Détection de sporozoïtes de Plasmodium chez les anophèles à l’aide d’un test immuno-enzymatique

Résumé

Ce protocole décrit un test immuno-enzymatique sandwich pour détecter les sporozoïtes des glandes salivaires chez les moustiques. En utilisant des anticorps monoclonaux facilement disponibles, la méthode permet une détection rentable et à haut débit des moustiques porteurs de Plasmodium falciparum ou de Plasmodium vivax. La méthode convient à la recherche sur la transmission du paludisme, y compris les enquêtes vectorielles.

Résumé

Les sporozoïtes de Plasmodium sont le stade infectieux des parasites du paludisme qui infectent les humains. Les sporozoïtes résidant dans les glandes salivaires des moustiques anophèles femelles sont transmis à l’homme par les piqûres de moustiques lors de l’alimentation sanguine. La présence de sporozoïtes dans les glandes salivaires des moustiques définit donc l’infectiosité des moustiques. Pour déterminer si un moustique anophèle est porteur de sporozoïtes de Plasmodium, la méthode ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) a été l’outil standard pour détecter la protéine circumsporozoïte de Plasmodium (CSP), la principale protéine de surface des sporozoïtes. Dans cette méthode, la tête et le thorax de chaque moustique sont séparés de l’abdomen, homogénéisés et soumis à un ELISA sandwich pour détecter la présence de CSP spécifique à Plasmodium falciparum et à chacun des deux sous-types, VK210 et VK247, de Plasmodium vivax. Cette méthode a été utilisée pour étudier la transmission du paludisme, y compris la dynamique saisonnière de l’infection par les moustiques et les espèces des principaux vecteurs du paludisme dans les sites d’étude.

Introduction

Les sporozoïtes de Plasmodium sont le stade infectieux des parasites du paludisme chez les moustiques. Les sporozoïtes sont transmis aux humains par les piqûres de moustiques. Chez le moustique, les sporozoïtes se forment d’abord à l’intérieur des oocystes sur la paroi de l’intestin moyen. Une fois prêts, ils sont libérés dans l’hémocèle et se déplacent vers les glandes salivaires des moustiques. Là, ils mûrissent et deviennent prêts à être transmis à l’homme lors de l’alimentation sanguine. Chez l’homme, les sporozoïtes se déposent dans le derme. Ensuite, ils pénètrent dans le vaisseau sanguin et se déplacent le long de la circulation sanguine pour atteindre le foie afin d’établir une infection dans les hépatocytes ^1,2.

Trois méthodes différentes ont été utilisées pour déterminer l’infection par les glandes salivaires des moustiques à partir de sporozoïtes. La première méthode est la dissection des glandes salivaires suivie d’un examen direct des sporozoïtes au microscope optique. Cette méthode est l’étalon-or pour détecter et quantifier les sporozoïtes dans les glandes salivaires des moustiques anophèles ³. Cependant, elle nécessite un technicien bien formé à la fois à la dissection et à l’examen microscopique. De plus, il ne peut pas être utilisé pour déterminer l’espèce de Plasmodium et le sous-typage CSP (pour P. vivax)^4,5. La deuxième méthode utilise la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour détecter l’ADN de Plasmodium dans la partie supérieure du corps du moustique⁶. Compte tenu de la spécificité de la PCR, les deux espèces et le sous-typage du parasite sont possibles 7,8,9,10. Bien que la PCR soit de plus en plus utilisée, elle nécessite un équipement relativement coûteux et un personnel bien formé. La dernière méthode, l’ELISA, pour détecter la protéine circumsporozoïte spécifique de Plasmodium (CSP), est le pilier depuis trois décennies 11,12,13. La CSP est présente à la fois dans les sporozoïtes d’oocystes et les sporozoïtes des glandes salivaires^12,14. À l’aide d’anticorps spécifiques, cette méthode permet d’identifier les espèces de Plasmodium et de sous-typage CSP des sporozoïtes de P. vivax. La raison d’être de ce test est la nécessité d’un simple test à haut débit pour examiner un grand nombre de moustiques sauvages afin de comprendre la transmission du paludisme (c’est-à-dire de déterminer le taux d’infection par les sporozoïtes).

La méthode ELISA présente deux avantages clés par rapport à l’examen microscopique. Tout d’abord, il permet aux chercheurs de conserver des échantillons de moustiques jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le traitement des échantillons. Deuxièmement, la méthode ELISA peut être utilisée pour différencier les espèces de Plasmodium à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques à l’espèce. De plus, l’ELISA peut accueillir un plus grand nombre d’échantillons de moustiques, ce qui permet un débit beaucoup plus élevé¹⁵. Par rapport à la PCR, qui détecte l’ADN des sporozoïtes, la procédure ELISA prend plus de temps mais coûte moins cher¹⁶. Le test ELISA décrit ici a été mis au point pour déterminer l’infectiosité des moustiques et détecter séparément le CSP de P. falciparum et chacun des deux variants du CSP de P. vivax, VK210 et VK247. Cette méthode ELISA a été utilisée dans de nombreuses études pour déterminer la dynamique saisonnière de l’infection par les moustiques et identifier les espèces des principaux vecteurs du paludisme sur le terrain 12,13,17,18. Pour réaliser ce test, un laboratoire standard équipé d’un lecteur de plaques ELISA suffit.

L’approche globale est résumée à la figure 1. Dans cet ELISA sandwich, l’anticorps monoclonal (mAb) primaire (capture) spécifique de chaque espèce/sous-type de Plasmodium est d’abord utilisé pour enrober la plaque ELISA. Chaque plaque est recouverte d’un seul anticorps monoclonal de capture. La fonction de l’anticorps monoclonal est de capturer l’antigène CSP correspondant dans l’homogénat du moustique. Après la capture de l’antigène et le lavage des plaques, un deuxième anticorps spécifique du CSP marqué à la peroxydase est utilisé pour détecter la présence de CSP lié à l’AcM de capture. La réaction chimique catalysée par la peroxydase entraîne le développement de la couleur dans les puits positifs pour la CSP.

Protocole

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : Reportez-vous au tableau des matériaux pour une liste des équipements, réactifs et autres consommables utilisés dans ce protocole et au tableau 1 pour une liste des solutions et de leur composition.

1. Anticorps monoclonaux de capture et conjugués à la peroxydase
   1. Pour reconstituer l’AcM, il faut remettre en suspension l’AcM lyophilisé dans un mélange 1:1 d’eau distillée et de glycérol à 0,5 mg/mL. Faites des aliquotes au besoin pour éviter la congélation-décongélation répétée et conservez-les à -20 °C.
2. Tampon de blocage (BB)
   1. Préparez le tampon de blocage en dissolvant 5 g de caséine de qualité ELISA dans 100 mL de NaOH 0,1 N. Ajouter 900 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (voir le tableau 1) pour porter le volume final à 1,0 L.
   2. Ajouter 0,02 g de rouge de phénol comme indicateur et ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Conserver BB à 4 °C jusqu’à une semaine, ou aliquote dans 50 mL pour un stockage à long terme à -20 °C.
3. Contrôles positifs
   1. Pour reconstituer les témoins positifs, réhydratez les protéines lyophilisées en ajoutant 1 000 μL de BB. Faites des aliquotes des solutions de contrôle positif de base au besoin et stockez-les à -20 °C.
   2. Pour la dilution en série, diluer davantage chaque témoin positif jusqu’à la concentration de travail finale en BB comme suit : Pf, 2 pg/μL ; Pv (VK210), 182 (pg/μL) ; Pv (VK247), 89 pg/μL.
      REMARQUE : Les concentrations exactes des témoins positifs peuvent varier d’un lot à l’autre. Consultez la fiche d’information du produit pour connaître la concentration exacte nécessaire. Les concentrations des témoins positifs, à partir de la concentration de travail ci-dessus, sont de 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL pour Pf ; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μL pour PV210 ; et 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 pg/μL PV247.
4. Contrôles négatifs
   REMARQUE : Le contrôle négatif idéal est l’homogénat tête-thorax des moustiques anophèles femelles préparés de la même manière que les échantillons d’essai. Cependant, BB peut également être utilisé comme contrôle négatif.
   1. Avec BB comme contrôle négatif, utilisez le seuil d’absorbance 2 fois pour des lectures positives fiables.

2. Préparation de l’échantillon de moustique

1. Séparez la tête et le thorax de chaque moustique adulte collecté de l’abdomen avec une lame de rasoir stérile. Placez la tête et le thorax dans un tube de broyage centrifuge pré-étiqueté de 1,5 ml. Têtes de piscine et thoraces de jusqu’à 10 moustiques si vous le souhaitez.
   REMARQUE : Pour la préparation de l’échantillon, généralement, la glande salivaire d’un moustique infecté sera disséquée et soumise à CS-ELISA. Cependant, la tête et le thorax des moustiques collectés peuvent également être utilisés pour effectuer directement des CS-ELISA (sans dissection des glandes salivaires)12,13,19.
2. Ajoutez 50 μL de tampon de broyage (GB) dans chaque tube et homogénéisez l’échantillon avec un pilon propre (lavé au savon). Rincez le pilon usagé avec 250 μL de GB dans le tube contenant le(s) moustique(s) homogénéisé(s) jusqu’à un volume final de ~300 μL.
3. Conservez l’échantillon dans un congélateur (-20 °C) jusqu’à ce qu’il soit utilisé ou procédez immédiatement à l’exécution de l’ELISA.

3. ELISA de sporozoïte

1. Remplissez la feuille de travail ELISA pour les sporozoïtes (voir le matériel supplémentaire 1). Préparez une plaque ELISA pour chaque CSP (Pf, Pv-210 ou Pv-247).
2. Préparez la solution de travail de capture d’AcM en dissolvant l’anticorps dans du PBS : 4 μg/mL Pf ; 2 μg/mL de Pv-210 ; 2 μg/mL de Pv-247. Calculer les volumes requis en fonction de l’ajout de 5 mL par plaque. Vortex la solution doucement.
3. Pipeter 50 μL de chaque solution d’anticorps monoclonaux de travail de l’étape 3.2 dans chaque puits de la plaque ELISA. Couvrez l’assiette avec un couvercle en plastique et laissez incuber pendant 30 minutes ou toute la nuit à température ambiante.
4. Aspirez le contenu du puits et tapotez l’assiette à l’envers sur du papier absorbant au moins 5 fois pour enlever tout le liquide.
   REMARQUE : Si un système d’aspiration (aspiration sous vide multicanaux connectée à des pointes propres) n’est pas disponible, videz les anticorps dans l’évier, puis tapotez l’assiette sur des serviettes en papier.
5. Ajouter 200 μL de BB pour remplir tous les puits de la plaque. Couvrez l’assiette avec un couvercle en plastique. Incuber la plaque pendant 1 h à température ambiante. Aspirez ou videz le contenu du puits. Tapotez l’assiette à l’envers sur du papier absorbant 5 fois pour enlever tout le liquide.
6. Chargez l’homogénat de moustiques et la commande sur la plaque comme suit.
   1. Ajouter 50 μL du témoin positif dans les puits H1 et H2.
   2. Ajouter 50 μL de BB dans les puits des colonnes 1 et 2 de la rangée C à G. Ensuite, ajoutez 50 μL du témoin positif dans les puits G1 et G2. Effectuez une dilution en série du témoin positif en commençant par G1 et G2 suivi de F1 et F2 jusqu’à C1 et C2.
      REMARQUE : Tous les puits de contrôle positif doivent contenir 50 μL.
   3. Ajoutez 50 μL de BB (témoin négatif) dans les puits A1, A2, B1 et B2.
   4. Ajouter 50 μL de chaque échantillon d’homogénat dans un puits inconnu (Unk).
   5. Couvrez la plaque et laissez incuber pendant 2 h à température ambiante.
7. Après environ 2 h, commencez à préparer les substrats. Pour le kit de substrat ABTS à 2 composants, mélangez le substrat A et le substrat B dans un rapport de 1:1.
   REMARQUE : Une plaque complète de 96 puits nécessite 5 ml de substrat A et 5 mL de substrat B.
8. Préparez les solutions de travail d’anticorps monoclonaux marqués à la peroxydase pour Pf, Pv-210 et Pv-247 en ajoutant BB à l’anticorps monoclonal conjugué reconstitué pour obtenir une concentration de travail de 1 μg/mL.
   1. Calculer les volumes requis en fonction de l’ajout de 5 mL de solution conjuguée d’AcM par plaque.
   2. Testez l’activité de la peroxydase en mélangeant 5 μL de l’AcM marqué à la peroxydase fabriqué à l’étape 3.8 avec 100 μL du substrat fabriqué à l’étape 3.7 dans un tube séparé de 1,5 mL. Vortex doucement.
      REMARQUE : Il devrait y avoir un changement rapide de couleur du clair au vert, indiquant que l’enzyme peroxydase et les substrats fonctionnent.
9. Aspirez ou videz le contenu du puits et tapotez l’assiette à l’envers sur des serviettes en papier 5 fois pour enlever tout le liquide.
10. Lavez les puits deux fois avec 200 μL de PBS-Tween, aspirez le contenu du puits et tapotez la plaque 5 fois chacun.
11. Ajouter 50 μL d’anticorps monoclonaux marqués à la peroxydase effectués à l’étape 3.8 dans chaque puits. Couvrez l’assiette et laissez incuber 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Aspirez ou videz le contenu du puits et tapotez l’assiette à l’envers sur une serviette en papier 5 fois.
12. Lavez les puits 3 fois avec 200 μL de PBS-Tween, aspirez le contenu du puits et tapotez la plaque 5 fois chacun.
13. Ajouter 100 μL de la solution de substrat préparée à l’étape 3.7 dans chaque puits. Couvrez l’assiette et laissez incuber 30 min à température ambiante dans l’obscurité.
14. Après 30 min, lire l’absorbance à 405-414 nm à l’aide d’un lecteur de plaques ELISA.
    REMARQUE : Suivez les instructions spécifiques pour le lecteur de plaque ELISA utilisé. Pour plus de détails sur les instructions du logiciel utilisé pour ce protocole, reportez-vous au matériel supplémentaire S2. Il devrait y avoir un changement de couleur notable du clair au vert dans les puits de contrôle positif.

4. Analyse

1. Détection d’échantillons positifs.
   1. Étiquetez les échantillons dont les valeurs d’absorbance sont supérieures au seuil (deux fois la valeur d’absorbance moyenne des échantillons négatifs) comme étant positifs.
2. Quantification du CSP
   1. Estimez la concentration de CSP dans l’échantillon à l’aide de la courbe standard construite à partir de la série de dilutions témoins, comme suit.
      1. Créez la courbe standard en traçant les valeurs d’absorbance (axe y) des témoins dilués en série par rapport à leurs concentrations (axe x).
      2. Effectuez une régression linéaire pour déterminer le meilleur ajustement à l’aide de y = A + Bx, où A et B sont des paramètres libres.
      3. Déterminez la concentration de CSP pour chaque échantillon positif en résolvant l’équation d’une valeur d’absorbance donnée.

Résultats

Les résultats ELISA représentatifs sont présentés à la figure 2. Dans cette expérience, l’ELISA de P. falciparum a détecté une infection par des sporozoïtes dans le puits A7. Le puits positif a pu être détecté visuellement par sa faible couleur verte (Figure 2A). La valeur d’absorbance de ce puits était supérieure au seuil de coupure (deux fois la valeur moyenne des quatre puits de contrôle négatifs) (figure 2B

Discussion

Le CSP-ELISA fournit une méthode très spécifique et rentable pour détecter le CSP de Plasmodium. Il permet la discrimination entre les sporozoïtes de P. falciparum et de P. vivax ainsi qu’entre les deux sous-types, VK210 et VK247, de P vivax 11,13,14,15. Certains points critiques doivent être pris en compte pour obtenir des résultats fiables et repro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
ELISA plate reader	BioTek Instrument, Inc.	Synergy H1	Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestle	Axygen	PES-15-B-SI	For homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-component	KPL	50-62-00	For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB)			Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs)			Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
Casein	Sigma aldrich	9000-71-9	For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB)			Note: solution
Igepal CA-630	Sigma aldrich	9002-93-1	For grinding buffer preparation
KCl	Sigma aldrich	7447-40-7	For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4	Sigma aldrich	7778-77-0	For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4	Sigma aldrich	7558-79-4	For phosphate buffer saline preparation
NaCl	Sigma aldrich	7647-14-5	For phosphate buffer saline preparation
NaOH	Sigma aldrich	1310-73-2	For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAb	CDC	Pf-CAP	For capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAb	CDC	Pf-HRP	For detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive control	CDC	Pf-PC	Pf positive control
Phenol red	Sigma aldrich	143-74-8	For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS)			Note: solution
Positive controls			Note: solution
Pv210 capture mAb	CDC	Pv210-CAP	For capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAb	CDC	Pv210-HRP	For detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive control	CDC	Pv210-PC	Pv210 positive control
Pv247 capture mAb	CDC	Pv247-CAP	For capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAb	CDC	Pv247-HRP	For detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive control	CDC	Pv247-PC	Pv247 positive control
Tween20	Sigma aldrich	9005-64-5	For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirs	Generic		For working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS	Corning Life Science	2797	For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer gloves	Generic		For personal protection
Lab gown	Generic		for personal protection
Multichannel Pipette P30-300	Generic		For solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000	Generic		For solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL	Generic		For solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mL	Generic		For solution transfer
Transfer pipettes	Generic		For solution transfer