Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים

Summary

זבובים בוגרים של Drosophila melanogaster נוצלו בהרחבה כאורגניזמים מודל כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התגובות החיסוניות המולדות של המארחים ואסטרטגיות זיהום מיקרוביאליות. כדי לקדם את שלב הזחלים D. melanogaster כמערכת מודל נוספת או חלופית, מתוארת טכניקת הזרקת זחלים.

Abstract

השימוש במודלים לא קונבנציונליים לחקר חסינות מולדת וארסיות פתוגן מספק חלופה בעלת ערך למודלים של יונקים, אשר יכול להיות יקר ולהעלות סוגיות אתיות. דגמים לא קונבנציונליים הם זולים לשמצה, קלים לטיפול ותרבות, ואינם תופסים הרבה מקום. הם נוחים גנטית ובעלי רצפי גנום שלמים, והשימוש בהם אינו מציג שיקולים אתיים. זבוב הפירות Drosophila melanogaster, למשל, סיפק תובנות נהדרות על מגוון רחב של התנהגות, התפתחות, חילוף חומרים, ומחקר חסינות. ליתר דיוק, D. melanogaster זבובים בוגרים וזחלים להחזיק כמה תגובות הגנה מולדות המשותפות עם בעלי חוליות. המנגנונים המסדירים את התגובות החיסוניות נחשפו בעיקר באמצעות מחקרים גנטיים ומולקולריים במודל D. melanogaster . כאן מסופקת טכניקת הזרקת זחלים חדשנית, אשר תקדם עוד יותר חקירות של תהליכים חיסוניים מולדים בזחלי D. melanogaster ולחקור את הפתוגנזה של מגוון רחב של זיהומים מיקרוביאליים.

Introduction

Drosophila melanogaster כבר מנוצל מאוד במחקר ביולוגי וביו-רפואי במשך כמה עשורים, כמו המערך המתוחכם של כלים גנטיים ומולקולריים התפתחו בהתמדה לניתוח של מגוון רחב של מחקרים1,2,3,4. ההיבטים השמורים אבולוציונית של התפתחות, הומאוסטזיס וחסינות מולדת ב- D. melanogaster הפכו אותו לאורגניזם מודל בעל ערך לחקר מחלות אנושיות וחרקים ^{שונות5,6}. ראוי לציין, את התפקיד הבסיסי של מודל D. melanogaster לחקר חסינות כבר בא לידי ביטוי במידה רבה במחקרים זבובים למבוגרים. עם זאת, D. melanogaster זחלים מחקרים תרמו גם לידע הנוכחי בעיקר חקר תגובות חיסוניות הסלולר, במיוחד עבור צרעות וזיהומים נמטודות המתרחשים דרך קוטיקל ^{חרק7,8,9,10}. זחלי Drosophila melanogaster מחזיקים בשלושה סוגים שונים של תאי דם, הנקראים ביחד המוציטים: פלסמטוציטים, תאי קריסטל ולאמלוציטים11,12,13. תאים אלה יכולים להרכיב מערך של תגובות חיסוניות כאשר זחלי D. melanogaster נגועים בפתוגנים כגון חיידקים, פטריות, וירוסים וטפילים14,15,16. התגובות החיסוניות התאיות כוללות בליעה ישירה (פאגוציטוזיס) של מולקולות קטנות או חיידקים, מלניזציה, אנקפסולציה של פתוגנים גדולים יותר כגון ביצי טפילים, וייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) וסינתיסייזרים תחמוצת החנקן (NOS)17,18,19.

לעומת זאת, פחות מחקרים פורסמו על השימוש במודל הזחל D. melanogaster כדי לנתח תגובות חיסוניות הומוריסטיות. זה בעיקר בשל היישום של בדיקות האכלה לזיהום אוראלי של זחלי D. melanogaster ומספר אתגרים הקשורים זחלים microinjecting כולל טיפול מדויק של זחלים ושימוש נכון של microneedle, במיוחד במהלך ^{חדירה20,21}. לפיכך, הידע המוגבל של זיהום זחלים וקשיים טכניים (כלומר, תמותה גבוהה) הפכו לעתים קרובות את מודל הזחל D. melanogaster קשה לשימוש. למודל זחל יהיה פוטנציאל לזהות מנגנונים מולקולריים חדשניים שיספקו תובנות נוספות על אינטראקציות מארח-פתוגן ועל אינדוקציה של תגובות חיסוניות מולדות מארח ספציפיות נגד זיהומים פתוגניים.

כאן פרוטוקול פשוט ויעיל שניתן להשתמש בו כדי להזריק D. melanogaster זחלים עם פתוגנים שונים, כגון חיידקים, מתואר בפירוט. בפרט, D. זחלי מלנוגאסטר משמשים לזריקות עם הפתוגן האנושי Photorhabdus asymbiotica והחיידקים הלא פתוגניים Escherichia coli. שיטה זו יכולה לשמש למניפולציה וניתוח של התגובות החיסוניות של D. melanogaster לזיהומים מיקרוביאליים שונים.

Protocol

1. גידול זבובים

הערה: מחזור החיים של D. melanogaster מחולק לארבעה שלבים: עובר, זחל, גולם ומבוגר. זמן הייצור עם תנאי גידול אופטימליים במעבדה (כ -25 °C (~ 25 °C (,60% לחות, ומזון מספיק) הוא כ 10 ימים מביצית מופרית למבוגר מעוקל. הנקבות מניחות ~ 100 עוברים ליום, ועובר נמשך כ 24 שעות ^ביממה. הזחלים עוברים שלושה שלבים התפתחותיים (instars; L1-L3) בתוך ~ 4 ימים (L1 ו- L2: 24 שעות, ו- L3: 48 שעות). זחלי האינסטאר הראשונים מתחילים להיזון מיד על פני המדיום. זחלי אינסטאר שניים מתחפרים לתוך המדיום, בעוד זחלי אינסטאר שלישי לעזוב את המדיום ולשוטט במעלה קירות הבקבוקון, מחפש מקום pupariate עבור 24-48 שעות. קו D. melanogaster המשמש עבור פרוטוקול זה הוא אורגון R (FBsn0000276).

1. הוסיפו מזון יבש המכיל תזונה מבוססת קמח תירס לבקבוקון פוליסטירן צר (25 מ"מ על 95 מ"מ) לנפח של 1/5 עד 2/5. לאחר מכן להוסיף 9 מ"ל של מים ולאפשר בקבוקון לשבת במשך 1 דקה עד הדיאטה הוא hydrated לחלוטין.
2. מוסיפים כ -10 גרגירים של שמרי אופה יבשים לבקבוקון ומניחים תערובת של לפחות 20 זבובים בוגרים זכרים ונקבות שזה עתה הופיעו.
3. דגירה הבקבוקון ב 25 °C (50 °F) על אור 12:12 שעות ביממה: מחזור פוטופריודי כהה.
4. כדי להבטיח את התקדמות מחזור החיים, בדוק את בקבוקוני הזבוב מדי יום ורשום את שלבי ההתפתחות הראשוניים.

2. בחירת זחלים לזיהום

1. בחרו זחלים עם מברשת צבע עדינה (שיער הגמלים הוא הטוב ביותר) ברגע שהם מגיעים לשלב האינסטאר השלישי הנודד ביום שבו יבוצע הזיהום (איור 1).
2. לשטוף את הזחלים שנבחרו עם הפתרון של רינגר (100 mM NaCl, 1.8 מ"מ KCl, 2 מ"מ _CaCl2, 1 מ"מ _MgCl2, 5 מ"מ HEPES pH 6.9) בצלחת פטרי קטנה (60 מ"מ x 15 מ"מ) עם הסרה מהבקבוקון המקורי ^שלהם23.
3. מניחים את הזחלים על נייר סינון (קוטר 150 מ"מ) שנרטב מעט עם כ-5 מ"ל של תמיסת רינגר בצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) (איור 2A).
4. הוסיפו כ-1 מ"ל של התמיסה של רינגר מדי יום לנייר הסינון לפי הצורך כדי למנוע יובש והתייבשות זחלים.

3. הכנה חיידקית

1. תרבות P. חיידקי אסימביוטיקה על לוריא ברטאני (LB) אגר מדיה ב 28 °C (60 °F) עבור 48 שעות.
2. השתמש בארון ברמת בטיחות ביולוגית 2 כדי להעביר מושבה אחת של P. asymbiotica כדי לחסן תרבית נוזלית ב 10 מ"ל של מדיה LB.
3. דגירה על תרבית נוזלית P. אסימביוטיקה בן לילה ב 28 °C (50 °F) בשייקר סיבובי להגדיר 220 סל"ד.
4. תרבות E. coli חיידקים באופן דומה, אבל לבצע את הצמיחה הראשונית על אגר מדיה ודגרה תרבות נוזלית ב 37 °C (50 °F) לילה.
5. צנטריפוגה כל תרבית חיידקים לילה במשך 3 דקות ב 13,000 x g ו 4 °C (60 °F).
6. להשליך את supernatant ולשטוף את כדורי חיידקים וכתוצאה מכך שלוש פעמים עם 10 מ"ל של PBS סטרילי.
7. צנטריפוגה הכדורים שוב במשך 3 דקות ב 13,000 x g ו 4 °C (60 °F).
8. לדלל כל גלולה עם PBS סטרילי כדי להתאים את ריכוזי החיידקים לצפיפות האופטית (600 ננומטר) של 0.25 עבור P. אסימביוטיקה ו 0.015 עבור E. coli, אשר תואמים 100-300 מושבה להרכיב יחידות לכל זחל של כל הכנה חיידקית, באמצעות ספקטרופוטומטר.

4. הכנת מזרק

1. הכן נימים באמצעות צינורות נימי זכוכית בגודל 3.5 אינץ' ומושך מיקרופיפט. הגדר את המכשיר כדלקמן: חום: 580; משיכה: 143; מהירות: 25; עיכוב: 1; לחץ: 500.
2. השתמשו במלקחיים בינוניים משוננים ישרים כדי לפתוח את נימי הזכוכית במידה שתאפשר את אספקת הטיפולים הניסיוניים תוך גרימת נזק מינימלי לזחלים (איור 2B). כדי לייעל הליך זה תוך כדי תרגול זריקות, השתמש בפתרון Trypan Blue (לדלל את המניה 0.4% עם PBS ל 0.2%) כדי לעקוב בקלות אחר דליפה בעת הזרקה ואת ההישרדות של הזחלים הכחולים.
3. מלא את הנימים בשמן מינרלי באמצעות מזרק פלסטיק, חד פעמי 20 מ"ל עם מחט hypodermic (22 גרם, 25 מ"מ אורך).
4. הגדירו את מזרק הננו-ליטר ופלטו את השמן מהנימיל (איור 2C).
5. מלא את הנימים עם ההכנה החיידקית הרצויה להזרקה. קח את הפתרון מטיפה (~ 20 μL) כי הוא ממוקם על parafilm. בפרוטוקול זה, 50.2 nL של שתי מניות חיידקים הוזרקו.

5. הזרקת זחלים

1. מרדים D. melanogaster זחלים באמצעות פחמן דו חמצני במשך ~ 2 דקות לפני ההליך.
2. מעבירים בעדינות את הזחלים המרדים לנייר סינון שנרטב בתמיסה של רינגר כהכנה להזרקה תחת סטריאומיקרוסקופ. הזחלים יהיו רדומים או פסיביים בשלב זה.
3. כדי להזריק זחלים, הפעילו לחץ איתן על הצד הגבי של הקצה האחורי (הצריחיות של קנה הנשימה ניכרות בקצה האחורי לעומת חלקי פה שחורים בקצה הקדמי) באמצעות מלקחיים (איור 2D).
4. הכנס את המחט אופקית לכיוון הקצה האחורי של הזחלים, ליד הציפורן. זריקה מוצלחת לא תגרום לדליפה של התמיסה המוזרקת מהזחלים (איור 3).
5. הסר את המלקחיים ששימשו להפעלת לחץ על זנב הזחלים לפני משיכת המחט. אם לא הוסר תחילה, המלקחיים יכולים להכריח המולימפה ו/או את המעי לצאת מהזחלים מאתר הפצע.
6. להדביק את המספר המתאים של זחלים עבור המחקר המבוצע. בפרוטוקול המסוים הזה, 20 זחלים לכל מצב ניסיוני הוזרקו.
7. באמצעות מלקחיים, מעבירים בעדינות את הזחלים המוזרקים לנייר סינון לח נפרד בצלחת פטרי (10 זחלים למנה) או בקבוקון מזון (בהתאם למטרת הניסוי) כדי לאפשר התאוששות.
8. מניחים את מנות פטרי או בקבוקוני מזון באינקובטור ב 25 °C (50 °F). אם הזחלים נשמרים בצלחת פטרי, הוסיפו את הפתרון של רינגר לפי הצורך כדי למנוע ייבוש.

6. רישום הישרדות/תמותה

1. רשום את מספר הזחלים המתים והחיים של ד. מלנוגסטר על פי נקודות הזמן הניסיוניות שנקבעו. זחלים חיים ימשיכו להתפתח לגולם ולמבוגרים.
2. השתמש בתוכניות סטטיסטיות, כגון פריזמה, כדי להזין את נתוני ההישרדות /התמותה הגולמיים, לנתח אותם באמצעות מבחן דרגת היומן (Mantel-Cox) ולייצג את התוצאות במספרים.

תוצאות

כאשר מבוצעים כראוי, זריקות של D. melanogaster זחלים להראות אפקט ספציפי חיידק. נתוני ההישרדות נאספו במספר נקודות זמן בעקבות זיהומים של P. asymbiotica (זן ATCC43943), E. coli (זן K12) ו- PBS (איור 4). בעוד D. melanogaster זחלים רגישים P. א-סימביוטיקה, אשר פוגע הישרדות במהירות, זחלים מוזרק ...

Discussion

Drosophila melanogaster הוא בין המודלים החשובים ביותר, מניפולציה ניסיונית המשמשים לחקירות של חסינות מולדת ופתוגנזה של זיהומים מיקרוביאליים שונים. הסיבה לכך היא מחזור החיים הפשוט והמהיר שלה, תחזוקה פשוטה במעבדה, גנטיקה אבולוציונית מבוססת היטב וארגז כלים גנטי מגוון. שיטות קודמות של D. melanogaster

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Food B (Bloomington Recipe)	LabExpress	7001-NV	Food B, in narrow vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable	VWR	25384-342	Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable	VWR	25384-092	Diameter 60 x 15 mm
Glass capillaries	VWR	53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle	VWR	28450-150	Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet	ESCO	LA2-4A2-E
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Mineral oil	Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific	31911-A1
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond	3-000-207
Narrow Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee Scientific	32-109
Needles, hypodermic	VWR	89219-316	22 G, 25 mm
Next Generation Micropipette Puller	World Precision Instruments	SU-P1000
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
Prism	GraphPad	Version 8
Syringes - plastic, disposable	VWR	76124-652	20 mL
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154