Drosophila melanogaster Protocollo di iniezione della larva

Riepilogo

Le mosche adulte Drosophila melanogaster sono state ampiamente utilizzate come organismi modello per studiare i meccanismi molecolari alla base delle risposte immunitarie innate antimicrobiche dell'ospite e delle strategie di infezione microbica. Per promuovere lo stadio larvale di D. melanogaster come sistema modello aggiuntivo o alternativo, viene descritta una tecnica di iniezione larvale.

Abstract

L'uso di modelli non convenzionali per studiare l'immunità innata e la virulenza dei patogeni fornisce una valida alternativa ai modelli di mammiferi, che possono essere costosi e sollevare questioni etiche. I modelli non convenzionali sono notoriamente economici, facili da maneggiare e cultura e non occupano molto spazio. Sono geneticamente suscettibili e possiedono sequenze genomiche complete e il loro uso non presenta considerazioni etiche. Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster, ad esempio, ha fornito grandi intuizioni su una varietà di comportamento, sviluppo, metabolismo e ricerca sull'immunità. Più specificamente, le mosche e le larve adulte di D. melanogaster possiedono diverse reazioni di difesa innate che sono condivise con gli animali vertebrati. I meccanismi che regolano le risposte immunitarie sono stati per lo più rivelati attraverso studi genetici e molecolari nel modello D. melanogaster . Qui viene fornita una nuova tecnica di iniezione larvale, che promuoverà ulteriormente le indagini sui processi immunitari innati nelle larve di D. melanogaster ed esplorerà la patogenesi di una vasta gamma di infezioni microbiche.

Introduzione

Drosophila melanogaster è stata immensamente utilizzata nella ricerca biologica e biomedica per diversi decenni, poiché la sofisticata gamma di strumenti genetici e molecolari si è costantemente evoluta per l'analisi di una vasta gamma di studi1,2,3,4. Gli aspetti evolutivamente conservati dello sviluppo, dell'omeostasi e dell'immunità innata in D. melanogaster lo hanno reso un prezioso organismo modello per lo studio di varie malattie umane e degli ^insetti5,6. In p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Allevamento di mosche

NOTA: Il ciclo di vita di D. melanogaster è diviso in quattro fasi: embrione, larva, pupa e adulto. Il tempo di generazione con condizioni di allevamento ottimali in laboratorio (~ 25 ° C, 60% di umidità e cibo sufficiente) è di circa 10 giorni dall'uovo fecondato all'adulto echiuso. Le femmine depongono circa 100 embrioni al giorno e l'embriogenesi dura circa 24 ore su ²². Le larve subiscono tre fasi di sviluppo (instars; L1-L3) in ~4 giorni (L1 e L2: 24 h, e L3: 48 h). Le prime larve instar iniziano a nutrirsi immediatamente sulla superficie del mezzo. Le larve di se....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Se eseguite correttamente, le iniezioni di larve di D. melanogaster mostrano un effetto specifico del batterio. I dati di sopravvivenza sono stati raccolti in diversi punti temporali a seguito di infezioni da P. asymbiotica (ceppo ATCC43943), E. coli (ceppo K12) e PBS (Figura 4). Mentre le larve di D. melanogaster sono sensibili a P. asymbiotica, che compromette rapidamente la sopravvivenza, le larve iniettate con controlli E. coli o PBS .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Drosophila melanogaster è tra i modelli più preziosi e manipolati sperimentalmente utilizzati per le indagini sull'immunità innata e sulla patogenesi di varie infezioni microbiche. Ciò è dovuto al suo ciclo di vita semplice e veloce, alla semplice manutenzione in laboratorio, alla genetica evolutiva ben consolidata e alla diversa cassetta degli attrezzi genetica. I precedenti metodi di iniezioni di larve di D. melanogaster, come l'utilizzo di un dispositivo microfluidico ibrido o di un micromanipol.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Food B (Bloomington Recipe)	LabExpress	7001-NV	Food B, in narrow vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable	VWR	25384-342	Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable	VWR	25384-092	Diameter 60 x 15 mm
Glass capillaries	VWR	53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle	VWR	28450-150	Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet	ESCO	LA2-4A2-E
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Mineral oil	Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific	31911-A1
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond	3-000-207
Narrow Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee Scientific	32-109
Needles, hypodermic	VWR	89219-316	22 G, 25 mm
Next Generation Micropipette Puller	World Precision Instruments	SU-P1000
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
Prism	GraphPad	Version 8
Syringes - plastic, disposable	VWR	76124-652	20 mL
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154