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摘要

使用MALDI-TOF质谱法开发了一种非标记，非放射性同位素方法来测定尿嘧啶-DNA糖基化酶活性，用于直接分析含阳离子/嘧啶位点的产品。该测定被证明是非常简单，特异性，快速且易于使用的DNA糖基化酶测量。

摘要

尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是碱基切除修复途径中的关键成分，用于校正由胞嘧啶水解脱氨形成的尿嘧啶。因此，它对于基因组完整性的维持至关重要。开发了一种高度特异性，无标记，非放射性同位素的方法来测量UDG活性。UDG切割含有位点特异性尿嘧啶的合成DNA双链体，然后进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。建立了一种方案来保存DNA中的apurinic/apyrimidinic位点（AP）产物而不会断裂。利用底物到产物的m/z值变化来评价UGG对尿嘧啶的水解作用。使用G:U底板进行UDG动力学分析，得到Km = 50 nM，Vmax = 0.98 nM /s，Kcat = 9.31 s-1。将该方法应用于尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）测定，IC50值为7.6 pM。在单链和双链DNA底物中不同位置使用尿嘧啶的UDG特异性显示出不同的切割效率。因此，这种简单，快速和多功能的MALDI-TOF MS方法可以成为各种单功能DNA糖基化酶的极好参考方法。它还具有作为DNA糖基化酶抑制剂筛选工具的潜力。

引言

虽然尿嘧啶是RNA中的正常碱基，但它是基因组DNA中常见且高度致突变的病变。尿嘧啶可由脱氧胞苷的自发/酶解脱氨引起。在每个活细胞中，这种脱氨在生理条件下每天发生100-500次1，2。如果这些改变没有得到修复，DNA序列组成可能会发生变化，从而导致突变。由于DNA中的尿嘧啶在复制过程中更喜欢与dATP配对，如果胞嘧啶脱氨为尿嘧啶，在两个复制事件中，在一半的后代DNA3中将出现新的G:C到A:T过渡突变。

在维持遗传稳定性的细胞策略中，碱基切除修复（BER）是修复DNA4中受损碱基（如尿嘧啶）的重要机制。BER是一个高度进化保守的过程。有两种常见的 BER 通路:短贴片通路，通向单个核苷酸的修复束，以及产生至少两个核苷酸修复束的长贴片通路5。BER 是一种协调机制，分几个步骤进行。BER的第一步是通过损伤特异性DNA糖基酶水解受损的核苷酸碱基，以产生阳极/嘧啶（AP）中间位点6。随后，通过核酸内切酶在AP位点切割糖磷酸主链，通过裂解酶清除DNA末端，通过DNA聚合酶填充间隙，并通过连接酶密封最终的缺口5。

尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）从含有尿嘧啶的DNA中水解尿嘧啶，用于大肠杆菌中的BER。使用放射性标记DNA的传统UDG测定涉及不同的分离技术6，7，8，9，10，11，12，13通常耗时，劳动密集型，标记试剂昂贵，程序复杂，并且需要强化培训和实践以降低暴露于放射性物质的风险。除了分子信标和Förster共振能量转移技术15，16，17，18，19，20之外，荧光定量寡核苷酸测定已被开发出来作为放射性同位素标记的替代品14。但是，上述所有方法都需要特定的标签。最近开发了无标记生物传感器测定法21，22，23和基于G-四链体24，25，26形成的比色方法。然而，探针中的多个A:U对或专门设计的序列使酶单元定义复杂化。

MALDI-TOF MS是一种在DNA分析中可能非常有用的技术。开发的应用包括单核苷酸多态性基因分型27，28，修饰核苷酸分析29和DNA修复中间体鉴定30，31，32，33，34。应易于用于DNA糖基化酶分析的MALDI-TOF MS，以检测含AP位点的DNA产物。然而，在许多实验条件下，DNA中的AP位点容易断裂33。这里介绍了一种UDG测定，使用MALDI-TOF MS直接测量AP位点的产生，没有明显的断链噪声。这种无标记方法易于使用，并且在DNA糖基化酶抑制剂筛选的药物应用中具有很高的潜力。

研究方案

1. 基材/模板准备

  1. 双相区域设计 G+C 含量平衡至 50 ± 10% 且最低熔化温度为 50 °C 的 uracil 基板/模板双相。
    注:18 nt底物和19 nt模板之间的一个核苷酸差异（表1 和 图1）有助于更好的MS信号解释和适当的退火。模板链可作为互补DNA以产生A-U或G-U不匹配（表1），但也可以用作MS测量中的参考信号。HPLC纯化的合成寡核苷酸的使用对本研究是令人满意的。
  2. 将DNA溶解在100μmol/L浓度的1mM EDTA和10mM Tris-HCl（25°C时pH 8.0）（TE）中作为储备，并储存在-20°C。 用TE稀释20μL储备液至800μL的最终体积（稀释25倍至4μmol/ L）。在紫外可见分光光度计中以λ = 260nm测量DNA溶液的吸光度，以确保制造商的指定浓度。例如:对于U + 9的4μmol / L，A260 = 0.204，对于4μmol/ L的T1，A260 = 0.192（表1）。
  3. 通过在指定的m/ z值下检测独特的峰值信号以及检查信噪比是否为>100，对寡核苷酸质量控制进行MALDI-TOF MS分析（第4-6节）（图1B 和 图1D）。

2. DNA糖基化酶测定

  1. 例如，在1.5mL无菌微量离心管中使用T1 / U + 9双链G:U底物（表1和图1A）进行糖基化酶反应，加入70μLH 2O，10μL1x UDG反应缓冲液，5μLT1储备液和5μLU + 9储备液（步骤1.2）。
    注:选择正确类型的微量移液器，并按照制造商的说明处理所需的体积。例如，使用2 μL移液器分配0.1-2μL液体，使用10μL移液器分配2-10μL液体，使用100μL移液器分配20-100μL液体，以确保结果的准确性和精确性。所述试剂混合物的体积为10次测定;调整所需反应次数的体积。1x UDG反应缓冲液含有1mM EDTA，1mM二硫磷脂醇和20mM Tris-HCl（25°C时pH 8.0）。参见 材料表 ，了解10x UDG反应缓冲液的来源。
  2. 牢固地关闭管子;在65°C下在水浴中孵育30分钟，然后在37°C下孵育30分钟，最后在冰上孵育3分钟，以确保基板/模板双相正确退火。
  3. 在1.5mL无菌微量离心管中，加入49μL冰冷的1x UDG反应缓冲液和1μLUDG（5，000单位/ mL;参见 材料表），稀释至0.1单位/ μL。用1x UDG缓冲液连续稀释至所需的酶浓度为0.05，0.02或0.01单位/ μL。始终将稀释的UDG保持在冰上。
    注意:在10μL反应中，0.1单位的UDG可以在3分钟内从T1 / U + 9双链中切割出超过30 pmol的尿嘧啶。
  4. 在1.5mL无菌微量离心管中，从步骤2.2加入9.0μL底物混合物，并将管预热至37°C。 从步骤2.3中加入1.0μL稀释的UDG。使用计时器对反应进行计时，然后轻拂试管以混合内容物。
    注意:对于单位定义测定，孵育时间为30分钟。对于动力学测定，使用0.5，1，2，3，5分钟的时间过程分析来获得初始速率。对于UGI抑制测定，将反应时间定时15分钟。
  5. 在环境温度下，将管与反应混合物在3，200×g下离心3-5 秒 。然后，立即将反应转移到37°C。
  6. 反应终止
    1. 制备0.25 M HCl和0.23 M Tris基的溶液。在15 mL试管中，加入10 mL 1 mM EDTA和20 mM Tris-HCl溶液（25°C时pH 8.0）以模拟1x UDG反应缓冲液。用1 mL 0.25 M HCl酸化，并用pH计检查以确保pH值约为2±0.5。用 1 mL 的 0.23 M Tris 碱基中和，并用 pH 计检查最终 pH 值是否为 6.5 ± 0.5。
      注意:使用pH试纸是重新确认试剂混合物的pH值的快速简便方法。
    2. 加入1μL0.25M HCl酸化10μL反应混合物以灭活酶并将其置于冰上6分钟。加入1μL0.23M Tris碱以中和DNA产物，以避免AP位点因长时间暴露于酸而破裂。加入13μL TE以增加用于 基质芯片 转移的产物混合物的体积，然后将其放在冰上。
      注:AP产物化学性质不稳定，应在2天内通过MALDI-TOF MS进行分析。在长时间储存超过一周后，由于AP产物的β/δ消除反应，发生了大部分断裂的积累（图1D-G）。
  7. 将所有25μL UDG反应产物从微量离心管转移到384孔微量滴定板中。
    注意:高浓度的阳离子，如缓冲液中的钠或钾，会在MALDI-TOF MS分析中产生干扰，因此需要脱盐。由于 大肠杆菌 UDG反应缓冲液含有非常低浓度的阳离子，因此不需要脱盐。然而，修改该协议以测量含有需要脱盐的金属阳离子的其他DNA糖基化酶反应，如前所述35。

3. 将UDG反应产物转移到基质芯片上

  1. 打开纳升分配器的门（见 材料表），将步骤2.7中的384孔微量滴定板加载到甲板的板架上。
  2. 将矩阵芯片阵列插入相应的侦察板位置。将装载的侦察板放在纳升分配器的处理甲板上，然后关闭门。
  3. 触摸转印屏幕上的 运行 按钮，然后等待仪器开始将样品从384孔微量滴定板分配到基质芯片。
  4. 使用 "视觉"选项卡 选项可显示点胶过程中每个光斑的芯片图像和点胶量。确保芯片上的斑点体积在5-10 nL范围内。

4. 在质谱仪上设置测定参数

  1. 使用应用程序（参见 材料表）准备一个.xlsx文件，其中包含用于导入的预测信号m/ z值。
    注: FILE I.xlsx （表2）中的设置是第2节中G:U底物的UDG测定的示例设置。
  2. 使用应用程序创建和定义新的UDG测定，方法是右键单击" 以设计器格式导入测定组 "选项，然后从下拉列表中选择.xlsx文件（例如，步骤4.1 中的FILE I.xlsx ）。
  3. 右键单击 "客户:项目:板 "按钮，然后单击下拉 选项 树的顶部以建立新的检测板。在对话框中，键入文件名（例如， CTT20210620 表示实验室代码和测定日期），然后在 板类型 下拉列表中，选择 384 孔板 类型并按 OK。查找屏幕右侧显示的空白板。
  4. 点击 分析 选项;从下拉列表中选择 检测方法 （例如， FILE I.xlsx）。
  5. 要将所选测定（例如， FILE I.xlsx）分配给板上的每个样品点位置，请将光标移动到空白板的每个位置，单击以突出显示孔，然后单击以选择 添加Plex。
  6. 使用台式机或笔记本电脑为步骤2.7中芯片上的所有样品准备.xlsx格式的工作清单，没有标题（例如，表3的0620.xlsx）。点击 添加新的示例项目 按钮;从下拉列表中选择文件（例如，0620.xlsx）以导入工作列表。
  7. 在屏幕左侧的工作列表中查找所有测试示例代码（例如，从 0620.xlsx）。单击工作列表中 的示例代码 ，然后右键单击板的相应位置以将测试链接到每个位置。

5. 质谱仪操作

  1. 使用应用程序将质谱仪（见 材料表）链接到要分析的样品芯片（从第3部分开始）。
  2. 单击 默认设置。在对话框中，键入步骤 4.3 中的文件名（例如， CTT20210620）;在 "实验名称"中，键入" 芯片条形码"中的芯片 ID，然后保存设置。
  3. 启动质谱仪控制程序（见 材料表）。
  4. 按下质谱仪的 "入/出 "按钮，让甲板伸展。取出芯片支架并将步骤3.4中的样品芯片插入芯片支架。将装载的芯片支架放在扩展的甲板上，然后按下进/出按钮，使样品芯片进入仪器。
  5. 双击应用程序的 "获取" 图标。在 "采集 "窗口中，单击 "自动运行 "选项卡以启动仪器并从芯片上的样品中获取质谱。

6. 查看质谱并分析数据

  1. 运行数据分析程序（请参见 材料表）。
  2. 浏览数据库树，从步骤 5.2 中选择芯片 ID。单击以突出显示芯片上的目标孔，然后单击 光谱 图标以显示质谱。
  3. 右键单击以选择 "自定义对话框" 以在新窗口中裁剪特定范围的频谱。单击 X 轴 以键入 m/z 的上限和下限，然后按 OK 显示指定的范围频谱，包括感兴趣的信号。
    注意:DNA的量与每个m / z值单位的峰值强度成正比。
  4. 测量对应于U基板，AP积和模板的信号的m / z值的峰值高度。单击峰值，并在屏幕左上角查看峰值高度。
    注:1，600宽度/1，200单位的光谱是计算机屏幕上检查和记录保存的合理尺寸。
  5. 要保存频谱以进行记录保存，请右键单击 导出 ，然后在下拉列表中选择 JPEG文件类型 。单击" 目标 "和" 浏览光盘 "以在下拉列表中选择 存储设备 （例如，闪存光盘 E:）。键入 文件名 （例如，0620_1-2.jpg），然后单击 导出。
  6. 如果需要，请打印导出的 JPEG 文件，并使用标尺手动测量峰高。

结果

模板和基材
以以U为中心（U+9）的合成寡核苷酸与G模板配对为例（图1A），对模板和含尿嘧啶的底物的等摩尔量的空白控制可用于合成寡核苷酸纯度的质量控制（图1B;信号与指定的m/ z和低背景噪声相匹配）。对于MS数据分析，测量了峰高（图2）。预计19 nt模板DNA在糖基化酶水解后保持不变;因此，该信号可以作为AP产...

讨论

本文提供了使用UDG MALDI-TOF MS测定方法直接检测含AP的DNA产物的详细程序。该方法的主要优点是含尿嘧啶的底物无需标记，可扩展，易于使用，并在基底设计中提供更大的灵活性。

UDG供应商推荐的苯酚/氯仿提取能够使酶失活，以防止产品DNA降解。然而，苯酚提取方案涉及危险化学品的繁琐相分离。另一种酸终止方法使用HCl将反应pH降低到2±0.5也有效地灭活了UDG。随后用Tris碱基?...

披露声明

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢NCFPB功能基因组学综合核心设施（台湾台北）和NRPB药物基因组学实验室（台湾台北）的技术支持。这项工作得到了台湾科学技术部的支持，R.O.C[批准号MOST109-2314-B-002 -186至K.-Y.S.，MOST 107-2320-B-002-016-MY3至S.-Y.C，MOST 110-2320-B-002-043至W.-h.F.]。H.-L.C.是国立台湾大学博士奖学金的获得者。开放获取收费资金:科学技术部，R.O.C。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)J.T bakerProtocol 1,2
Autoclaved deionized waterMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
GlovesAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl)SIGMAProtocol 1,2
Ice bucketTaiwan.IncProtocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL)extra geneProtocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY NanodispenserAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
MicrocentrifugeKubotaProtocol 2
MicrocentrifugeClubioProtocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL)National scientific supply co, Inc.Protocol 2
Microcentrifuge tube rackTaiwan.IncProtocol 1,2
Micropipette  (P1000)GilsonProtocol 1,2
Micropipette  (P2)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P10)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P100)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P200)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Singapore)Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1)AAT Bioquest, Inc.Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA#01509Protocol 3, 5
TimerTaiwan.IncProtocol 2
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Uracil Glycosylase InhibitorNew England Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA GlycosylaseNew England Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601SHIMADZUProtocol 1
Water bathZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)Protocol 2

参考文献

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