果蝇 幼虫注射方案

摘要

果蝇黑色素体 成年蝇已被广泛用作模型生物，以研究宿主抗菌先天免疫反应和微生物感染策略的分子机制。为了促进 D. melanogaster 幼虫阶段作为附加或替代模型系统，描述了幼虫注射技术。

摘要

使用非常规模型来研究先天免疫力和病原体毒力为哺乳动物模型提供了一种有价值的替代方案，哺乳动物模型可能代价高昂并引发伦理问题。众所周知，非常规模型非常便宜，易于处理和文化，并且不占用太多空间。它们在基因上是可适应的，并且拥有完整的基因组序列，并且它们的使用没有道德考虑。例如，果蝇 果蝇黑色素胃蝇为各种行为，发育，新陈代谢和免疫研究提供了很好的见解。更具体地说， D. melanogaster 成年苍蝇和幼虫具有与脊椎动物共享的几种先天防御反应。调节免疫反应的机制主要通过 D. melanogaster 模型中的遗传和分子研究揭示出来。本文提供了一种新型幼虫注射技术，将进一步促进 对黑腹 股蓝虫幼虫先天免疫过程的研究，并探索多种微生物感染的发病机制。

引言

几十年来，黑腹果蝇在生物学和生物医学研究中得到了极大的应用，因为一系列复杂的遗传和分子工具已经稳步发展，用于分析广泛的研究^{1，2，3，4}。黑色素瘤蚜虫发育、稳态和先天免疫的进化保守方面使其成为研究各种人类和昆虫疾病的宝贵模式生物^5，6。值得注意的是，D. melanogaster模型在研究免疫力方面的基本作用在成年苍蝇研究中得到了很大的体现。然而，D. melanogaster幼虫的研究也为目前的知识做出了贡献，并主要探索了细胞免疫反应，特别是通过昆虫角质层发生的黄蜂和线虫感染^{7，8，9，10}。黑果蝇幼虫拥有三种不同类型的血细胞，统称为血细胞:浆细胞，晶体细胞和薄片细胞¹¹....

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研究方案

1. 苍蝇饲养

注意:D. melanogaster的生命周期分为四个阶段:胚胎，幼虫，蛹和成虫。在实验室中具有最佳饲养条件（~25°C，60%湿度和足够的食物）的生成时间约为从受精卵到关闭成虫的10天。雌性每天产下约100个胚胎，胚胎发生持续约24小时²²。幼虫经历三个发育阶段（幼虫;L1-L3）在~4天内（L1和L2:24小时，L3:48小时）。第一龄幼虫立即开始在培养基表面进食。第二龄幼虫钻入培养基，而三龄幼虫离开培养基并沿着小瓶壁徘徊，寻找一个蛹24-48小时的地方。

1. 将含有玉米粉-大豆饮食的干粮加入窄聚苯乙烯小瓶（25 mm x 95 mm）中，以 1/5 至 2/5 的体积。然后加入9毫升水，让小瓶静置1分钟，直到饮食完全水合。
2. 向小瓶中加入约10粒干面包酵母，并放置至少20只新出现的雄性和雌性成年苍蝇的混合物。
3. 将小瓶在25°C下以12:12小时的光:暗光周期循环孵育。
4. 为确保生命周期进展，请每天检查苍蝇瓶并记录初始开发阶段。

2. 感染的幼虫选择

1. 在感染进行当天达到游荡的第三龄阶段时，用精细画笔选择幼虫（骆驼的毛发最好）（

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结果

如果操作正确，注射 D. melanogaster 幼虫显示出细菌特异性作用。在感染 无菌疟原 虫（ATCC43943株）、 大肠杆菌 （菌株K12）和PBS（图4）后的几个时间点收集生存数据。虽然 D. melanogaster 幼虫对 P. asymbiotica敏感，这会迅速损害生存，但注射 大肠杆菌 或PBS对照的幼虫表现出更长的存活^{率24，25.......}

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讨论

黑腹果蝇 是最有价值的实验操纵模型之一，用于研究各种微生物感染的先天免疫和发病机制。这是由于其简单而快速的生命周期，实验室中的简单维护，完善的进化遗传学和多样化的遗传工具箱。以前的 D. melanogaster 幼虫注射方法，例如使用混合微流体装置或Narishige显微操纵器，需要高度专业化的设备，并且可能很昂贵^21，27。在目前的方?.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Food B (Bloomington Recipe)	LabExpress	7001-NV	Food B, in narrow vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable	VWR	25384-342	Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable	VWR	25384-092	Diameter 60 x 15 mm
Glass capillaries	VWR	53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle	VWR	28450-150	Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet	ESCO	LA2-4A2-E
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Mineral oil	Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific	31911-A1
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond	3-000-207
Narrow Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee Scientific	32-109
Needles, hypodermic	VWR	89219-316	22 G, 25 mm
Next Generation Micropipette Puller	World Precision Instruments	SU-P1000
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
Prism	GraphPad	Version 8
Syringes - plastic, disposable	VWR	76124-652	20 mL
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154