Drosophila melanogaster Protocole d’injection de larves

Résumé

Les mouches adultes Drosophila melanogaster ont été largement utilisées comme organismes modèles pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux réponses immunitaires innées antimicrobiennes de l’hôte et les stratégies d’infection microbienne. Pour promouvoir le stade larvaire de D. melanogaster en tant que système modèle supplémentaire ou alternatif, une technique d’injection larvaire est décrite.

Résumé

L’utilisation de modèles non conventionnels pour étudier l’immunité innée et la virulence des agents pathogènes constitue une alternative précieuse aux modèles de mammifères, ce qui peut être coûteux et soulever des questions éthiques. Les modèles non conventionnels sont notoirement bon marché, faciles à manipuler et à cultiver, et ne prennent pas beaucoup de place. Ils sont génétiquement disponibles et possèdent des séquences complètes du génome, et leur utilisation ne présente aucune considération éthique. La mouche des fruits Drosophila melanogaster, par exemple, a fourni d’excellentes informations sur une variété de recherches sur le comportement, le développement, le métabolisme et l’immunité. Plus précisément, les mouches adultes et les larves de D. melanogaster possèdent plusieurs réactions de défense innées qui sont partagées avec les animaux vertébrés. Les mécanismes régulant les réponses immunitaires ont été principalement révélés par des études génétiques et moléculaires dans le modèle de D. melanogaster . Ici, une nouvelle technique d’injection larvaire est fournie, qui favorisera davantage les recherches sur les processus immunitaires innés chez les larves de D. melanogaster et explorera la pathogenèse d’un large éventail d’infections microbiennes.

Introduction

Drosophila melanogaster a été immensément utilisé dans la recherche biologique et biomédicale pendant plusieurs décennies, car la gamme sophistiquée d’outils génétiques et moléculaires a progressivement évolué pour l’analyse d’un large éventail d’études1,2,3,4. Les aspects du développement, de l’homéostasie et de l’immunité innée conservés sur le plan évolutif chez D. melanogaster en ont fait un organisme modèle précieux pour l’étude de diverses maladies humaines et d’insectes5,6.

Protocole

1. Élevage à la mouche

REMARQUE: Le cycle de vie de D. melanogaster est divisé en quatre étapes: embryon, larve, nymphe et adulte. Le temps de génération avec des conditions d’élevage optimales en laboratoire (~ 25 ° C, 60% d’humidité et suffisamment de nourriture) est d’environ 10 jours entre l’œuf fécondé et l’adulte éclos. Les femelles pondent environ 100 embryons par jour et l’embryogenèse dure environ 24 ^h22. Les larves subissent trois stades de développement (instars; L1-L3) en ~4 jours (L1 et L2: 24 h, et L3: 48 h). Les larves du premier stade commencent à se nourrir immédiatement à la ....

Résultats

Lorsqu’elles sont effectuées correctement, les injections de larves de D. melanogaster montrent un effet spécifique à la bactérie. Les données de survie ont été recueillies à plusieurs moments à la suite d’infections à P. asymbiotica (souche ATCC43943), à E. coli (souche K12) et à PBS (figure 4). Alors que les larves de D. melanogaster sont sensibles à P. asymbiotica, ce qui compromet rapidement la survie, les larves injectées av.......

Discussion

Drosophila melanogaster est l’un des modèles les plus précieux et les plus manipulés expérimentalement utilisés pour étudier l’immunité innée et la pathogenèse de diverses infections microbiennes. Cela est dû à son cycle de vie simple et rapide, à son entretien simple en laboratoire, à sa génétique évolutive bien établie et à sa boîte à outils génétique diversifiée. Les méthodes antérieures d’injection de larves de D. melanogaster, telles que l’utilisation d’un disposi.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Food B (Bloomington Recipe)	LabExpress	7001-NV	Food B, in narrow vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable	VWR	25384-342	Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable	VWR	25384-092	Diameter 60 x 15 mm
Glass capillaries	VWR	53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle	VWR	28450-150	Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet	ESCO	LA2-4A2-E
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Mineral oil	Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific	31911-A1
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond	3-000-207
Narrow Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee Scientific	32-109
Needles, hypodermic	VWR	89219-316	22 G, 25 mm
Next Generation Micropipette Puller	World Precision Instruments	SU-P1000
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
Prism	GraphPad	Version 8
Syringes - plastic, disposable	VWR	76124-652	20 mL
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154