Дрозофила меланогастер Протокол инжекции личинок

Резюме

Взрослые мухи Drosophila melanogaster широко использовались в качестве модельных организмов для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе врожденных иммунных реакций хозяина противомикробных препаратов и стратегий микробной инфекции. Для продвижения стадии личинки D. melanogaster в качестве дополнительной или альтернативной модельной системы описана методика личиночного впрыска.

Аннотация

Использование нетрадиционных моделей для изучения врожденного иммунитета и вирулентности патогенов обеспечивает ценную альтернативу моделям млекопитающих, которые могут быть дорогостоящими и поднимать этические вопросы. Нетрадиционные модели, как известно, дешевы, просты в обращении и культуре, и не занимают много места. Они генетически поддаются и обладают полными последовательностями генома, и их использование не представляет никаких этических соображений. Плодовая муха Drosophila melanogaster, например, дала отличное представление о различных исследованиях поведения, развития, метаболизма и иммунитета. Более конкретно, взрослые мухи и личинки D. melanogaster обладают несколькими врожденными защитными реакциями, которые разделяются с позвоночными животными. Механизмы, регулирующие иммунные реакции, были в основном выявлены с помощью генетических и молекулярных исследований в модели D. melanogaster . Здесь представлен новый метод инъекции личинок, который будет способствовать дальнейшим исследованиям врожденных иммунных процессов у личинок D. melanogaster и изучению патогенеза широкого спектра микробных инфекций.

Введение

Drosophila melanogaster широко используется в биологических и биомедицинских исследованиях в течение нескольких десятилетий, поскольку сложный набор генетических и молекулярных инструментов неуклонно развивался для анализа широкого спектра исследований1,2,3,4. Эволюционно сохраненные аспекты развития, гомеостаза и врожденного иммунитета у D. melanogaster сделали его ценным модельным организмом для изучения различных заболеваний человека и ^{насекомых5,6}. Примечательно, что фундаментальная роль модели D. melanogaster для изучения иммунитета была в значительной степени проиллюстрирована в исследованиях взрослых мух. Тем не менее, исследования личинок D. melanogaster также внесли свой вклад в современные знания и в основном изучили клеточные иммунные реакции, особенно на инфекции ос и нематод, которые происходят через кутикулу насекомых7,8,9,10. Личинки Drosophila melanogaster обладают тремя различными типами клеток крови, которые в совокупности называются гемоцитами: плазматоциты, кристаллические клетки и ламелоциты11,12,13. Эти клетки могут устанавливать множество иммунных реакций, когда личинки D. melanogaster заражены патогенами, такими как бактерии, грибки, вирусы и паразиты14,15,16. Клеточные иммунные реакции включают прямое поглощение (фагоцитоз) малых молекул или бактерий, меланизацию, инкапсуляцию более крупных патогенов, таких как паразитоидные яйца, и производство активных форм кислорода (АФК) и синтаз оксида азота (NOS)17,18,19.

Напротив, было опубликовано меньше исследований по использованию модели личинок D. melanogaster для анализа гуморальных иммунных реакций. Это в основном связано с применением кормовых анализов на оральную инфекцию личинок D. melanogaster и несколькими проблемами, связанными с микроинъекцией личинок, включая точное обращение с личинками и правильное использование микроиглы, особенно во время ^{проникновения20,21}. Таким образом, ограниченные знания о личиночной инфекции и технические трудности (т.е. высокая смертность) часто затрудняли использование модели личинок D. melanogaster. Личиночная модель будет иметь потенциал для выявления новых молекулярных механизмов, которые обеспечат дальнейшее понимание взаимодействий хозяина и патогена и индукции специфических врожденных иммунных реакций хозяина против патогенных инфекций.

Здесь подробно описан простой и эффективный протокол, который можно использовать для введения личинкам D. melanogaster различных патогенов, таких как бактерии. В частности, личинки D. melanogaster используются для инъекций с человеческим возбудителем Photorhabdus asymbiotica и непатогенными бактериями Escherichia coli. Этот метод может быть использован для манипуляций и анализа иммунных реакций D. melanogaster на различные микробные инфекции.

протокол

1. Выращивание мух

ПРИМЕЧАНИЕ: Жизненный цикл D. melanogaster делится на четыре стадии: эмбрион, личинка, куколка и взрослая особь. Время генерации при оптимальных условиях выращивания в лаборатории (~25 °C, влажность 60% и достаточная пища) составляет примерно 10 дней от оплодотворенной яйцеклетки до эклозированной взрослой особи. Самки откладывают ~100 эмбрионов в день, а эмбриогенез длится около 24 ^ч22. Личинки проходят три стадии развития (instars; L1-L3) через ~4 дня (L1 и L2: 24 ч, и L3: 48 ч). Первые личинки начинают питаться сразу на поверхности среды. Личинки второй звезды зарываются в среду, в то время как личинки третьей звезды покидают среду и бродят по стенкам флаконов, ища место для окукливания в течение 24-48 ч. Линия D. melanogaster , используемая для этого протокола, - Oregon R (FBsn0000276).

1. Добавьте сухой корм, содержащий диету на основе кукурузной муки и сои, в узкий флакон из полистирола (25 мм х 95 мм) до объема от 1/5 до 2/5. Затем добавьте 9 мл воды и дайте флакону постоять в течение 1 минуты, пока диета полностью не увлажнится.
2. Добавьте во флакон около 10 гранул сухих пекарских дрожжей и поместите смесь не менее 20 недавно появившихся самцов и самок взрослых мух.
3. Инкубируйте флакон при 25 °C при 12:12-часовом свете: темном фотопериодическом цикле.
4. Чтобы обеспечить прогрессирование жизненного цикла, ежедневно проверяйте флаконы с мухами и записывайте начальные стадии развития.

2. Отбор личинок на инфекцию

1. Отбирайте личинок тонкой кистью (лучше всего волосы верблюда), как только они достигнут блуждающей третьей стадии в день заражения (рисунок 1).
2. Вымойте выбранных личинок раствором Рингера (100 мМ NaCl, 1,8 мМ KCl, 2 мМ _CaCl2, 1 мМ _MgCl2, 5 мМ HEPES pH 6,9) в небольшой чашке Петри (60 мм х 15 мм) после извлечения из их первоначального флакона23.
3. Поместите личинки на фильтровальную бумагу (диаметр 150 мм), которая слегка смочена примерно 5 мл раствора Рингера, в чашку Петри (100 мм х 15 мм) (рисунок 2А).
4. Добавляйте ~ 1 мл раствора Рингера ежедневно в фильтровальную бумагу по мере необходимости, чтобы избежать сухости и высыхания личинок.

3. Бактериальный препарат

1. Культивирование бактерий P. asymbiotica на агаровой среде Luria Bertani (LB) при 28 °C в течение 48 ч.
2. Используйте шкаф уровня биобезопасности 2 для переноса одной колонии P. asymbiotica для инокуляции жидкой культуры в 10 мл среды LB.
3. Инкубируйте жидкую культуру P. asymbiotica в течение ночи при 28 °C во вращающемся шейкере, установленном на 220 оборотов в минуту.
4. Культивируют бактерии E. coli аналогичным образом, но осуществляют начальный рост на агаровой среде и инкубацию жидких культур при 37 °C в течение ночи.
5. Центрифугируйте каждую ночную бактериальную культуру в течение 3 мин при 13 000 х г и 4 °C.
6. Выбросьте супернатант и трижды промыть полученные бактериальные гранулы 10 мл стерильного PBS.
7. Снова центрифугируйте гранулы в течение 3 мин при 13 000 х г и 4 °C.
8. Разбавляют каждую гранулу стерильным PBS для регулировки бактериальных концентраций до оптической плотности (600 нм) 0,25 для P. asymbiotica и 0,015 для E. coli, которые соответствуют 100-300 колониеобразующим единицам на личинку каждого бактериального препарата, используя спектрофотометр.

4. Подготовка инжектора

1. Подготовьте капилляры, используя 3,5-дюймовые стеклянные капиллярные трубки и съемник микропипетки. Установите прибор следующим образом: нагрев: 580; тяга: 143; скорость: 25; задержка: 1; давление: 500.
2. Используйте прямые зазубренные среднеточечные щипцы, чтобы открыть стеклянный капилляр до такой степени, которая позволит доставить экспериментальные обработки, нанося при этом минимальный ущерб личинкам (рисунок 2B). Чтобы оптимизировать эту процедуру во время практики инъекций, используйте раствор Trypan Blue (разбавьте запас на 0,4% с PBS до 0,2%), чтобы легко отслеживать утечку во время инъекции и выживание синих личинок.
3. Наполните капилляр минеральным маслом с помощью пластикового, одноразового шприца 20 мл с подкожной иглой (22 г, длина 25 мм).
4. Установите нанолитровый инжектор и вытолкните масло из капилляра (рисунок 2C).
5. Наполните капилляр нужным бактериальным препаратом для инъекций. Принимают раствор из капли (~20 мкл), которая помещается на парапленку. В этом протоколе вводили 50,2 нл двух бактериальных запасов.

5. Инъекции личинок

1. Обезболивайте личинок D. melanogaster с использованием углекислого газа в течение ~ 2 мин до процедуры.
2. Аккуратно переложите обезболенные личинки на фильтровальную бумагу, смоченную в растворе Рингера при подготовке к инъекции под стереомикроскопом. Личинки будут вялыми или пассивными в этот момент.
3. Чтобы ввести личинок, нанесите сильное давление на дорсальную сторону заднего конца (дыхальца трахеи видны на заднем конце по сравнению с черными частями рта на переднем конце) с помощью щипцов (рисунок 2D).
4. Вставьте иглу горизонтально к заднему концу личинок, около кутикулы. Успешная инъекция не приведет к утечке введенного раствора из личинок (рисунок 3).
5. Удалите щипцы, которые использовались для оказания давления на хвост личинок, прежде чем вынимать иглу. Если не удалить сначала, щипцы могут вытеснить гемолимфу и / или кишечник из личинок из места раны.
6. Заразить соответствующее количество личинок для проводимого исследования. В этом конкретном протоколе было введено 20 личинок для каждого экспериментального состояния.
7. Используя щипцы, аккуратно перенесите введенные личинки в отдельную влажную фильтровальную бумагу в чашку Петри (10 личинок на чашку) или флакон с пищей (в зависимости от цели эксперимента), чтобы обеспечить восстановление.
8. Поместите чашки Петри или флаконы с пищей в инкубатор при температуре 25 °C. Если личинки содержатся в чашке Петри, добавьте раствор Рингера по мере необходимости, чтобы предотвратить высыхание.

6. Регистрация выживаемости/смертности

1. Регистрируйте количество мертвых и живых личинок D. melanogaster в соответствии с установленными экспериментальными временными точками. Живые личинки будут продолжать развиваться в куколок и взрослых особей.
2. Используйте статистические программы, такие как Prism, для ввода необработанных данных о выживаемости / смертности, анализа их с помощью теста log-rank (Mantel-Cox) и представления результатов в цифрах.

Результаты

При правильном выполнении инъекции личинок D. melanogaster показывают бактериально-специфический эффект. Данные о выживаемости были собраны в несколько временных точек после заражения P. asymbiotica (штамм ATCC43943), E. coli (штамм K12) и PBS (рисунок 4). В то время как личинки D....

Обсуждение

Drosophila melanogaster является одной из наиболее ценных, экспериментально манипулируемых моделей, используемых для исследований врожденного иммунитета и патогенеза различных микробных инфекций. Это связано с его простым и быстрым жизненным циклом, простым обслуживанием в лаборатории, х?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Food B (Bloomington Recipe)	LabExpress	7001-NV	Food B, in narrow vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable	VWR	25384-342	Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable	VWR	25384-092	Diameter 60 x 15 mm
Glass capillaries	VWR	53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle	VWR	28450-150	Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet	ESCO	LA2-4A2-E
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Mineral oil	Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific	31911-A1
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond	3-000-207
Narrow Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee Scientific	32-109
Needles, hypodermic	VWR	89219-316	22 G, 25 mm
Next Generation Micropipette Puller	World Precision Instruments	SU-P1000
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
Prism	GraphPad	Version 8
Syringes - plastic, disposable	VWR	76124-652	20 mL
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154