Drosophila melanogaster Protocolo de inyección de larvas

Resumen

Las moscas adultas de Drosophila melanogaster se han utilizado ampliamente como organismos modelo para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las respuestas inmunes innatas antimicrobianas del huésped y las estrategias de infección microbiana. Para promover la etapa de larva de D. melanogaster como un sistema modelo adicional o alternativo, se describe una técnica de inyección larvaria.

Resumen

El uso de modelos no convencionales para estudiar la inmunidad innata y la virulencia de los patógenos proporciona una alternativa valiosa a los modelos de mamíferos, que puede ser costosa y plantear problemas éticos. Los modelos no convencionales son notoriamente baratos, fáciles de manejar y cultivar, y no ocupan mucho espacio. Son genéticamente susceptibles y poseen secuencias completas del genoma, y su uso no presenta consideraciones éticas. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster, por ejemplo, ha proporcionado grandes conocimientos sobre una variedad de investigaciones sobre el comportamiento, el desarrollo, el metabolismo y la inmunidad. Más específicamente, las moscas y larvas adultas de D. melanogaster poseen varias reacciones de defensa innatas que se comparten con los animales vertebrados. Los mecanismos que regulan las respuestas inmunes se han revelado principalmente a través de estudios genéticos y moleculares en el modelo de D. melanogaster . Aquí se proporciona una nueva técnica de inyección larvaria, que promoverá aún más las investigaciones de los procesos inmunes innatos en larvas de D. melanogaster y explorará la patogénesis de una amplia gama de infecciones microbianas.

Introducción

Drosophila melanogaster ha sido inmensamente utilizado en la investigación biológica y biomédica durante varias décadas, ya que la sofisticada gama de herramientas genéticas y moleculares han evolucionado constantemente para el análisis de una amplia gama de estudios1,2,3,4. Los aspectos evolutivamente conservados del desarrollo, la homeostasis y la inmunidad innata en D. melanogaster lo han convertido en un valioso organismo modelo para el estudio de diversas enfermedades humanas e ^{insectos5,6<....}

Protocolo

1. Cría de moscas

NOTA: El ciclo de vida de D. melanogaster se divide en cuatro etapas: embrión, larva, pupa y adulto. El tiempo de generación con condiciones óptimas de cría en el laboratorio (~ 25 ° C, 60% de humedad y suficiente comida) es de aproximadamente 10 días desde el óvulo fertilizado hasta el adulto eclosionado. Las hembras ponen ~ 100 embriones por día, y la embriogénesis dura aproximadamente 24 ^h22. Las larvas se someten a tres etapas de desarrollo (instars; L1-L3) en ~4 días (L1 y L2: 24 h, y L3: 48 h). Las primeras larvas de instar comienzan a alimentarse inmediatamente en la s....

Resultados

Cuando se realizan correctamente, las inyecciones de larvas de D. melanogaster muestran un efecto específico de la bacteria. Los datos de supervivencia se recogieron en varios puntos temporales tras las infecciones por P. asymbiotica (cepa ATCC43943), E. coli (cepa K12) y PBS (Figura 4). Mientras que las larvas de D. melanogaster son susceptibles a P. asymbiotica, que compromete la supervivencia rápidamente, las larvas inyectadas con control.......

Discusión

Drosophila melanogaster es uno de los modelos manipulados experimentalmente más valiosos utilizados para las investigaciones de la inmunidad innata y la patogénesis de diversas infecciones microbianas. Esto se debe a su ciclo de vida simple y rápido, mantenimiento simple en un laboratorio, genética evolutiva bien establecida y diversa caja de herramientas genéticas. Los métodos anteriores de inyecciones de larvas de D. melanogaster, como el uso de un dispositivo microfluídico híbrido o un microm.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Food B (Bloomington Recipe)	LabExpress	7001-NV	Food B, in narrow vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable	VWR	25384-342	Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable	VWR	25384-092	Diameter 60 x 15 mm
Glass capillaries	VWR	53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle	VWR	28450-150	Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet	ESCO	LA2-4A2-E
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Mineral oil	Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific	31911-A1
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond	3-000-207
Narrow Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee Scientific	32-109
Needles, hypodermic	VWR	89219-316	22 G, 25 mm
Next Generation Micropipette Puller	World Precision Instruments	SU-P1000
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
Prism	GraphPad	Version 8
Syringes - plastic, disposable	VWR	76124-652	20 mL
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154