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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un metodo non marcato, non radio-isotopico per analizzare l'attività della glicosilasi uracil-DNA, è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF per l'analisi diretta del prodotto contenente sito apurinico/aprimidinico. Il test si è rivelato abbastanza semplice, specifico, rapido e facile da usare per la misurazione della glicosilasi del DNA.

Abstract

L'uracil-DNA glicosilasi (UDG) è un componente chiave nella via di riparazione dell'escissione di base per la correzione dell'uracile formato dalla deaminazione idrolitica della citosina. Pertanto, è fondamentale per il mantenimento dell'integrità del genoma. È stato sviluppato un metodo altamente specifico, non etichettato, non radio-isotopico per misurare l'attività UDG. Un duplex di DNA sintetico contenente un uracile sito-specifico è stato scisso da UDG e quindi sottoposto all'analisi di spettrometria di massa a tempo di volo (MALDI-TOF MS) laser assistita da matrice. È stato stabilito un protocollo per preservare il prodotto del sito apurinico/aprimidinico (AP) nel DNA senza rottura del filamento. La variazione del valore m/z dal substrato al prodotto è stata utilizzata per valutare l'idrolisi dell'uracile da parte dell'UDG. Un substrato G:U è stato utilizzato per l'analisi cinetica UDG producendo Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s e Kcat = 9,31 s-1. L'applicazione di questo metodo a un saggio inibitore della glicosilasi dell'uracile (UGI) ha prodotto un valore IC50 di 7,6 pM. La specificità UDG che utilizza l'uracile in varie posizioni all'interno di substrati di DNA a singolo filamento e doppio filamento ha dimostrato diverse efficienze di scissione. Pertanto, questo metodo MALDI-TOF MS semplice, rapido e versatile potrebbe essere un eccellente metodo di riferimento per varie glicosilasi monofunzionali del DNA. Ha anche il potenziale come strumento per lo screening degli inibitori della glicosilasi del DNA.

Introduzione

Sebbene l'uracile sia una base normale nell'RNA, è una lesione comune e altamente mutagena nel DNA genomico. L'uracile può derivare dalla deaminazione idrolitica spontanea/enzimatica di una deossicitidina. In ogni cellula vivente, questa deaminazione avviene 100-500 volte al giorno in condizioni fisiologiche1,2. Se queste alterazioni non vengono riparate, ci può essere un cambiamento nella composizione della sequenza del DNA, causando mutazioni. Poiché l'uracile nel DNA preferisce accoppiarsi con dATP durante la replicazione, se la citosina si deamina in uracile, in due eventi di replicazione, ci sarà una nuova mutazione di transizione da G:C ad A:T in metà del DNA della progenie3.

Tra le strategie cellulari per mantenere la stabilità genetica, la riparazione dell'escissione di base (BER) è un meccanismo essenziale che ripara le basi danneggiate, come l'uracile, nel DNA4. BER è un processo altamente conservato evolutivamente. Esistono due vie BER generali: la via a patch corta che porta a un tratto di riparazione di un singolo nucleotide e la via a patch lunga che produce un tratto di riparazione di almeno due nucleotidi5. BER è un meccanismo coordinato che si verifica in più passaggi. Il primo passo nel BER è l'idrolisi enzimatica della base nucleotidica danneggiata da una glicosilasi del DNA specifica per il danno per generare un sito intermedio apurinico/aprimidinico (AP)6. Questo è seguito dalla scissione della spina dorsale zucchero-fosfato nel sito AP da un'endonucleasi, pulizia delle estremità del DNA da una liasi, riempimento del gap da una DNA polimerasi e sigillatura del nick finale da una ligasi5.

Uracil-DNA glycosylase (UDG) idrolizza l'uracile dal DNA contenente uracile per BER in Escherichia coli. I saggi UDG convenzionali che utilizzano DNA radiomarcato che coinvolgono diverse tecniche di separazione6,7,8,9,10,11,12,13 sono di solito dispendiosi in termini di tempo, laboriosità, con costosi reagenti di etichettatura, procedure complicate e che richiedono una formazione e una pratica intensive per ridurre i rischi di esposizione a materiali radioattivi. I saggi oligonucleotidici fluorometrici sono stati sviluppati in sostituzione dell'etichettatura dei radioisotopi14, oltre ai beacon molecolari e alla tecnologia di trasferimento dell'energia di risonanza di Förster15,16,17,18,19,20. Tuttavia, è richiesta un'etichettatura specifica per tutti i metodi di cui sopra. Recentemente sono stati sviluppati saggi di biosensori privi di etichette21,22,23 e metodi colorimetrici basati sulla formazione di un G-quadruplex24,25,26. Tuttavia, più coppie A:U o sequenze appositamente progettate nelle sonde complicano la definizione dell'unità enzimatica.

MALDI-TOF MS è una tecnologia che potrebbe essere di grande utilità nell'analisi del DNA. Le applicazioni sviluppate includono la genotipizzazione del polimorfismo a singolo nucleotide27,28, l'analisi nucleotidica modificata29 e l'identificazione intermedia di riparazione del DNA30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS deve essere prontamente adottato per l'analisi della glicosilasi del DNA per rilevare prodotti a DNA contenenti sito AP. Tuttavia, i siti AP nel DNA sono soggetti a rottura del filamento in molte condizioni sperimentali33. Un test UDG viene presentato qui utilizzando MALDI-TOF MS per misurare direttamente la produzione del sito AP senza un significativo rumore di strand-break. Questo metodo senza etichette è facile da usare e ha un alto potenziale per l'applicazione farmaceutica dello screening degli inibitori della glicosilasi del DNA.

Protocollo

1. Preparazione del substrato/modello

  1. Progettare il substrato/modello duplex di uracile con un contenuto G+C bilanciato di ~50 ± 10% e una temperatura minima di fusione di 50 °C per la regione duplex.
    NOTA: Una differenza nucleotidica tra 18 substrati nt e modelli 19 nt (Tabella 1 e Figura 1) aiuta a migliorare l'interpretazione del segnale MS e la ricottura appropriata. Il filamento modello funge da DNA complementare per generare discrepanze A-U o G-U (Tabella 1), ma può anche essere utilizzato come segnale di riferimento nelle misurazioni della SM. L'uso di oligonucleotidi sintetici purificati con HPLC è soddisfacente per questo studio.
  2. Sciogliere il DNA in 1 mM EDTA e 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 a 25 °C) (TE) ad una concentrazione di 100 μmol/L come stock e conservare a -20 °C. Diluire questo stock da 20 μL con TE fino a un volume finale di 800 μL (diluizione 25 volte a 4 μmol/L). Misurare l'assorbanza della soluzione di DNA in uno spettrofotometro UV-visibile a λ = 260 nm per garantire la concentrazione assegnata dal produttore. Ad esempio: A260 = 0,204 per 4 μmol/L di U+9 e A260 = 0,192 per 4 μmol/L di T1 (Tabella 1).
  3. Eseguire l'analisi MALDI-TOF MS (sezioni 4-6) per il controllo di qualità degli oligonucleotidi ispezionando segnali di picco univoci a valori m/z designati e controllando che il rapporto segnale-rumore sia >100 (Figura 1B e Figura 1D).

2. Saggio della dna glicosilasi

  1. Utilizzando un substrato G:U di T1/U+9 duplex (Tabella 1 e Figura 1A) per la reazione della glicosilasi, ad esempio, in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL, aggiungere 70 μL di H2O, 10 μL di tampone di reazione UDG 10x, 5 μL di stock T1 e 5 μL di stock U+9 (fase 1.2.).
    NOTA: scegliere il tipo corretto di micropipetta e seguire le istruzioni del produttore per gestire il volume richiesto. Ad esempio, utilizzare una pipetta da 2 μL per erogare 0,1-2 μL di liquido, utilizzare una pipetta da 10 μL per erogare 2-10 μL di liquido e utilizzare una pipetta da 100 μL per erogare 20-100 μL di liquido per garantire accuratezza e precisione dei risultati. Il volume descritto della miscela di reagenti è per 10 saggi; regolare il volume per il numero desiderato di reazioni. Il tampone di reazione 1x UDG contiene 1 mM di EDTA, 1 mM ditiotreitolo e 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 a 25 °C). Vedere la tabella dei materiali per la fonte del buffer di reazione UDG 10x.
  2. Chiudere saldamente il tubo; incubare a bagnomaria per 30 minuti a 65 °C, poi per 30 minuti a 37 °C e infine su ghiaccio per 3 minuti per garantire una corretta ricottura del substrato/modello duplex.
  3. In un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL, aggiungere 49 μL di tampone di reazione UDG 1x ghiacciato e 1 μL di UDG (5.000 unità/mL; vedere la Tabella dei materiali), diluendo a 0,1 unità/μL. Effettuare diluizioni seriali con 1x tampone UDG alle concentrazioni enzimatiche desiderate di 0,05, 0,02 o 0,01 unità/μL. Tenere sempre l'UDG diluito sul ghiaccio.
    NOTA: In una reazione di 10 μL, 0,1 unità di UDG possono scindere più di 30 pmol di uracile da un duplex T1/U+9 in 3 min.
  4. In un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL, aggiungere 9,0 μL di miscela di substrato dal punto 2.2 e preriscaldare il tubo a 37 °C. Aggiungere 1,0 μL dell'UDG diluito dal passaggio 2.3. Utilizzare un timer per cronometrare la reazione e far scorrere il tubo per mescolare il contenuto.
    NOTA: per un test di definizione unitaria, il tempo di incubazione è di 30 min. Per un test cinetico, utilizzare un'analisi del corso temporale di 0,5, 1, 2, 3, 5 minuti per ottenere la velocità iniziale. Per un test di inibizione UGI, cronometrare la reazione per 15 minuti.
  5. Centrifugare i tubi con la miscela di reazione per 3-5 s a 3.200 × g a temperatura ambiente. Quindi, trasferire immediatamente la reazione a 37 °C.
  6. Terminazione della reazione
    1. Preparare soluzioni da 0,25 M HCl e 0,23 M Tris base. In una provetta da 15 mL, aggiungere 10 mL di una soluzione di 1 mM EDTA e 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 a 25 °C) per imitare 1x tampone di reazione UDG. Acidificare con 1 mL di 0,25 M HCl e controllare con un pHmetro per assicurarsi che il pH sia ~ 2 ± 0,5. Neutralizzare con 1 mL di base Tris da 0,23 M e verificare con un pHmetro un pH finale di 6,5 ± 0,5.
      NOTA: l'utilizzo di strisce reattive per pH è un modo semplice e veloce per riconfermare i livelli di pH della miscela di reagenti.
    2. Aggiungere 1 μL di 0,25 M HCl per acidificare la miscela di reazione da 10 μL per inattivare l'enzima e metterlo sul ghiaccio per 6 min. Aggiungere 1 μL di 0,23 M di base Tris per neutralizzare i prodotti a DNA per evitare la rottura del sito AP dovuta all'esposizione prolungata all'acido. Aggiungere 13 μL di TE per aumentare il volume della miscela di prodotti per il trasferimento di trucioli di matrice e quindi posizionarla sul ghiaccio.
      NOTA: Il prodotto AP è chimicamente instabile e deve essere analizzato da MALDI-TOF MS entro 2 giorni. Dopo una conservazione prolungata per più di una settimana, l'accumulo di una parte sostanziale delle rotture dei filamenti si verifica a causa di reazioni di eliminazione β/δ dei prodotti AP (Figura 1D-G).
  7. Trasferire tutti i prodotti di reazione UDG da 25 μL dai tubi microcentrifuga a una piastra di microtitolazione a 384 pozzetti.
    NOTA: Alte concentrazioni di cationi, come sodio o potassio nei tamponi, generano interferenze nell'analisi MALDI-TOF MS e quindi richiedono la desalinizzazione. Poiché il tampone di reazione UDG di E. coli contiene concentrazioni molto basse di cationi, la desalinizzazione non è necessaria. Tuttavia, modificare questo protocollo per misurare altre reazioni della glicosilasi del DNA contenenti cationi metallici che richiedono la desalinizzazione come descritto in precedenza35.

3. Trasferire i prodotti di reazione UDG a un chip a matrice

  1. Aprire la porta del distributore di nanolitri (vedere la tabella dei materiali) e caricare la piastra di microtitolazione a 384 pozzetti dal passaggio 2.7 sul supporto della piastra del ponte.
  2. Inserire l'array di chip a matrice nella posizione della piastra scout corrispondente. Posizionare la piastra di esplorazione caricata sul piano di lavorazione del distributore di nanolitri e chiudere la porta.
  3. Toccare il pulsante di esecuzione nella schermata di trasferimento e attendere che lo strumento inizi a erogare campioni dalla piastra di microtitolazione a 384 pozzetti al chip della matrice.
  4. Utilizzare l'opzione della scheda Visione per visualizzare l'immagine del chip e i volumi di erogazione per ciascun punto durante l'erogazione. Assicurarsi che il volume individuato sul chip sia compreso tra 5 e 10 nL.

4. Impostare i parametri di analisi sullo spettrometro di massa

  1. Utilizzare il programma applicativo (vedere la Tabella dei materiali) per preparare un file di .xlsx contenente il valore m/z del segnale previsto per l'importazione.
    NOTA: le impostazioni in FILE I.xlsx (Tabella 2) sono impostazioni di esempio per il saggio UDG del substrato G:U nella sezione 2.
  2. Utilizzare il programma applicativo per creare e definire un nuovo test UDG facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'opzione Importa gruppo di analisi nel formato designer e selezionando il file .xlsx dall'elenco a discesa (ad esempio, FILE I.xlsx dal passaggio 4.1).
  3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante Customer:Project:Plate e fare clic sulla parte superiore dell'albero delle opzioni a discesa per stabilire una nuova piastra di analisi. Nella finestra di dialogo digitare un nome di file (ad esempio, CTT20210620 per il codice di laboratorio e la data del test), quindi nel menu a discesa del tipo di piastra selezionare il tipo di piastra a 384 pozzetti e premere OK. Cerca una piastra vuota da visualizzare sulla destra dello schermo.
  4. Fare clic sull'opzione Analisi ; selezionare il test (ad esempio, FILE I.xlsx) dall'elenco a discesa.
  5. Per assegnare il test selezionato (ad esempio, FILE I.xlsx) a ciascuna posizione del punto campione sulla piastra, spostare il cursore su ciascuna posizione della piastra vuota, fare clic per evidenziare il pozzetto e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Aggiungi plex.
  6. Utilizzare un computer desktop o portatile per preparare un elenco di lavoro in formato .xlsx senza intestazione (ad esempio, 0620.xlsx della tabella 3) per tutti i campioni sul chip dal passaggio 2.7. Fare clic sul pulsante Aggiungi nuovo progetto di esempio ; selezionare il file (ad esempio, 0620.xlsx) dall'elenco a discesa per importare l'elenco di lavoro.
  7. Cerca tutti i codici campione di test nell'elenco di lavoro (ad esempio, da 0620.xlsx) a sinistra dello schermo. Fare clic sul codice di esempio nell'elenco di lavoro e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla posizione corrispondente della piastra per collegare i test a ciascuna posizione.

5. Funzionamento dello spettrometro di massa

  1. Utilizzare il programma applicativo per collegare lo spettrometro di massa (vedere la Tabella dei Materiali) al chip campione (dalla sezione 3) da analizzare.
  2. Fare clic sull'impostazione predefinita. Nella finestra di dialogo digitare un nome di file dal passaggio 4.3 (ad esempio, CTT20210620); nel Nome dell'esperimento, digitare l'ID del chip nel codice a barre del chip e salvare le impostazioni.
  3. Avviare il programma di controllo dello spettrometro di massa (vedere la Tabella dei materiali).
  4. Premere il pulsante In/Out dello spettrometro di massa e lasciare che il deck si estenda. Estrarre il supporto del chip e inserire il chip campione dal passaggio 3.4 nel supporto del chip. Posizionare il supporto del chip caricato sul ponte esteso e premere il pulsante In/Out affinché il chip campione entri nello strumento.
  5. Fare doppio clic sull'icona Acquisisci del programma applicativo. Nella finestra Acquisisci , fare clic sulla scheda Esecuzione automatica per avviare lo strumento e acquisire spettri di massa dai campioni sul chip.

6. Visualizzazione degli spettri di massa e analisi dei dati

  1. Eseguire il programma di analisi dei dati (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Sfogliare l'albero del database e selezionare l'ID del chip dal passaggio 5.2. Fare clic per evidenziare un bersaglio bene sul chip e fare clic sull'icona dello spettro per mostrare lo spettro di massa.
  3. Fare clic con il pulsante destro del mouse per scegliere Finestra di dialogo Personalizzazione per ritagliare un intervallo specifico di spettro in una nuova finestra. Fare clic sull'asse X per digitare i limiti superiore e inferiore di m/z e premere OK per visualizzare lo spettro di intervallo specificato, inclusi i segnali di interesse.
    NOTA: La quantità di DNA è proporzionale all'intensità di picco ad ogni unità di valore m/z.
  4. Misurare l'altezza di picco dei valori m/z dei segnali corrispondenti al substrato U, al prodotto AP e al modello. Fai clic sul picco e visualizza l'altezza del picco nell'angolo in alto a sinistra dello schermo.
    NOTA: uno spettro di 1.600 larghezza/1.200 unità è una dimensione ragionevole per l'ispezione sullo schermo di un computer e per la tenuta dei registri.
  5. Per salvare lo spettro per la registrazione, fare clic con il pulsante destro del mouse su Esporta e selezionare il tipo di file JPEG nell'elenco a discesa. Fare clic su Destinazione e Sfoglia disco per selezionare il dispositivo di archiviazione nell'elenco a discesa (ad esempio, disco flash E:). Digitare il nome del file (ad esempio, 0620_1-2.jpg) e fare clic su Esporta.
  6. Se necessario, stampare un file JPEG esportato e misurare manualmente l'altezza del picco utilizzando un righello.

Risultati

Modelli e substrati
Prendendo oligonucleotidi sintetici con U al centro (U + 9) accoppiato con un modello G come esempio (Figura 1A), un controllo vuoto di quantità equimolari di modello e substrato contenente uracile può essere utilizzato per il controllo di qualità della purezza degli oligonucleotidi sintetici (Figura 1B; i segnali corrispondono al m / z designato e al basso rumore di fondo). Per l'analisi dei dati MS, sono state misurat...

Discussione

Questo documento fornisce una procedura dettagliata per l'utilizzo di un metodo di analisi UDG MALDI-TOF MS per rilevare direttamente i prodotti a DNA contenenti AP. I principali vantaggi di questo metodo sono che i substrati contenenti uracile sono privi di etichette, scalabili, facili da lavorare e offrono una maggiore flessibilità nella progettazione del substrato.

L'estrazione di fenolo/cloroformio raccomandata dal fornitore UDG consente l'inattivazione dell'enzima per prevenire la degrad...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Ringraziamo l'NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) e l'NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan, R.O.C. [numero di sovvenzione MOST109-2314-B-002 -186 a K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 a S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 a W.-h.F.]. H.-L.C. ha ricevuto una borsa di dottorato dalla National Taiwan University. Finanziamento per la tassa di accesso aperto: Ministero della Scienza e della Tecnologia, R.O.C.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)J.T bakerProtocol 1,2
Autoclaved deionized waterMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
GlovesAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl)SIGMAProtocol 1,2
Ice bucketTaiwan.IncProtocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL)extra geneProtocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY NanodispenserAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
MicrocentrifugeKubotaProtocol 2
MicrocentrifugeClubioProtocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL)National scientific supply co, Inc.Protocol 2
Microcentrifuge tube rackTaiwan.IncProtocol 1,2
Micropipette  (P1000)GilsonProtocol 1,2
Micropipette  (P2)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P10)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P100)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P200)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Singapore)Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1)AAT Bioquest, Inc.Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA#01509Protocol 3, 5
TimerTaiwan.IncProtocol 2
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Uracil Glycosylase InhibitorNew England Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA GlycosylaseNew England Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601SHIMADZUProtocol 1
Water bathZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)Protocol 2

Riferimenti

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