JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش للكشف عن سبوروزويتات الغدد اللعابية في البعوض. وباستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتاحة بسهولة، تتيح هذه الطريقة الكشف الفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية عن البعوض الذي يحمل المتصورة المنجلية أو المتصورة النشيطة. وهذه الطريقة مناسبة لبحوث انتقال الملاريا، بما في ذلك مسوحات النواقل.

Abstract

المتصورة sporozoites هي المرحلة المعدية من طفيليات الملاريا التي تصيب البشر. تنتقل الأسبوغات الموجودة في الغدد اللعابية لأنثى بعوض الأنوفيليس إلى البشر عن طريق لدغات البعوض أثناء تغذية الدم. وبالتالي فإن وجود sporozoites في الغدد اللعابية للبعوض يحدد عدوى البعوض. لتحديد ما إذا كانت بعوضة الأنوفيليس تحمل المتصورة sporozoites ، كانت طريقة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) هي الأداة القياسية للكشف عن بروتين Plasmodium circumsporozoite (CSP) ، وهو البروتين السطحي الرئيسي لل sporozoites. في هذه الطريقة ، يتم فصل الرأس مع الصدر لكل بعوضة عن البطن ، وتجانسها ، وتعريضها لشطيرة ELISA للكشف عن وجود CSP خاص بالمتصورة المنجلية وكل من النوعين الفرعيين ، VK210 و VK247 ، من المتصورة النشيطة. وقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة انتقال الملاريا، بما في ذلك الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وأنواع ناقلات الملاريا الرئيسية في مواقع الدراسة.

Introduction

Plasmodium sporozoites هي المرحلة المعدية من طفيليات الملاريا في البعوض. يتم تسليم sporozoites إلى البشر عن طريق لدغات البعوض. في البعوض ، تتشكل sporozoites أولا داخل البويضات على جدار الأمعاء الوسطى. بمجرد أن تصبح جاهزة ، يتم إطلاقها في الهيموكول والسفر إلى الغدد اللعابية البعوض. هناك ، تنضج وتصبح جاهزة للانتقال إلى البشر أثناء تغذية الدم. في البشر ، يتم ترسيب sporozoites في الأدمة. ثم يدخلون الأوعية الدموية ويسافرون على طول الدورة الدموية للوصول إلى الكبد لإثبات العدوى في خلايا الكبد 1,2.

تم استخدام ثلاث طرق مختلفة لتحديد عدوى sporozoite للغدد اللعابية البعوضية. الطريقة الأولى هي تشريح الغدد اللعابية متبوعا بالفحص المباشر للسبوروزويتات تحت المجهر الضوئي. هذه الطريقة هي المعيار الذهبي للكشف عن الأسبوغية وقياسها في الغدد اللعابية للبعوض Anopheles 3. ومع ذلك ، فإنه يتطلب فنيا مدربا جيدا في كل من التشريح والفحص المجهري. علاوة على ذلك ، لا يمكن استخدامه لتحديد أنواع البلازموديوم والتنميط الفرعي ل CSP (ل P. vivax)4,5. تستخدم الطريقة الثانية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للكشف عن الحمض النووي للبلازميوم في الجزء العلوي من جسم البعوض6. بالنظر إلى خصوصية PCR ، فإن كلا من الأنواع والأنواع الفرعية للطفيلي ممكنة7،8،9،10. على الرغم من استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل متزايد ، إلا أنه يتطلب معدات باهظة الثمن نسبيا وموظفين مدربين تدريبا جيدا. الطريقة الأخيرة ، ELISA للكشف عن بروتين محيطي البلازموديوم المحدد (CSP) ، كانت الدعامة الأساسية لمدة ثلاثة عقود11،12،13. يوجد CSP في كل من البويضات sporozoites و sporozoites الغدد اللعابية12،14. باستخدام أجسام مضادة محددة ، تسمح هذه الطريقة بتحديد أنواع البلازموديوم والتنميط الفرعي ل CSP ل P. vivax sporozoites. الأساس المنطقي لهذا الفحص هو اشتراط اختبار بسيط عالي الإنتاجية لفحص عدد كبير من البعوض البري لفهم انتقال الملاريا (أي تحديد معدل الإصابة بالأسبوروزويت).

تتميز طريقة ELISA بميزتين رئيسيتين على الفحص المجهري. أولا ، يسمح للباحثين بالاحتفاظ بعينات البعوض حتى تصبح جاهزة لمعالجة العينات. ثانيا ، يمكن استخدام طريقة ELISA للتمييز بين أنواع البلازموديوم من خلال الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة بالأنواع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تستوعب ELISA عددا أكبر من عينات البعوض ، مما يسمح بإنتاجية أعلى بكثير15. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل ، الذي يكتشف الحمض النووي للسبوروزويت ، يستغرق إجراء ELISA وقتا أطول ولكنه يكلفأقل 16. تم تطوير اختبار ELISA الموصوف هنا لتحديد عدوى البعوض والكشف بشكل منفصل عن CSP من P. falciparum وكل من متغيري CSP من P. vivax و VK210 و VK247. تم استخدام طريقة ELISA هذه في العديد من الدراسات لتحديد الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وتحديد أنواع ناقلات الملاريا الرئيسية في الحقل12،13،17،18. لإجراء هذا الفحص ، يكفي وجود مختبر قياسي مجهز بقارئ لوحة ELISA.

يتم تلخيص النهج العام في الشكل 1. في شطيرة ELISA هذه ، يتم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة الأساسي (التقاط) (mAb) الخاص بكل نوع / نوع فرعي من البلازموديوم لأول مرة لتغليف لوحة ELISA. كل لوحة مغلفة بالتقاط واحد mAb. وظيفة mAb هي التقاط مستضد CSP المقابل في متجانسات البعوض. بعد التقاط المستضد وغسل الصفيحة ، يتم استخدام جسم مضاد ثان خاص ب CSP يحمل علامة البيروكسيديز للكشف عن وجود CSP مرتبط ب mAb الملتقط. ينتج عن التفاعل الكيميائي الذي يحفزه البيروكسيديز تطور اللون في الآبار الإيجابية ل CSP.

Protocol

1. إعداد الكواشف

ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على قائمة بالمعدات والكواشف والمواد الاستهلاكية الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول وإلى الجدول 1 للحصول على قائمة بالحلول وتكوينها.

  1. التقاط و mAbs مترافق البيروكسيديز
    1. لإعادة تكوين mAb ، أعد تعليق mAb المجفف بالتجميد في خليط 1: 1 من الماء المقطر: الجلسرين عند 0.5 مجم / مل. قم بعمل الحصص حسب الحاجة لتجنب تكرار ذوبان الجليد ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. حظر المخزن المؤقت (BB)
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للحظر عن طريق إذابة 5 جم من الكازين بدرجة ELISA في 100 مل من 0.1 N NaOH. أضف 900 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (انظر الجدول 1) ليصل الحجم النهائي إلى 1.0 لتر.
    2. أضف 0.02 جم من الفينول الأحمر كمؤشر واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. قم بتخزين BB في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد ، أو القسمة إلى 50 مل للتخزين طويل الأجل عند -20 درجة مئوية.
  3. الضوابط الإيجابية
    1. لإعادة تكوين الضوابط الإيجابية ، أعد ترطيب البروتينات المجففة بالتجميد بإضافة 1000 ميكرولتر من BB. قم بعمل حصص من حلول التحكم الإيجابي في المخزون حسب الحاجة ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. للتخفيف التسلسلي ، قم بتخفيف كل عنصر تحكم إيجابي إلى تركيز العمل النهائي في BB على النحو التالي: Pf ، 2 بيكوغرام / ميكرولتر ؛ الكهروضوئية (VK210) ، 182 (بيكوغرام / ميكرولتر) ؛ الكهروضوئية (VK247) ، 89 بيكوغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: قد يختلف بالضبط تركيزات الضوابط الموجبة من دفعة إلى أخرى. راجع ورقة معلومات المنتج لمعرفة التركيز الدقيق المطلوب. تركيزات التحكم الإيجابية ، بدءا من تركيز العمل أعلاه ، هي 2 ، 1 ، 0.5 ، 0.25 ، 0.13 ، 0.06 بيكوغرام / ميكرولتر ل Pf ؛ 182 ، 91 ، 46 ، 23 ، 11 ، 5.7 بيكوغرام / ميكرولتر ل PV210 ؛ و 89 ، 45 ، 22 ، 11 ، 5.6 ، 2.8 بيكوغرام / ميكرولتر PV247.
  4. الضوابط السلبية
    ملاحظة: السيطرة السلبية المثالية هي تجانس الرأس والصدر لإناث بعوض الأنوفيلة المحضرة بشكل مماثل لعينات الاختبار. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام BB كعنصر تحكم سلبي.
    1. مع BB كعنصر تحكم سلبي ، استخدم عتبة الامتصاص 2 أضعاف للحصول على قراءات إيجابية موثوقة.

2. إعداد عينة البعوض

  1. افصل الرأس والصدر لكل بعوضة بالغة تم جمعها عن البطن بشفرة حلاقة معقمة. ضع الرأس والصدر في أنبوب طحن بالطرد المركزي سعة 1.5 مل محدد مسبقا. تجمع الرؤوس والصدر لما يصل إلى 10 بعوض إذا رغبت في ذلك.
    ملاحظة: لإعداد العينة ، عادة ، سيتم تشريح الغدة اللعابية من البعوض المصاب وتعريضها ل CS-ELISA. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام رأس وصدر البعوض الذي تم جمعه لأداء CS-ELISA مباشرة (دون تشريح الغدد اللعابية)12،13،19.
  2. أضف 50 ميكرولتر من محلول الطحن (GB) في كل أنبوب وقم بتجانس العينة بمدقة نظيفة (مغسولة بالصابون). شطف المدقة المستخدمة مع 250 ميكرولتر من GB في الأنبوب الذي يحتوي على البعوض (البعوض) متجانسة إلى حجم نهائي من ~ 300 ميكرولتر.
  3. احتفظ بالعينة في المجمد (-20 درجة مئوية) حتى الاستخدام أو تابع على الفور لإجراء ELISA.

3. سبوروزويت إليسا

  1. املأ ورقة عمل sporozoite ELISA (انظر المادة التكميلية 1). قم بإعداد لوحة ELISA واحدة لكل CSP (Pf أو Pv-210 أو Pv-247).
  2. تحضير محلول عمل mAb عن طريق إذابة الجسم المضاد في PBS: 4 ميكروغرام / مل Pf ؛ 2 ميكروغرام / مل PV-210 ؛ 2 ميكروغرام / مل من PV-247. احسب الأحجام المطلوبة بناء على إضافة 5 مل لكل لوحة. دوامة الحل بلطف.
  3. ماصة 50 ميكرولتر من كل محلول mAb عامل من الخطوة 3.2 في كل بئر من لوحة ELISA. غطي الطبق بغطاء بلاستيكي واحتضانه لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  4. استنشق محتويات البئر واضغط على اللوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية 5 مرات على الأقل لإزالة كل السوائل.
    ملاحظة: في حالة عدم توفر نظام شفط (شفط فراغ متعدد القنوات متصل بأطراف نظيفة) ، فقم بتفريغ الأجسام المضادة في الحوض ثم انقر فوق اللوحة الموجودة على مناشف ورقية.
  5. أضف 200 ميكرولتر من BB لملء جميع الآبار في اللوحة. غطي اللوحة بغطاء بلاستيكي. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نضح أو تفريغ محتويات البئر. اضغط على اللوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية 5 مرات لإزالة كل السوائل.
  6. تحميل متجانسة البعوض والسيطرة على لوحة على النحو التالي.
    1. أضف 50 ميكرولتر من التحكم الإيجابي إلى الآبار H1 و H2.
    2. أضف 50 ميكرولتر من BB إلى الآبار في العمودين 1 و 2 من الصف C إلى G. ثم أضف 50 ميكرولتر من التحكم الإيجابي في الآبار G1 و G2. قم بإجراء تخفيف تسلسلي للتحكم الإيجابي بدءا من G1 و G2 متبوعا ب F1 و F2 حتى C1 و C2.
      ملاحظة: يجب أن تحتوي جميع آبار التحكم الإيجابي على 50 ميكرولتر.
    3. أضف 50 ميكرولتر من BB (التحكم السلبي) إلى الآبار A1 و A2 و B1 و B2.
    4. أضف 50 ميكرولتر من كل عينة متجانسة إلى بئر غير معروف (Unk).
    5. غطي اللوحة واحتضانها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. بعد حوالي 2 ساعة ، ابدأ في تحضير الركائز. بالنسبة لمجموعة الركيزة المكونة من 2 مكون من ABTS ، امزج الركيزة A والركيزة B بنسبة 1: 1.
    ملاحظة: تتطلب اللوحة الكاملة المكونة من 96 بئرا 5 مل من الركيزة A و 5 مل من الركيزة B.
  8. قم بإعداد حلول العمل ل mAbs المسمى بالبيروكسيديز ل Pf و Pv-210 و Pv-247 عن طريق إضافة BB إلى mAb المترافق المعاد تشكيله للحصول على تركيز عمل قدره 1 ميكروغرام / مل.
    1. احسب الأحجام المطلوبة بناء على إضافة 5 مل من محلول mAb المترافق العامل لكل لوحة.
    2. اختبر نشاط البيروكسيديز عن طريق خلط 5 ميكرولتر من mAb المسمى بالبيروكسيديز المصنوع في الخطوة 3.8 مع 100 ميكرولتر من الركيزة المصنوعة في الخطوة 3.7 في أنبوب منفصل 1.5 مل. دوامة بلطف.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك تغيير سريع في اللون من واضح إلى أخضر ، مما يشير إلى أن إنزيم البيروكسيديز والركائز تعمل.
  9. قم بشفط أو تفريغ محتويات البئر واضغط على اللوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية 5 مرات لإزالة كل السوائل.
  10. اغسل الآبار مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS-Tween ، واستنشق محتويات البئر ، واضغط على اللوحة 5 مرات لكل منهما.
  11. أضف 50 ميكرولتر من mAb المسمى بالبيروكسيديز المصنوع في الخطوة 3.8 إلى كل بئر. غطي اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. نضح أو تفريغ محتويات البئر واضغط على اللوحة رأسا على عقب على منشفة ورقية 5 مرات.
  12. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS-Tween ، واستنشق محتويات البئر ، واضغط على اللوحة 5 مرات لكل منها.
  13. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة المحضر في الخطوة 3.7 إلى كل بئر. غطي الطبق واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  14. بعد 30 دقيقة ، اقرأ الامتصاص عند 405-414 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ELISA.
    ملاحظة: اتبع التعليمات المحددة لقارئ لوحات ELISA المستخدم. للحصول على تفاصيل حول التعليمات الخاصة بالبرنامج المستخدم لهذا البروتوكول ، راجع المواد التكميلية S2. يجب أن يكون هناك تغيير ملحوظ في اللون من واضح إلى أخضر في آبار التحكم الإيجابية.

4. التحليل

  1. الكشف عن العينات الإيجابية.
    1. قم بتسمية العينات ذات قيم الامتصاص أعلى من الحد الفاصل (ضعف متوسط قيمة الامتصاص للعينات السالبة) على أنها موجبة.
  2. القياس الكمي للطاقة الشمسية المركزة
    1. قم بتقدير تركيز CSP في العينة باستخدام المنحنى القياسي المبني من سلسلة تخفيف التحكم على النحو التالي.
      1. قم بإنشاء المنحنى القياسي عن طريق رسم قيم الامتصاص (المحور الصادي) لعناصر التحكم المخففة بشكل متسلسل مقابل تركيزاتها (المحور السيني).
      2. قم بإجراء الانحدار الخطي لتحديد أفضل ملاءمة باستخدام y = A + Bx ، حيث A و B معلمات مجانية.
      3. أوجد تركيز الطاقة الشمسية المركزة لكل عينة موجبة عن طريق حل معادلة قيمة امتصاص معطاة.

النتائج

تظهر نتائج ELISA التمثيلية في الشكل 2. في هذه التجربة ، اكتشفت P. falciparum ELISA عدوى sporozoite في البئر A7. يمكن اكتشاف البئر الموجب بصريا من خلال لونه الأخضر الباهت (الشكل 2 أ). كانت قيمة امتصاص هذا البئر أعلى من عتبة القطع (ضعف القيمة المتوسطة لآبار التحكم السلبية ال?...

Discussion

يوفر CSP-ELISA طريقة محددة للغاية وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن البلازموديوم CSP. يسمح بالتمييز بين P. falciparum و P. vivax sporozoites وكذلك بين النوعين الفرعيين ، VK210 و VK247 ، من P vivax11،13،14،15. يجب النظر في بعض النقاط الحر...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

نشكر السيد كيراكورن كياتيبوتر ، MVRU ، على التدريب والتوجيه. ونشكر أيضا السيدة بينيابات كونغنغين، MVRU، على مساعدتها التقنية في إعداد الشكل 2. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعهد الوطني للصحة (U19 AI089672).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
ELISA plate readerBioTek Instrument, Inc.Synergy H1Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestleAxygenPES-15-B-SIFor homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-componentKPL50-62-00For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB)Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs)Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
CaseinSigma aldrich9000-71-9For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB)Note: solution
Igepal CA-630Sigma aldrich9002-93-1For grinding buffer preparation
KClSigma aldrich7447-40-7For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4Sigma aldrich7778-77-0For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4Sigma aldrich7558-79-4For phosphate buffer saline preparation
NaClSigma aldrich7647-14-5For phosphate buffer saline preparation
NaOHSigma aldrich1310-73-2For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAbCDCPf-CAPFor capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAbCDCPf-HRPFor detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive controlCDCPf-PCPf positive control
Phenol redSigma aldrich143-74-8For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS)Note: solution
Positive controlsNote: solution
Pv210 capture mAbCDCPv210-CAPFor capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAbCDCPv210-HRPFor detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive controlCDCPv210-PCPv210 positive control
Pv247 capture mAbCDCPv247-CAPFor capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAbCDCPv247-HRPFor detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive controlCDCPv247-PCPv247 positive control
Tween20Sigma aldrich9005-64-5For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirsGenericFor working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVSCorning Life Science2797For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer glovesGenericFor personal protection
Lab gownGenericfor personal protection
Multichannel Pipette P30-300GenericFor solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000GenericFor solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µLGenericFor solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mLGenericFor solution transfer
Transfer pipettesGenericFor solution transfer

References

  1. Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
  2. Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
  3. World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , (1975).
  4. Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
  5. Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
  6. Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230 (2017).
  7. Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
  8. Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
  9. Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
  10. Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
  11. Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
  12. Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
  13. Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
  14. Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
  15. Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
  16. Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224 (2013).
  17. Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738 (2021).
  18. Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263 (2021).
  19. Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
  20. Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ELISA CSP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved