JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم استخدام ذباب ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر البالغة على نطاق واسع ككائنات حية نموذجية للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاستجابات المناعية الفطرية المضادة للميكروبات المضيفة واستراتيجيات العدوى الميكروبية. لتعزيز مرحلة يرقة D. melanogaster كنظام نموذج إضافي أو بديل ، يتم وصف تقنية حقن اليرقات.

Abstract

يوفر استخدام النماذج غير التقليدية لدراسة المناعة الفطرية وضراوة مسببات الأمراض بديلا قيما لنماذج الثدييات ، والتي يمكن أن تكون مكلفة وتثير قضايا أخلاقية. النماذج غير التقليدية رخيصة الثمن ، وسهلة التعامل معها وثقافتها ، ولا تأخذ مساحة كبيرة. فهي قابلة للتعديل وراثيا وتمتلك تسلسلات جينوم كاملة ، ولا يمثل استخدامها أي اعتبارات أخلاقية. على سبيل المثال ، قدمت ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر رؤى رائعة في مجموعة متنوعة من أبحاث السلوك والتنمية والتمثيل الغذائي والمناعة. وبشكل أكثر تحديدا ، تمتلك الذباب واليرقات البالغة D. melanogaster العديد من ردود الفعل الدفاعية الفطرية التي يتم مشاركتها مع الحيوانات الفقارية. تم الكشف عن الآليات التي تنظم الاستجابات المناعية في الغالب من خلال الدراسات الجينية والجزيئية في نموذج D. melanogaster. هنا يتم توفير تقنية جديدة لحقن اليرقات ، والتي ستعزز التحقيقات في العمليات المناعية الفطرية في يرقات D. melanogaster واستكشاف التسبب في مجموعة واسعة من الالتهابات الميكروبية.

Introduction

تم استخدام ذبابة الفاكهة بشكل كبير في البحوث البيولوجية والطبية الحيوية لعدة عقود ، حيث تطورت المجموعة المتطورة من الأدوات الوراثية والجزيئية بشكل مطرد لتحليل مجموعة واسعة من الدراسات 1،2،3،4. جعلت جوانب التنمية والتوازن والمناعة الفطرية المحفوظة تطوريا في D. melanogaster من كائن حي نموذجي قيم لدراسة مختلف الأمراض البشرية والحشرية5,6. ومن الجدير بالذكر أن الدور الأساسي لنموذج D. melanogaster لدراسة المناعة قد تجسد إلى حد كبير في دراسات الذباب البالغ. ومع ذلك ، ساهمت دراسات يرقات D. melanogaster أيضا في المعرفة الحالية واستكشفت بشكل رئيسي الاستجابات المناعية الخلوية ، وتحديدا لعدوى والديدان الخيطية التي تحدث من خلال بشرة الحشرات7،8،9،10. تمتلك يرقات ذبابة الفاكهة ثلاثة أنواع مختلفة من خلايا الدم ، تسمى مجتمعة خلايا الدم: خلايا البلازما ، والخلايا البلورية ، والخلايا الصفائحية 11،12،13. يمكن لهذه الخلايا تركيب مجموعة من الاستجابات المناعية عندما تصاب يرقات D. melanogaster بمسببات الأمراض مثل البكتيريا والفطريات والفيروسات والطفيليات14،15،16. تشمل الاستجابات المناعية الخلوية الابتلاع المباشر (البلعمة) للجزيئات الصغيرة أو البكتيريا ، والميلانين ، وتغليف مسببات الأمراض الأكبر مثل البيض الطفيلي ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وسينثاز أكسيد النيتريك (NOS) 17،18،19.

في المقابل ، تم نشر عدد أقل من الدراسات حول استخدام نموذج يرقات D. melanogaster لتحليل الاستجابات المناعية الخلطية. ويرجع ذلك أساسا إلى تطبيق مقايسات التغذية للعدوى الفموية ليرقات D. melanogaster والعديد من التحديات المرتبطة باليرقات المجهرية بما في ذلك المعالجة الدقيقة لليرقات والاستخدام السليم للإبرة الدقيقة ، خاصة أثناء الاختراق20,21. وبالتالي، فإن المعرفة المحدودة بعدوى اليرقات والصعوبات التقنية (أي ارتفاع معدل الوفيات) جعلت من الصعب استخدام نموذج يرقات D. melanogaster. سيكون لنموذج اليرقات القدرة على تحديد آليات جزيئية جديدة من شأنها أن توفر المزيد من الأفكار حول التفاعلات بين المضيف والممرض وتحريض استجابات مناعية فطرية محددة للمضيف ضد العدوى المسببة للأمراض.

هنا يتم وصف بروتوكول بسيط وفعال يمكن استخدامه لحقن يرقات D. melanogaster مع مسببات الأمراض المختلفة ، مثل البكتيريا ، بالتفصيل. على وجه الخصوص ، تستخدم يرقات D. melanogaster للحقن مع مسببات الأمراض البشرية Photorhabdus asymbiotica والبكتيريا غير المسببة للأمراض Escherichia coli. يمكن استخدام هذه الطريقة للتلاعب وتحليل الاستجابات المناعية ل D. melanogaster لمختلف الالتهابات الميكروبية.

Protocol

1. تربية الذباب

ملاحظة: تنقسم دورة حياة D. melanogaster إلى أربع مراحل: الجنين واليرقة والخادرة والبالغين. وقت التوليد مع ظروف التربية المثلى في المختبر (~ 25 درجة مئوية ، رطوبة 60٪ ، وطعام كاف) هو حوالي 10 أيام من البويضة المخصبة إلى البالغين المغلقين. تضع الإناث حوالي 100 جنين يوميا ، ويستمر تكوين الأجنة حوالي 24 h22. تخضع اليرقات لثلاث مراحل تنموية (instars; L1-L3) في ~ 4 أيام (L1 و L2: 24 ساعة ، و L3: 48 ساعة). تبدأ يرقات instar الأولى في التغذية على الفور على سطح الوسط. تحفر يرقات instar الثانية في الوسط ، في حين أن يرقات instar الثالثة تترك الوسط وتتجول في جدران القارورة ، وتبحث عن مكان للتكاثر لمدة 24-48 ساعة.

  1. أضف الطعام الجاف الذي يحتوي على نظام غذائي قائم على دقيق الذرة وفول الصويا إلى قارورة البوليسترين الضيقة (25 مم × 95 مم) إلى حجم aboue 1/5 إلى 2/5. ثم أضف 9 مل من الماء واترك القارورة تجلس لمدة 1 دقيقة حتى يصبح النظام الغذائي رطبا تماما.
  2. أضف حوالي 10 حبيبات من خميرة الخباز الجاف إلى القارورة وضع خليط من 20 على الأقل من ذباب البالغين الذكور والإناث الذين ظهروا حديثا.
  3. احتضان القارورة عند 25 درجة مئوية على ضوء 12:12-h: دورة دورية ضوئية مظلمة.
  4. لضمان تقدم دورة الحياة ، تحقق من قوارير الذبابة يوميا وسجل مراحل التطوير الأولية.

2. اختيار اليرقات للعدوى

  1. اختر اليرقات باستخدام فرشاة طلاء دقيقة (شعر الجمل هو الأفضل) بمجرد وصولها إلى مرحلة instar الثالثة المتجولة في اليوم الذي سيتم فيه تنفيذ العدوى (الشكل 1).
  2. اغسل اليرقات المحددة بمحلول رينجر (100 ملليمتر كلوريد الصوديوم، 1.8 ملليمتر KCl، 2 ملليمتر CaCl2، 1 ملم MgCl2، 5 ملليمتر HEPES الرقم الهيدروجيني 6.9) في طبق بتري صغير (60 مم × 15 مم) عند إزالته من قارورته الأصلية23.
  3. ضع اليرقات على ورق ترشيح (قطره 150 مم) مبلل قليلا بحوالي 5 مل من محلول رينجر في طبق بتري (100 مم × 15 مم) (الشكل 2A).
  4. أضف ~ 1 مل من محلول رينجر يوميا إلى ورق الترشيح حسب الحاجة لتجنب الجفاف والجفاف اليرقات.

3. التحضير البكتيري

  1. بكتيريا P. asymbiotica على وسائط أجار لوريا بيرتاني (LB) عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. استخدم خزانة من المستوى 2 للسلامة الأحيائية لنقل مستعمرة واحدة من P. asymbiotica لتلقيح ثقافة سائلة في 10 مل من وسائط LB.
  3. احتضن ثقافة سائل P. asymbiotica بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية في شاكر دوار مضبوط على 220 دورة في الدقيقة.
  4. استزراع بكتيريا الإشريكية القولونية بطريقة مماثلة ، ولكن قم بإجراء النمو الأولي على وسائط الأجار وحضانة الثقافة السائلة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. جهاز طرد مركزي كل مزرعة بكتيرية بين عشية وضحاها لمدة 3 دقائق عند 13000 × جم و 4 درجات مئوية.
  6. تخلص من السوبرناتانت واغسل الكريات البكتيرية الناتجة ثلاث مرات ب 10 مل من PBS المعقمة.
  7. قم بالطرد المركزي للكريات مرة أخرى لمدة 3 دقائق عند 13000 × جم و 4 درجات مئوية.
  8. قم بتخفيف كل حبيبة باستخدام PBS معقمة لضبط تركيزات البكتيريا على الكثافة البصرية (600 نانومتر) من 0.25 ل P. asymbiotica و 0.015 ل E. coli ، والتي تتوافق مع 100-300 وحدة تشكيل مستعمرة لكل يرقة من كل مستحضر بكتيري ، باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

4. إعداد حاقن

  1. قم بإعداد الشعيرات الدموية باستخدام أنابيب شعرية زجاجية مقاس 3.5 بوصة ومجتذب ماصة دقيقة. اضبط الأداة على النحو التالي: الحرارة: 580 ؛ سحب: 143 ؛ السرعة: 25 ؛ التأخير: 1 ؛ الضغط: 500.
  2. استخدم ملقط مستقيم متوسط النقطة لفتح الشعيرات الدموية الزجاجية إلى الدرجة التي تسمح بتوصيل العلاجات التجريبية مع التسبب في الحد الأدنى من الضرر لليرقات (الشكل 2B). لتحسين هذا الإجراء أثناء ممارسة الحقن ، استخدم محلول Trypan Blue (قم بتخفيف المخزون بنسبة 0.4٪ باستخدام PBS إلى 0.2٪) لتتبع التسرب بسهولة أثناء الحقن وبقاء اليرقات الزرقاء.
  3. املأ الشعيرات الدموية بالزيوت المعدنية باستخدام حقنة بلاستيكية سعة 20 مل يمكن التخلص منها بإبرة تحت الجلد (22 جم ، طول 25 مم).
  4. قم بإعداد حاقن النانولتر وإخراج الزيت من الشعيرات الدموية (الشكل 2C).
  5. املأ الشعيرات الدموية بالتحضير البكتيري المطلوب للحقن. خذ الحل من قطرة (~ 20 ميكرولتر) يتم وضعها على parafilm. في هذا البروتوكول ، تم حقن 50.2 نانولتر من اثنين من الأسهم البكتيرية.

5. حقن اليرقات

  1. تخدير يرقات D. melanogaster باستخدام ثاني أكسيد الكربون لمدة 2 دقيقة تقريبا قبل الإجراء.
  2. انقل اليرقات المخدرة بلطف إلى ورقة ترشيح مبللة في محلول رينجر استعدادا للحقن تحت المجهر المجسم. ستكون اليرقات خاملة أو سلبية في هذه المرحلة.
  3. لحقن اليرقات ، قم بتطبيق ضغط قوي على الجانب الظهري من النهاية الخلفية (تظهر اللولبيات القصبية في الطرف الخلفي مقابل أجزاء الفم السوداء في الطرف الأمامي) باستخدام ملقط (الشكل 2D).
  4. أدخل الإبرة أفقيا نحو الطرف الخلفي من اليرقات ، بالقرب من البشرة. لن يؤدي الحقن الناجح إلى تسرب المحلول المحقون من اليرقات (الشكل 3).
  5. قم بإزالة الملقط الذي تم استخدامه للضغط على ذيل اليرقات قبل سحب الإبرة. إذا لم تتم إزالتها أولا ، يمكن أن يجبر الملقط الهيموليمفاوي و / أو الأمعاء على الخروج من اليرقات من موقع الجرح.
  6. إصابة العدد المناسب من اليرقات للدراسة التي يتم إجراؤها. في هذا البروتوكول بالذات ، تم حقن 20 يرقات لكل حالة تجريبية.
  7. باستخدام الملقط ، انقل اليرقات المحقونة برفق إلى ورقة ترشيح رطبة منفصلة في طبق بتري (10 يرقات لكل طبق) أو قارورة طعام (حسب الغرض من التجربة) للسماح بالتعافي.
  8. ضع أطباق بتري أو قوارير الطعام في حاضنة على درجة حرارة 25 درجة مئوية. إذا تم الاحتفاظ باليرقات في طبق بتري ، أضف محلول رينجر حسب الضرورة لمنع الجفاف.

6. تسجيل البقاء على قيد الحياة / الوفيات

  1. سجل عدد يرقات D. melanogaster الميتة والحية وفقا للنقاط الزمنية التجريبية المحددة. ستستمر اليرقات الحية في التطور إلى شرانق وبالغين.
  2. استخدم البرامج الإحصائية ، مثل Prism ، لإدخال بيانات البقاء على قيد الحياة / الوفيات الخام ، وتحليلها باستخدام اختبار السجل (Mantel-Cox) ، وتمثيل النتائج بالأرقام.

النتائج

عندما يتم تنفيذها بشكل صحيح ، تظهر حقن يرقات D. melanogaster تأثيرا خاصا بالبكتيريا. تم جمع بيانات البقاء على قيد الحياة في عدة نقاط زمنية بعد الإصابة ب P. asymbiotica (سلالة ATCC43943) ، E. coli (سلالة K12) ، و PBS (الشكل 4). في حين أن يرقات D. melanogaster عرضة ل P. asymbiotica ، مما يعرض الب...

Discussion

تعد ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر من بين النماذج الأكثر قيمة والتي تم التلاعب بها تجريبيا والمستخدمة في التحقيقات في المناعة الفطرية والتسبب في العدوى الميكروبية المختلفة. ويرجع ذلك إلى دورة حياتها البسيطة والسريعة ، والصيانة البسيطة في المختبر ، وعلم الوراثة التطوري الراسخ ، وصندو?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر أعضاء قسم العلوم البيولوجية في جامعة جورج واشنطن (GWU) على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم GT من خلال زمالة Harlan الصيفية من GWU. تم إجراء جميع الأشكال الرسومية باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fly Food B (Bloomington Recipe)LabExpress7001-NVFood B, in narrow vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully StackableVWR25384-342Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully StackableVWR25384-092Diameter 60 x 15 mm
Glass capillariesVWR53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circleVWR28450-150Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety CabinetESCOLA2-4A2-E
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB agar miller powder 500 g
LB BrothFisher ScientificBP1426-500LB broth miller powder 500 g
Mineral oilAlfa Aesar, Thermo Fisher Scientific31911-A1
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter InjectorDrummond3-000-207
Narrow Drosophila Vials, PolystyreneGenesee Scientific32-109
Needles, hypodermicVWR89219-31622 G, 25 mm
Next Generation Micropipette PullerWorld Precision InstrumentsSU-P1000
PBSVWR97062-732Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
PrismGraphPadVersion 8
Syringes - plastic, disposableVWR76124-65220 mL
Trypan BlueSigma-AldrichT8154

References

  1. Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
  2. Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
  3. Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
  4. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
  5. Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
  6. Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
  7. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  8. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  9. Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
  10. Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
  11. Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
  12. Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
  13. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
  14. Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
  15. Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
  16. Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
  17. Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
  18. Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
  19. Honti, V., Csordás, G., Kurucz, &. #. 2. 0. 1. ;., Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
  20. Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
  21. Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
  22. Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
  23. Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
  24. Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
  25. Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
  26. Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
  27. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved