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要約

ウラシル-DNAグリコシラーゼ活性をアッセイするための非標識、非放射性同位体法が、直接アプリン/アピリミジン部位含有生成物分析のためのMALDI-TOF質量分析法を用いて開発された。このアッセイは、DNAグリコシラーゼ測定に非常にシンプルで、特異的で、迅速で、使いやすいことが証明されました。

要約

ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)は、シトシンの加水分解脱アミノ化から形成されるウラシルの補正のための塩基切除修復経路における重要な成分である。したがって、ゲノムの完全性の維持には極めて重要です。UDG活性を測定するために、高度に特異的で非標識の非放射性同位体法が開発された。部位特異的ウラシルを含む合成DNA二重鎖をUDGにより切断し、次いでマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間質量分析(MALDI-TOF MS)分析を行った。鎖切断なしにDNA中の非熟菌/アピリミジン部位(AP)産物を保存するためのプロトコルが確立されました。基質から生成物までのm/z値の変化を用いて、UDGによるウラシル加水分解を評価した。UDG速度論的解析にG:U基板を用い、Km = 50 nM、Vmax = 0.98 nM/s、Kcat = 9.31 s-1を得た。ウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)アッセイへのこの方法の適用は、7.6pMのIC50値をもたらした。一本鎖および二本鎖DNA基質内の様々な位置でウラシルを用いたUDG特異性は、異なる切断効率を実証した。したがって、この単純で迅速で汎用性の高いMALDI−TOF MS法は、様々な単官能DNAグリコシラーゼの優れた参照法となり得る。また、DNAグリコシラーゼ阻害剤スクリーニングのツールとしての可能性も秘めています。

概要

ウラシルはRNAの正常な塩基であるが、ゲノムDNAにおいて一般的で変異原性の高い病変である。ウラシルは、デオキシシチジンの自発的/酵素的加水分解脱アミノ化から生じ得る。各生細胞において、この脱アミノ化は生理学的条件下で1日100〜500回起こる1,2。これらの変化が修復されない場合、DNA配列組成に変化があり、突然変異を引き起こす可能性がある。DNA中のウラシルは複製中にdATPと対合することを好むので、シトシンがウラシルに脱アミノ化する場合、2つの複製事象において、子孫DNAの半分に新しいG:CからA:Tへの移行変異が存在する3。

遺伝的安定性を維持するための細胞戦略の中で、塩基切除修復(BER)は、DNA4のウラシルなどの損傷した塩基を修復する重要なメカニズムである。BERは高度に進化的に保存されたプロセスです。2つの一般的なBER経路がある:単一ヌクレオチドの修復路に至る短いパッチ経路と、少なくとも2ヌクレオチドの修復経路を生成するロングパッチ経路5。BERは、いくつかのステップで発生する調整されたメカニズムです。BERの最初のステップは、損傷特異的DNAグリコシラーゼによる損傷ヌクレオチド塩基の酵素加水分解であり、アプリニン/アピリミジン(AP)中間部位を生成する6。これに続いて、エンドヌクレアーゼによるAP部位の糖リン酸骨格の切断、リアーゼによるDNA末端のクリーンアップ、DNAポリメラーゼによるギャップ充填、およびリガーゼによる最終ニックの封止が続きます5。

ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)は、大腸菌中のBERのウラシル含有DNAからウラシルを加水分解する。異なる分離技術を含む放射性標識DNAを用いた従来のUDGアッセイ6、7、8、9、10、11、12、13は、通常、時間がかかり、労働集約的であり、高価な標識試薬、複雑な手順、および放射性物質への曝露のリスクを低減するために集中的な訓練と実践を必要とする。蛍光測定オリゴヌクレオチドアッセイは、分子ビーコンおよびフェルスター共鳴エネルギー移動技術に加えて、放射性同位元素標識14の代替として開発されている15,16,17,18,19,20。しかしながら、前述の方法の全てに特定の標識が必要である。近年、ラベルフリーバイオセンサアッセイ21、22、23およびG−quadruplex24、25、26の形成に基づく比色法が開発されている。しかし、プローブ内の複数のA:Uペアまたは特別に設計された配列は、酵素単位の定義を複雑にします。

MALDI-TOF MS は、DNA 解析に非常に役立つ可能性のある技術です。開発されたアプリケーションには、一塩基多型ジェノタイピング27,28、改変ヌクレオチド解析29、DNA修復中間体同定30,31,32,33,34が含まれる。MALDI-TOF MS は、AP 部位含有 DNA 産物を検出するための DNA グリコシラーゼ分析に容易に採用する必要があります。しかし、DNA中のAP部位は、多くの実験条件下で鎖が切断されやすい33。ここでは、MALDI-TOF MS を使用して UDG アッセイを行い、大きなストランドブレークノイズなしで AP サイト生産を直接測定します。このラベルフリー法は、取り扱いが容易であり、DNAグリコシラーゼ阻害剤スクリーニングの医薬応用に高い可能性を秘めています。

プロトコル

1. 基板/テンプレートの準備

  1. ウラシル基板/テンプレート二重膜は、約50 ± 10%のバランスのとれたG + C含有量と、二重鎖領域の最低溶融温度50°Cで設計します。
    注:18 nt基板と19 ntテンプレート(表1および図1)の間の1つのヌクレオチド差は、MSシグナルの解釈と適切なアニーリングの改善に役立ちます。鋳型鎖は、A-UまたはG-Uミスマッチを生成するための相補的DNAとして機能するが(表1)、MS測定における参照シグナルとして使用することもできる。HPLC精製合成オリゴヌクレオチドの使用は、この研究にとって満足のいくものである。
  2. DNAを1 mM EDTAおよび10 mM Tris-HCl(25°CでpH 8.0)(TE)に100 μmol/Lの濃度でストックとして溶解し、-20 °Cで保存します。 この 20 μL ストックを TE で最終容量 800 μL (25 倍希釈して 4 μmol/L) に希釈します。DNA溶液の吸光度を紫外可視分光光度計でλ = 260nmで測定し、メーカーが割り当てた濃度を確認します。たとえば、U+9 の 4 μmol/L の場合は A260 = 0.204、T1 の 4 μmol/L の場合は A260 = 0.192 です(表 1)。
  3. オリゴヌクレオチド品質管理のためのMALDI-TOF MS 分析(セクション4~6)を実行し、指定されたm/z値で固有のピークシグナルを検査し、信号対雑音比が>100であることを確認します(図1Bおよび図1D)。

DNAグリコシラーゼアッセイ

  1. グリコシラーゼ反応にT1/U+9二重鎖のG:U基質(表1および図1A)を用い、例えば、1.5mL滅菌微量遠心管に、70μLのH2O、10μLの10x UDG反応緩衝液、5μLのT1ストック、および5μLのU+9ストックを加える(ステップ1.2)。
    メモ: 正しいタイプのマイクロピペットを選択し、メーカーの指示に従って必要な容量を取り扱います。たとえば、2 μL のピペットを使用して 0.1 ~ 2 μL の液体を分注し、10 μL のピペットを使用して 2 ~ 10 μL の液体を分注し、100 μL のピペットを使用して 20 ~ 100 μL の液体を分注し、結果の精度と精度を確保します。試薬混合物の記載された体積は、10アッセイ用である;所望の反応数のために体積を調整する。1x UDG 反応バッファーには、1 mM EDTA、1 mM ジチオスレイトール、および 20 mM トリス塩酸 (25 °C で pH 8.0) が含まれています。10x UDG反応緩衝液の供給源については 、材料表 を参照してください。
  2. チューブをしっかりと閉じます。65°Cで30分間、次いで37°Cで30分間、最後に氷上で3分間インキュベートして、基板/テンプレート二重鎖の適切なアニーリングを確実にする。
  3. 1.5 mL の滅菌微量遠心管に、氷冷した 1x UDG 反応バッファー 49 μL と UDG 1 μL (5,000 単位/mL; 材料表を参照) を加え、0.1 単位/μL に希釈します。1x UDG バッファーで、0.05、0.02、または 0.01 単位/μL の所望の酵素濃度まで段階希釈します。希釈した UDG は必ず氷上に保管してください。
    注: 10 μL の反応では、0.1 単位の UDG が T1/U+9 二重鎖から 30 pmol を超えるウラシルを 3 分で切断できます。
  4. 1.5 mL滅菌微量遠心チューブに、ステップ2.2から9.0 μLの基質混合物を加え、チューブを37°Cに予温する。 ステップ2.3から希釈したUDGを1.0 μL加える。タイマーを使用して反応を計り、チューブをフリックして内容物を混ぜます。
    注: 単位定義アッセイの場合、インキュベーション時間は 30 分です。動態アッセイの場合、0.5、1、2、3、5分のタイムコース分析を使用して初期速度を求めます。UGI阻害アッセイのために、反応を15分間時間処理する。
  5. 反応混合物を含むチューブを周囲温度で3,200 × g で3〜5秒間遠心分離する。その後、反応物を直ちに37°Cに移した。
  6. 反応停止
    1. 0.25 M HClおよび0.23 M Tris塩基の溶液を調製する。15 mL 試験管に、1 mM EDTA および 20 mM Tris-HCl (25 °C で pH 8.0) の溶液を 10 mL 加えて、1x UDG 反応バッファーを模倣します。1 mL の 0.25 M HCl で酸性にし、pH メーターで pH が 0.5 ~ 2 ±あることを確認します。1 mL の 0.23 M トリス塩基で中和し、pH メーターで最終 pH が 6.5 ± 0.5 であることを確認します。
      注: pHテストストリップを使用すると、試薬混合物のpHレベルをすばやく簡単に再確認できます。
    2. 1 μL の 0.25 M HCl を加えて 10 μL の反応混合物を酸性にし、酵素を失活させ、氷上に 6 分間置きます。1 μL の 0.23 M トリス塩基を加えて DNA 産物を中和し、酸への長時間の曝露による AP 部位の切断を回避します。13 μL TE を追加して、 マトリックスチップ 転送用の製品混合物の体積を増加させ、氷の上に置きます。
      注: AP プロダクトは化学的に不安定であり、2 日以内に MALDI-TOF MS によって分析されるべきです。1週間以上長期間保存した後、AP生成物のβ/δ除去反応により、鎖切断のかなりの部分の蓄積が起こる(図1D-G)。
  7. すべての25 μL UDG反応産物を微量遠心チューブから384ウェルマイクロタイタープレートに移す。
    注: バッファー中のナトリウムやカリウムなどの高濃度の陽イオンは、MALDI-TOF MS 分析で干渉を発生させるため、脱塩が必要です。 大腸菌 UDG反応バッファーは、非常に低濃度の陽イオンを含むため、脱塩は不要である。ただし、このプロトコールを変更して、前述のように脱塩を必要とする金属カチオンを含む他のDNAグリコシラーゼ反応を測定します35。

3. UDG反応生成物をマトリックスチップに転写する

  1. ナノリットルディスペンサーのドアを開き( 材料表を参照)、ステップ2.7から384ウェルマイクロタイタープレートをデッキのプレートホルダーにロードします。
  2. マトリックスチップアレイを対応するスカウトプレートの位置に挿入します。装填されたスカウトプレートをナノリットルディスペンサーの処理デッキに置き、ドアを閉じます。
  3. 転写画面の ラン ボタンをタッチし、装置が384ウェルマイクロタイタープレートからマトリックスチップへのサンプルの分配を開始するのを待ちます。
  4. 「ビジョン」(Vision) タブオプションを使用して、ディスペンス中のチップの画像と各スポットのディスペンスボリュームを表示します。チップ上の斑点のあるボリュームが5~10 nLの範囲であることを確認します。

4. 質量分析計のアッセイパラメータの設定

  1. アプリケーションプログラム( 材料表を参照)を使用して、インポートする予測信号m/z値を含む.xlsxファイルを準備します。
    注: FILE I.xlsx (表 2) の設定は、セクション 2 の G:U 基質の UDG アッセイの設定例です。
  2. アプリケーションプログラムを使用して、 デザイナーフォーマットでアッセイグループをインポート オプションを右クリックし、ドロップダウンリストから.xlsxファイル(ステップ4.1の FILE I.xlsx など)を選択して、新しいUDGアッセイを作成および定義します。
  3. 「顧客:プロジェクト:プレート」ボタンを右クリックし、ドロップダウンオプションツリーの上部をクリックして、新しいアッセイプレートを確立します。ダイアログボックスで、ファイル名(ラボコードとアッセイ日を表すCTT20210620など)を入力し、プレートタイプドロップダウンで384ウェルプレートタイプを選択してOKを押します。画面の右側に表示される空白のプレートを探します。
  4. 「アッセイ」オプションをクリックします。ドロップダウンリストからアッセイ(FILE I.xlsxなど)を選択します。
  5. 選択したアッセイ(FILE I.xlsxなど)をプレート上の各サンプルスポット位置に割り当てるには、ブランクプレートの各位置にカーソルを移動し、ウェルをクリックして強調表示し、右クリックしてAdd Plexを選択します。
  6. デスクトップまたはラップトップコンピュータを使用して、ステップ2.7のチップ上のすべてのサンプルについて、ヘッダーのない.xlsx形式(例:表3の0620.xlsx)の作業リストを準備します。「新規サンプルプロジェクトを追加」ボタンをクリックします。ドロップダウンリストからファイル(0620.xlsxなど)を選択して、作業リストをインポートします。
  7. 画面の左側にある作業リスト(0620.xlsxなど)ですべてのテストサンプルコードを探します。作業リストのサンプルコードをクリックし、プレートの対応する位置を右クリックして、テストを各位置にリンクします。

5. 質量分析計の動作

  1. アプリケーションプログラムを使用して、質量分析計( 材料表を参照)を分析対象のサンプルチップ(セクション3から)にリンクします。
  2. デフォルト設定をクリックします。ダイアログボックスで、手順4.3のファイル名を入力します(CTT20210620など)。[実験名] に、チップ バーコードにチップ ID を入力し、設定を保存します。
  3. 質量分析計制御プログラムを起動します( 材料表を参照)。
  4. 質量分析計の 入出力 ボタンを押し、デッキを伸ばします。チップホルダーを取り出し、ステップ3.4のサンプルチップをチップホルダーに挿入します。ロードされたチップホルダーを拡張デッキに置き、サンプルチップが装置に入るための入力/出力ボタンを押します。
  5. アプリケーション・プログラムの 「取得」 アイコンをダブルクリックします。 集録 ウィンドウで、 自動実行 タブをクリックして装置を起動し、チップ上のサンプルから質量スペクトルを取得します。

6. マススペクトルの表示とデータの分析

  1. データ分析プログラムを実行します ( 材料表を参照)。
  2. データベースツリーを参照し、ステップ5.2のチップIDを選択します。チップ上のターゲットウェルをクリックしてハイライトし、スペクトルアイコンをクリックしてマス スペクトル を表示します。
  3. 右クリックして 「カスタマイズダイアログ」 を選択すると、新しいウィンドウで特定の範囲のスペクトルがトリミングされます。 X軸 をクリックしてm/zの上限と下限を入力し、 OK を押して目的の信号を含む指定範囲スペクトルを表示します。
    注:DNAの量は、各m/z値単位におけるピーク強度に比例する。
  4. U基板、APプロダクト、およびテンプレートに対応する信号のm/z値のピーク高さを測定します。ピークをクリックし、画面の左上隅にピークの高さを表示します。
    メモ:1,600幅/1,200ユニットのスペクトルは、コンピュータ画面上の検査や記録管理に妥当な寸法です。
  5. 記録保持のためにスペクトルを保存するには、[ エクスポート ] を右クリックし、ドロップダウン リストで [ JPEG ファイル の種類] を選択します。 [保存先 ]をクリックし、[ディスクの 参照] をクリックして、ドロップダウンリストで ストレージデバイス (フラッシュディスクE:など)を選択します。 ファイル名 (0620_1-2.jpg など) を入力し、[ エクスポート] をクリックします。
  6. 必要に応じて、書き出したJPEGファイルを印刷し、ルーラーを使用してピークの高さを手動で測定します。

結果

テンプレートと基板
中央にU(U+9)をGテンプレートと対にした合成オリゴヌクレオチドを例にとると(図1A)、等モル量のテンプレートとウラシル含有基質のブランク制御を合成オリゴヌクレオチド純度の品質管理に使用できます(図1B;シグナルは指定されたm/zと一致し、低バックグラウンドノイズ)。MSデータ解析のために、ピーク高さを?...

ディスカッション

このホワイトペーパーでは、UDG MALDI−TOF MSアッセイ法を使用してAP含有DNA産物を直接検出するための詳細な手順を提供する。この方法の主な利点は、ウラシル含有基質がラベルフリーで、スケーラブルで、取り扱いが容易で、基質設計においてより大きな柔軟性を有することである。

UDGサプライヤーが推奨するフェノール/クロロホルム抽出は、酵素の不活性化を可能に?...

開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

我々は、NCFPB機能ゲノミクス統合コアファシリティ(台湾・台北)及びNRPBファーマコゲノミクス・ラボ(台湾・台北)の技術支援に感謝する。この研究は、台湾科学技術部(R.O..C.の支援を受けた[助成金番号MOST109-2314-B-002-186からK.-Y.S.、ほとんどが107-2320-B-002-016-MY3からS.Y..C、MOST 110-2320-B-002-043からW.-h.F.へ]。H.-L.C.は国立台湾大学から博士研究員を授与されています。オープンアクセス料金のための資金:科学技術省、R.O..C。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)J.T bakerProtocol 1,2
Autoclaved deionized waterMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
GlovesAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl)SIGMAProtocol 1,2
Ice bucketTaiwan.IncProtocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL)extra geneProtocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY NanodispenserAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
MicrocentrifugeKubotaProtocol 2
MicrocentrifugeClubioProtocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL)National scientific supply co, Inc.Protocol 2
Microcentrifuge tube rackTaiwan.IncProtocol 1,2
Micropipette  (P1000)GilsonProtocol 1,2
Micropipette  (P2)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P10)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P100)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P200)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Singapore)Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1)AAT Bioquest, Inc.Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA#01509Protocol 3, 5
TimerTaiwan.IncProtocol 2
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Uracil Glycosylase InhibitorNew England Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA GlycosylaseNew England Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601SHIMADZUProtocol 1
Water bathZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)Protocol 2

参考文献

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