使用酶联免疫吸附测定法检测按蚊中的疟原虫孢子

摘要

该方案描述了一种夹心酶联免疫吸附测定法，用于检测蚊子中的唾液腺孢子体。该方法使用容易获得的单克隆抗体，能够经济高效地检测携带 恶性疟原虫 或 间日疟原虫的蚊子。该方法适用于疟疾传播研究，包括病媒调查。

摘要

疟 原虫孢子是感染人类的疟疾寄生虫的感染阶段。寄生子存在于雌性 按蚊 的唾液腺中的孢子体在吸血过程中通过蚊子叮咬传播给人类。因此，蚊子唾液腺中孢子的存在决定了蚊子的传染性。为了确定 按蚊 是否携带子 疟 原虫，酶联免疫吸附测定 （ELISA） 方法一直是检测环孢 子疟 原虫蛋白 （CSP） 的标准工具，CSP 是子孢子体的主要表面蛋白。在这种方法中，将每只蚊子的头部和胸部与腹部分离，均质化，并进行夹心 ELISA 以检测 恶性疟 原虫和 间日疟原虫的两种亚型 VK210 和 VK247 中的每一个都具有特异性的 CSP。该方法已被用于研究疟疾传播，包括蚊子感染的季节性动态和研究地点中主要疟疾病媒的种类。

引言

疟原虫孢子体是疟疾寄生虫在蚊子中的传染阶段。孢子体通过蚊虫叮咬传递给人类。在蚊子中，子孢子首先在中肠壁的卵囊内形成。一旦准备好，它们就会被释放到血腔中并进入蚊子唾液腺。在那里，它们成熟并准备好在血液喂养期间传播给人类。在人类中，子孢子沉积在真皮中。然后，它们进入血管并沿着血液循环行进，到达肝脏，在肝细胞中建立感染 ^1,2。

已使用三种不同的方法确定蚊子唾液腺的孢子体感染。第一种方法是解剖唾液腺，然后在光学显微镜下直接检查子孢子。该方法是检测和定量按蚊唾液腺中孢子体的金标准³.然而，它需要一名在解剖和显微镜检查方面都训练有素的技术人员。此外，它不能用于确定疟原虫种类和CSP亚型（间日疟原虫）^4,5。第二种方法使用聚合酶链反应（PCR）检测^蚊子体上部的疟原虫DNA6。鉴于PCR的特异性，寄生虫的种类和亚型都是可能的7,8,9,10。

研究方案

1.试剂的制备

注：有关本协议中使用的设备，试剂和其他消耗品的清单，请参阅 材料表 ，请参阅 表1 以获取溶液及其组成的清单。

1. 捕获和过氧化物酶偶联的单克隆抗体
   1. 要复溶 mAb，应将冻干的 mAb 重悬于 0.5 mg/mL 的蒸馏水：甘油 1：1 混合物中。根据需要制作等分试样以避免反复冻融，并将它们储存在-20°C。
2. 阻塞缓冲液 （BB）
   1. 通过将 5 g ELISA 级酪蛋白溶解在 100 mL 的 0.1 N NaOH 中来制备封闭缓冲液。加入 900 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（见 表 1）以使最终体积达到 1.0 L。
   2. 加入0.02g酚红作为指示剂，并用HCl调节pH至7.4。 将BB在4°C下储存长达一周，或分装成50mL，在-20°C下长期储存。
3. 阳性对照
   1. 为了复溶阳性对照，通过加入 1,000 μL BB 对冻干蛋白进行再水化。根据需要制备储备阳性对照溶液的等分试样，并将其储存在-20°C。
   2. 对于连续稀释，进一步将每个阳性对照稀释至BB中的最终工作浓度，如下所示：Pf，2pg / μL;Pv （VK210）， 182 （皮克/微升....

结果

代表性ELISA结果 如图2所示。在该实验中， 恶性疟原虫 ELISA在A7孔中检测到子孢子感染。正孔可以通过其微弱的绿色在视觉上检测到（图2A）。该孔的吸光度值高于临界阈值（四个阴性对照孔平均值的两倍）（图2B）。所有80个未知孔的吸光度值分布如图 2C所示。减去背景（阴性对照）后，通过板内标准.......

讨论

CSP-ELISA提供了一种高度特异性和成本效益的方法来检测疟原虫CSP。它允许区分恶性疟原虫和间日疟原虫孢子体，以及间日疟原虫 ^{11、13、14、15} 的两种亚型 VK210 和 VK247。应考虑某些临界点以获得可靠且可重复的结果。所有溶液应在冰箱中保存少于 1 周，以防止微生物生长。mA.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
ELISA plate reader	BioTek Instrument, Inc.	Synergy H1	Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestle	Axygen	PES-15-B-SI	For homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-component	KPL	50-62-00	For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB)			Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs)			Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
Casein	Sigma aldrich	9000-71-9	For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB)			Note: solution
Igepal CA-630	Sigma aldrich	9002-93-1	For grinding buffer preparation
KCl	Sigma aldrich	7447-40-7	For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4	Sigma aldrich	7778-77-0	For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4	Sigma aldrich	7558-79-4	For phosphate buffer saline preparation
NaCl	Sigma aldrich	7647-14-5	For phosphate buffer saline preparation
NaOH	Sigma aldrich	1310-73-2	For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAb	CDC	Pf-CAP	For capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAb	CDC	Pf-HRP	For detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive control	CDC	Pf-PC	Pf positive control
Phenol red	Sigma aldrich	143-74-8	For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS)			Note: solution
Positive controls			Note: solution
Pv210 capture mAb	CDC	Pv210-CAP	For capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAb	CDC	Pv210-HRP	For detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive control	CDC	Pv210-PC	Pv210 positive control
Pv247 capture mAb	CDC	Pv247-CAP	For capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAb	CDC	Pv247-HRP	For detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive control	CDC	Pv247-PC	Pv247 positive control
Tween20	Sigma aldrich	9005-64-5	For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirs	Generic		For working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS	Corning Life Science	2797	For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer gloves	Generic		For personal protection
Lab gown	Generic		for personal protection
Multichannel Pipette P30-300	Generic		For solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000	Generic		For solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL	Generic		For solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mL	Generic		For solution transfer
Transfer pipettes	Generic		For solution transfer