

6. Visualização de espectros de massa e análise dos dados

  1. Executar o programa de análise de dados (ver a Tabela de Materiais).
  2. Navegue pela árvore do banco de dados e selecione o ID do chip a partir da etapa 5.2. Clique para destacar bem um alvo no chip e clique no ícone de espectro para mostrar o espectro de massa.
  3. Clique com o botão direito do mouse para escolher o Diálogo de Personalização para cortar uma gama específica de espectro em uma nova janela. Clique no Eixo X para digitar os limites superiores e inferiores do m/z e pressione OK para mostrar o espectro de alcance especificado, incluindo os sinais de interesse.
    NOTA: A quantidade de DNA é proporcional à intensidade máxima em cada unidade de valor m/z.
  4. Meça a altura máxima dos valores m/z dos sinais correspondentes ao substrato U, produto AP e modelo. Clique no pico e veja a altura máxima no canto superior esquerdo da tela.
    NOTA: Um espectro de 1.600 unidades de largura/1.200 é uma dimensão razoável para inspeção em uma tela de computador, bem como para registro.
  5. Para salvar o espectro para registro, clique com o botão direito do mouse em Exportar e selecione o tipo de arquivo JPEG na lista suspensa. Clique em Destino e Veja disco para selecionar o dispositivo de armazenamento na lista suspensa (por exemplo, flash disc E:). Digite o nome do arquivo (por exemplo, 0620_1-2.jpg) e clique em Exportar.
  6. Se necessário, imprima um arquivo JPEG exportado e meça a altura máxima manualmente usando uma régua.

Resultados

Modelos e substratos
Tomando oligonucleotídeos sintéticos com U no centro (U+9) emparelhados com um modelo G como exemplo (Figura 1A), um controle em branco de quantidades equimolares de modelo e substrato contendo uracil pode ser usado para controle de qualidade da pureza oligonucleotídeo sintético (Figura 1B; os sinais correspondem ao m/z designado e ao baixo ruído de fundo). Para a análise dos dados de MS, as alturas máximas foram m...

Discussão

Este artigo fornece um procedimento detalhado para o uso de um método de ensaio UDG MALDI-TOF MS para detectar diretamente produtos de DNA contendo AP. As principais vantagens deste método são que os substratos contendo uracil são livres de rótulos, escaláveis, fáceis de trabalhar e oferecem maior flexibilidade no design de substratos.

A extração de fenol/clorofórmio recomendada pelo fornecedor UDG permite a inativação da enzima para evitar a degradação do DNA do produto. No enta...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Centro Integrado de Genômica Funcional da NCFPB (Taipei, Taiwan) e ao NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan, R.O.C. [número de subvenção MOST109-2314-B-002 -186 para K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 para S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 para W.-h.F.]. H.-L.C. é um beneficiário de uma bolsa de doutorado da Universidade Nacional de Taiwan. Financiamento para cobrança de acesso aberto: Ministério da Ciência e Tecnologia, R.O.C.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)J.T bakerProtocol 1,2
Autoclaved deionized waterMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
GlovesAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl)SIGMAProtocol 1,2
Ice bucketTaiwan.IncProtocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL)extra geneProtocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY NanodispenserAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
MicrocentrifugeKubotaProtocol 2
MicrocentrifugeClubioProtocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL)National scientific supply co, Inc.Protocol 2
Microcentrifuge tube rackTaiwan.IncProtocol 1,2
Micropipette  (P1000)GilsonProtocol 1,2
Micropipette  (P2)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P10)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P100)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P200)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Singapore)Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1)AAT Bioquest, Inc.Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA#01509Protocol 3, 5
TimerTaiwan.IncProtocol 2
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Uracil Glycosylase InhibitorNew England Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA GlycosylaseNew England Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601SHIMADZUProtocol 1
Water bathZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)Protocol 2

Referências

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