キイロショウジョウバエ 幼虫注入プロトコル

要約

ショウジョウバエのメラノガスター 成虫ハエは、宿主の抗菌自然免疫応答および微生物感染戦略の根底にある分子メカニズムを調べるためのモデル生物として広く利用されてきた。追加的または代替的なモデル系として D.メラノガスター 幼虫期を促進するための、幼虫注入技術が記載されている。

要約

自然免疫と病原体の毒性を研究するための型破りなモデルの使用は、哺乳類モデルに代わる貴重な代替手段を提供し、費用がかかり、倫理的問題を提起する可能性があります。型破りなモデルは、安価で扱いやすく、文化が容易で、スペースを取らないことで有名です。彼らは遺伝的に従順であり、完全なゲノム配列を有し、それらの使用は倫理的考慮を提示しない。例えば、ショウ ジョウバエのメラノガスターは、さまざまな行動、発達、代謝、免疫研究に大きな洞察を与えてきました。より具体的には、 D. melanogaster 成虫のハエおよび幼虫は、脊椎動物と共有されるいくつかの先天的な防御反応を有する。免疫応答を調節するメカニズムは、 D. melanogaster モデルにおける遺伝的および分子的研究によって主に明らかにされている。ここでは、 D. melanogaster 幼虫における自然免疫プロセスの調査をさらに促進し、広範囲の微生物感染の病因を探る新規幼虫注入技術が提供される。

概要

ショウジョウバエのメラノガスターは、幅広い研究の分析のために洗練された遺伝的および分子的ツールの配列が着実に進化してきたため、数十年にわたって生物学的および生物医学的研究に大いに利用されてきました1,2,3,4。D. melanogasterの発達、恒常性、自然免疫の進化的に保存された側面は、さまざまなヒトおよび昆虫の病気を研究するための貴重なモデル生物となっています^5,6。特に、免疫を研究するためのD.メラノガスターモデルの基本的な役割は、成虫のハエ研究において大きく例示されている。しかし、D. melanogaster幼虫の研究も現在の知識に貢献し、主に昆虫のキューティクルを介して起こるワタおよび線虫感染に対する細胞性免疫応答を探求した7,8,9,10。

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プロトコル

1. フライ飼育

注:D.メラノガスターのライフサイクルは、胚、幼虫、蛹、成虫の4つの段階に分かれています。実験室での最適な飼育条件(〜25°C、湿度60%、十分な食物)での生成時間は、受精卵から密閉成体まで約10日間です。雌は1日あたり約100個の胚を産み、胚発生は約24時間²²続きます。幼虫は3つの発達段階(instars;L1-L3)で〜4日間(L1およびL2:24時間、およびL3:48時間)。最初の齢幼虫は、培地の表面上で直ちに摂食し始める。第2齢幼虫は培地に穴を掘り、第3齢幼虫は培地を離れ、バイアル壁をさまよい、24〜48時間蛹化する場所を探す。

1. コーンミール - 大豆ベースの食事を含むドライフードを狭いポリスチレンバイアル(25 mm x 95 mm)に加え、1/5〜2/5容量のアブエにします。その後、9mLの水を加え、食事が完全に水和するまでバイアルを1分間座らせます。
2. 約10個の乾燥パン酵母の顆粒をバイアルに加え、少なくとも20匹の新しく出現した雄および雌の成虫ハエの混合物を置く。
3. バイアルを12:12-hの光:暗い光周期サイクル上で25°Cでインキュベートする。
4. ライフサイクルの進行を確実にするために、フライバイアルを毎日チェックし、初期の開発....

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結果

正しく行われると、D.メラノガスター幼虫の注射は細菌特異的な効果を示す。生存データは、非対称性菌(ATCC43943株)、大腸菌(K12株)、およびPBSの感染後のいくつかの時点で収集された(図4)。D. melanogaster幼虫はP. asymbioticaに罹患しやすく、生存を急速に損ないのに対し、大腸菌またはPBS対照を注射した幼虫は長期生存を示す

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ディスカッション

ショウジョウバエのメラノガスターは、自然免疫と様々な微生物感染症の病因の調査に使用される最も価値のある、実験的に操作されたモデルの一つです。これは、そのシンプルで速いライフサイクル、実験室での簡単な維持、十分に確立された進化遺伝学、および多様な遺伝的ツールボックスによるものです。ハイブリッドマイクロ流体装置またはナリシゲマイクロマニピュレータ?.......

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Food B (Bloomington Recipe)	LabExpress	7001-NV	Food B, in narrow vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable	VWR	25384-342	Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable	VWR	25384-092	Diameter 60 x 15 mm
Glass capillaries	VWR	53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle	VWR	28450-150	Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet	ESCO	LA2-4A2-E
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Mineral oil	Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific	31911-A1
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond	3-000-207
Narrow Drosophila Vials, Polystyrene	Genesee Scientific	32-109
Needles, hypodermic	VWR	89219-316	22 G, 25 mm
Next Generation Micropipette Puller	World Precision Instruments	SU-P1000
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
Prism	GraphPad	Version 8
Syringes - plastic, disposable	VWR	76124-652	20 mL
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154