使用酶联免疫吸附测定法检测按蚊中的疟原虫孢子

摘要

该方案描述了一种夹心酶联免疫吸附测定法，用于检测蚊子中的唾液腺孢子体。该方法使用容易获得的单克隆抗体，能够经济高效地检测携带 恶性疟原虫 或 间日疟原虫的蚊子。该方法适用于疟疾传播研究，包括病媒调查。

摘要

疟 原虫孢子是感染人类的疟疾寄生虫的感染阶段。寄生子存在于雌性 按蚊 的唾液腺中的孢子体在吸血过程中通过蚊子叮咬传播给人类。因此，蚊子唾液腺中孢子的存在决定了蚊子的传染性。为了确定 按蚊 是否携带子 疟 原虫，酶联免疫吸附测定 （ELISA） 方法一直是检测环孢 子疟 原虫蛋白 （CSP） 的标准工具，CSP 是子孢子体的主要表面蛋白。在这种方法中，将每只蚊子的头部和胸部与腹部分离，均质化，并进行夹心 ELISA 以检测 恶性疟 原虫和 间日疟原虫的两种亚型 VK210 和 VK247 中的每一个都具有特异性的 CSP。该方法已被用于研究疟疾传播，包括蚊子感染的季节性动态和研究地点中主要疟疾病媒的种类。

引言

疟原虫孢子体是疟疾寄生虫在蚊子中的传染阶段。孢子体通过蚊虫叮咬传递给人类。在蚊子中，子孢子首先在中肠壁的卵囊内形成。一旦准备好，它们就会被释放到血腔中并进入蚊子唾液腺。在那里，它们成熟并准备好在血液喂养期间传播给人类。在人类中，子孢子沉积在真皮中。然后，它们进入血管并沿着血液循环行进，到达肝脏，在肝细胞中建立感染 ^1,2。

已使用三种不同的方法确定蚊子唾液腺的孢子体感染。第一种方法是解剖唾液腺，然后在光学显微镜下直接检查子孢子。该方法是检测和定量按蚊唾液腺中孢子体的金标准³.然而，它需要一名在解剖和显微镜检查方面都训练有素的技术人员。此外，它不能用于确定疟原虫种类和CSP亚型（间日疟原虫）^4,5。第二种方法使用聚合酶链反应（PCR）检测^蚊子体上部的疟原虫DNA6。鉴于PCR的特异性，寄生虫的种类和亚型都是可能的7,8,9,10。尽管PCR的使用越来越多，但它需要相对昂贵的设备和训练有素的工作人员。最后一种方法是检测疟原虫特异性环孢子蛋白 （CSP） 的 ELISA，三十年来一直是主要方法 11,12,13。CSP 存在于卵囊孢子体和唾液腺孢子体中^12,14。使用特异性抗体，该方法可以鉴定疟原虫种类和间日疟原虫孢子体的CSP亚型。该测定的基本原理是需要一种简单的高通量测定法来检查大量野生蚊子以了解疟疾传播（即确定子孢子体感染率）。

与显微镜检查相比，ELISA方法有两个关键优势。首先，它允许研究人员保留蚊子样本，直到它们准备好进行样本处理。其次，ELISA方法可用于通过物种特异性单克隆抗体区分疟原虫属。此外，ELISA 可以容纳更多的蚊子标本，从而实现更高的通量¹⁵。与检测孢子体 DNA 的 PCR 相比，ELISA 程序花费更多时间，但成本更低¹⁶。本文所述的 ELISA 测定法是为了确定蚊子传染性并分别检测恶性疟原虫和间日疟原虫的两种 CSP 变体 VK210 和 VK247 的 CSP 中的每一种。这种ELISA方法已被许多研究用于确定蚊子感染的季节性动态，并确定该领域主要疟疾病媒的种类12,13,17,18。为了进行该测定，配备ELISA酶标仪的标准实验室就足够了。

图 1 总结了总体方法。在这种夹心 ELISA 中，首先使用对每种疟原虫种类/亚型具有特异性的一抗（捕获）单克隆抗体 （mAb） 来包被 ELISA 板。每个板都涂有单个捕获单克隆抗体。mAb的功能是在蚊子匀浆中捕获相应的CSP抗原。抗原捕获和洗板后，使用用过氧化物酶标记的第二种 CSP 特异性抗体来检测是否存在与捕获 mAb 结合的 CSP。过氧化物酶催化的化学反应导致 CSP 阳性孔中的颜色显色。

研究方案

1.试剂的制备

注:有关本协议中使用的设备，试剂和其他消耗品的清单，请参阅 材料表 ，请参阅 表1 以获取溶液及其组成的清单。

1. 捕获和过氧化物酶偶联的单克隆抗体
   1. 要复溶 mAb，应将冻干的 mAb 重悬于 0.5 mg/mL 的蒸馏水:甘油 1:1 混合物中。根据需要制作等分试样以避免反复冻融，并将它们储存在-20°C。
2. 阻塞缓冲液 （BB）
   1. 通过将 5 g ELISA 级酪蛋白溶解在 100 mL 的 0.1 N NaOH 中来制备封闭缓冲液。加入 900 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（见 表 1）以使最终体积达到 1.0 L。
   2. 加入0.02g酚红作为指示剂，并用HCl调节pH至7.4。 将BB在4°C下储存长达一周，或分装成50mL，在-20°C下长期储存。
3. 阳性对照
   1. 为了复溶阳性对照，通过加入 1,000 μL BB 对冻干蛋白进行再水化。根据需要制备储备阳性对照溶液的等分试样，并将其储存在-20°C。
   2. 对于连续稀释，进一步将每个阳性对照稀释至BB中的最终工作浓度，如下所示:Pf，2pg / μL;Pv （VK210）， 182 （皮克/微升）;PV （VK247），89 皮克/微升。
      注意:阳性对照的确切浓度可能因批次而异。请查阅产品信息表，了解所需的确切浓度。从上述工作浓度开始，Pf的阳性对照浓度为2、1、0.5、0.25、0.13、0.06 pg/μL;PV210为182、91、46、23、11、5.7 pg/μL;和 89、45、22、11、5.6、2.8 pg/μL PV247。
4. 阴性对照
   注:理想的阴性对照是与测试样品制备相同的雌性按蚊的头胸匀浆。但是，BB也可以用作阴性对照。
   1. 以 BB 为阴性对照，使用 2 倍吸光度阈值获得可靠的阳性读数。

2. 蚊子样品制备

1. 用无菌剃须刀片将每只收集的成年蚊子的头部和胸部与腹部分开。将头部和胸部放入预先标记的 1.5 mL 离心研磨管中。如果需要，最多可容纳 10 只蚊子的池头和蚊子。
   注意:对于样品制备，通常，来自受感染蚊子的唾液腺将被解剖并进行 CS-ELISA。然而，收集的蚊子的头部和胸部也可用于直接进行CS-ELISA（无需解剖唾液腺）12,13,19。
2. 向每个试管中加入 50 μL 研磨缓冲液 （GB），并用干净的研杵（用肥皂清洗）均质化样品。用 250 μL GB 将用过的研杵冲洗到装有均质蚊子的管中，最终体积为 ~300 μL。
3. 将样品保存在冰箱（-20°C）中直至使用或立即进行ELISA。

3. 子孢子 ELISA

1. 填写子孢子 ELISA 工作表（参见 补充材料 1）。为每个 CSP（Pf、Pv-210 或 Pv-247）准备一个 ELISA 板。
2. 通过将抗体溶解在 PBS 中来制备捕获 mAb 工作溶液:4 μg/mL Pf;2微克/毫升Pv-210;2 μg/mL 的 Pv-247。 根据每板添加 5 mL 计算所需的体积。轻轻涡旋溶液。
3. 将步骤 3.2 中的每种工作 mAb 溶液吸取 50 μL 到 ELISA 板的每个孔中。用塑料盖盖住板，在室温下孵育 30 分钟或过夜。
4. 吸出孔内容物，将板倒置在纸巾上至少 5 次，以去除所有液体。
   注意: 如果没有抽吸系统（连接到清洁吸头的多通道真空吸力），请将抗体倒入水槽中，然后用纸巾敲击板。
5. 加入 200 μL BB 以填充板中的所有孔。用塑料盖盖住板。将板在室温下孵育1小时。吸出或倾倒井内容物。将盘子倒置在纸巾上敲击 5 次以去除所有液体。
6. 将蚊子匀浆和对照品装入板上，如下所示。
   1. 向孔 H1 和 H2 中加入 50 μL 阳性对照。
   2. 向第 1 列和第 2 列的孔中加入 50 μL BB，从 C 行到 G 行。然后，将 50 μL 阳性对照加入孔 G1 和 G2 中。从 G1 和 G2 开始对阳性对照进行连续稀释，然后是 F1 和 F2，直到 C1 和 C2。
      注:所有阳性对照孔应含有 50 μL。
   3. 向孔 A1、A2、B1 和 B2 中加入 50 μL BB（阴性对照）。
   4. 将 50 μL 每种匀浆样品加入未知 （Unk） 孔中。
   5. 盖上板，在室温下孵育2小时。
7. 大约2小时后，开始准备底物。对于 ABTS 底物 2 组分试剂盒，以 1:1 的比例混合底物 A 和底物 B。
   注:完整的 96 孔板需要 5 mL 底物 A 和 5 mL 底物 B。
8. 通过将 BB 添加到重构的偶联单克隆抗体中，制备过氧化物酶标记的 mAb 的 Pf、Pv-210 和 Pv-247 的工作溶液，以获得 1 μg/mL 的工作浓度。
   1. 根据每板添加 5 mL 工作偶联 mAb 溶液计算所需体积。
   2. 通过将 5 μL 步骤 3.8 中制备的过氧化物酶标记的 mAb 与步骤 3.7 中制备的 100 μL 底物在单独的 1.5 mL 管中混合来测试过氧化物酶活性。轻轻涡旋。
      注意:应该有从透明到绿色的快速颜色变化，表明过氧化物酶和底物正在工作。
9. 吸出或倾倒孔内容物，然后将板倒置在纸巾上敲击 5 次以去除所有液体。
10. 用 200 μL PBS-Tween 洗涤孔两次，吸出孔内容物，每次敲击板 5 次。
11. 向每个孔中加入 50 μL 在步骤 3.8 中制备的过氧化物酶标记的 mAb。盖上板，在室温下在黑暗中孵育1小时。吸出或倾倒孔内容物，然后将板倒置在纸巾上 5 次。
12. 用 200 μL PBS-Tween 洗涤孔 3 次，吸出孔内容物，每次敲击板 5 次。
13. 向每个孔中加入 100 μL 在步骤 3.7 中制备的底物溶液。盖上板，在室温下黑暗孵育30分钟。
14. 30分钟后，使用ELISA酶标仪读取405-414nm处的吸光度。
    注意:请按照所用 ELISA 酶标仪的具体说明进行操作。有关用于此协议的软件说明的详细信息，请参阅 补充材料 S2。在阳性对照孔中，应有明显的颜色变化，从透明变为绿色。

第4章 分析

1. 检测阳性样本。
   1. 将吸光度值高于临界值（阴性样品平均吸光度值的两倍）的样品标记为阳性。
2. 量化 CSP
   1. 使用由对照稀释系列构建的标准曲线估计样品中的CSP浓度，如下所示。
      1. 通过绘制连续稀释对照的吸光度值（y 轴）与其浓度（x 轴）的关系图来创建标准曲线。
      2. 执行线性回归以使用 y = A + Bx 确定最佳拟合，其中 A 和 B 是自由参数。
      3. 通过求解给定吸光度值的方程来确定每个阳性样品的 CSP 浓度。

结果

代表性ELISA结果 如图2所示。在该实验中， 恶性疟原虫 ELISA在A7孔中检测到子孢子感染。正孔可以通过其微弱的绿色在视觉上检测到（图2A）。该孔的吸光度值高于临界阈值（四个阴性对照孔平均值的两倍）（图2B）。所有80个未知孔的吸光度值分布如图 2C所示。减去背景（阴性对照）后，通过板内标准...

讨论

CSP-ELISA提供了一种高度特异性和成本效益的方法来检测疟原虫CSP。它允许区分恶性疟原虫和间日疟原虫孢子体，以及间日疟原虫 ^{11、13、14、15} 的两种亚型 VK210 和 VK247。应考虑某些临界点以获得可靠且可重复的结果。所有溶液应在冰箱中保存少于 1 周，以防止微生物生长。mA...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
ELISA plate reader	BioTek Instrument, Inc.	Synergy H1	Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestle	Axygen	PES-15-B-SI	For homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-component	KPL	50-62-00	For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB)			Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs)			Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
Casein	Sigma aldrich	9000-71-9	For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB)			Note: solution
Igepal CA-630	Sigma aldrich	9002-93-1	For grinding buffer preparation
KCl	Sigma aldrich	7447-40-7	For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4	Sigma aldrich	7778-77-0	For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4	Sigma aldrich	7558-79-4	For phosphate buffer saline preparation
NaCl	Sigma aldrich	7647-14-5	For phosphate buffer saline preparation
NaOH	Sigma aldrich	1310-73-2	For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAb	CDC	Pf-CAP	For capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAb	CDC	Pf-HRP	For detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive control	CDC	Pf-PC	Pf positive control
Phenol red	Sigma aldrich	143-74-8	For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS)			Note: solution
Positive controls			Note: solution
Pv210 capture mAb	CDC	Pv210-CAP	For capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAb	CDC	Pv210-HRP	For detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive control	CDC	Pv210-PC	Pv210 positive control
Pv247 capture mAb	CDC	Pv247-CAP	For capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAb	CDC	Pv247-HRP	For detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive control	CDC	Pv247-PC	Pv247 positive control
Tween20	Sigma aldrich	9005-64-5	For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirs	Generic		For working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS	Corning Life Science	2797	For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer gloves	Generic		For personal protection
Lab gown	Generic		for personal protection
Multichannel Pipette P30-300	Generic		For solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000	Generic		For solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL	Generic		For solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mL	Generic		For solution transfer
Transfer pipettes	Generic		For solution transfer