Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche para detectar esporozoítos de glândulas salivares em mosquitos. Usando anticorpos monoclonais facilmente disponíveis, o método permite a detecção econômica e de alto rendimento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. O método é adequado para pesquisas de transmissão da malária, incluindo pesquisas vetoriais.

Resumo

Os esporozoítos de Plasmodium são o estágio infeccioso dos parasitas da malária que infectam humanos. Os esporozoítos que residem nas glândulas salivares das fêmeas dos mosquitos Anopheles são transmitidos aos humanos por meio de picadas de mosquito durante a alimentação do sangue. A presença de esporozoítos nas glândulas salivares do mosquito define a infecciosidade do mosquito. Para determinar se um mosquito Anopheles carrega esporozoítos de Plasmodium, o método de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) tem sido a ferramenta padrão para detectar a proteína circunsporozoíta de Plasmodium (CSP), a principal proteína de superfície dos esporozoítos. Nesse método, a cabeça e o tórax de cada mosquito são separados do abdômen, homogeneizados e submetidos a um ELISA sanduíche para detectar a presença de CSP específico para Plasmodium falciparum e cada um dos dois subtipos, VK210 e VK247, de Plasmodium vivax. Este método tem sido usado para estudar a transmissão da malária, incluindo a dinâmica sazonal da infecção por mosquitos e as espécies dos principais vetores da malária nos locais de estudo.

Introdução

Os esporozoítos de Plasmodium são o estágio infeccioso dos parasitas da malária nos mosquitos. Os esporozoítos são entregues aos humanos por meio de picadas de mosquito. No mosquito, os esporozoítos se formam primeiro dentro dos oocistos na parede do intestino médio. Uma vez prontos, eles são liberados na hemocele e viajam para as glândulas salivares do mosquito. Lá, eles amadurecem e ficam prontos para a transmissão aos humanos durante a alimentação sanguínea. Nos humanos, os esporozoítos são depositados na derme. Em seguida, entram no vaso sanguíneo e percorrem a circulação sanguínea até chegar ao fígado e estabelecer infecção nos hepatócitos ^1,2.

Três métodos diferentes foram usados para determinar a infecção por esporozoítos das glândulas salivares do mosquito. O primeiro método é a dissecção das glândulas salivares seguida de exame direto dos esporozoítos ao microscópio óptico. Este método é o padrão-ouro para detectar e quantificar esporozoítos nas glândulas salivares do mosquito Anopheles ³. No entanto, requer um técnico bem treinado tanto em dissecção quanto em exame microscópico. Além disso, não pode ser usado para determinar espécies de Plasmodium e subtipagem de CSP (para P. vivax)^4,5. O segundo método usa a reação em cadeia da polimerase (PCR) para detectar DNA de Plasmodium na parte superior do corpo do mosquito⁶. Dada a especificidade da PCR, tanto a espécie quanto a subtipagem do parasita são possíveis 7,8,9,10. Embora a PCR seja cada vez mais usada, ela requer equipamentos relativamente caros e pessoal bem treinado. O último método, o ELISA para detectar a proteína circunsporozoíta específica do Plasmodium (CSP), tem sido o esteio por três décadas 11,12,13. A CSP está presente tanto nos esporozoítos de oocistos quanto nos esporozoítos das glândulas salivares^12,14. Usando anticorpos específicos, este método permite a identificação de espécies de Plasmodium e subtipagem de CSP de esporozoítos de P. vivax. A justificativa para este ensaio é a necessidade de um ensaio simples de alto rendimento para examinar um grande número de mosquitos selvagens para entender a transmissão da malária (ou seja, determinar a taxa de infecção por esporozoítos).

O método ELISA tem duas vantagens principais sobre o exame microscópico. Primeiro, permite que os pesquisadores mantenham amostras de mosquitos até que estejam prontas para o processamento de amostras. Em segundo lugar, o método ELISA pode ser usado para diferenciar espécies de Plasmodium por meio de anticorpos monoclonais específicos da espécie. Além disso, o ELISA pode acomodar um número maior de espécimes de mosquitos, permitindo um rendimento muito maior¹⁵. Em comparação com a PCR, que detecta DNA de esporozoítos, o procedimento ELISA leva mais tempo, mas custa menos¹⁶. O ensaio ELISA descrito aqui foi desenvolvido para determinar a infectividade do mosquito e detectar separadamente CSP de P. falciparum e cada uma das duas variantes CSP de P. vivax, VK210 e VK247. Este método ELISA tem sido utilizado em muitos estudos para determinar a dinâmica sazonal da infecção por mosquitos e identificar as espécies dos principais vetores da malária no campo 12,13,17,18. Para realizar este ensaio, um laboratório padrão equipado com um leitor de placas ELISA é suficiente.

A abordagem geral está resumida na Figura 1. Neste ELISA sanduíche, o anticorpo monoclonal primário (captura) (mAb) específico para cada espécie/subtipo de Plasmodium é usado primeiro para revestir a placa ELISA. Cada placa é revestida com um único mAb de captura. A função do mAb é capturar o antígeno CSP correspondente nos homogeneizados do mosquito. Após a captura do antígeno e a lavagem da placa, um segundo anticorpo específico do CSP marcado com peroxidase é usado para detectar a presença de CSP ligado ao mAb de captura. A reação química catalisada pela peroxidase resulta no desenvolvimento de cor em poços positivos para CSP.

Protocolo

1. Preparação de reagentes

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de equipamentos, reagentes e outros consumíveis usados neste protocolo e a Tabela 1 para obter uma lista de soluções e sua composição.

1. Captura e mAbs conjugados com peroxidase
   1. Para reconstituir o mAb, ressuspenda o mAb liofilizado em uma mistura 1:1 de água destilada: glicerol a 0,5 mg/mL. Fazer alíquotas conforme necessário para evitar congelamento e descongelamento repetidos e armazená-las a -20 °C.
2. Buffer de bloqueio (BB)
   1. Prepare o tampão de bloqueio dissolvendo 5 g de caseína grau ELISA em 100 mL de NaOH 0,1 N. Adicione 900 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (ver Tabela 1) para trazer o volume final para 1,0 L.
   2. Adicione 0,02 g de vermelho de fenol como indicador e ajuste o pH para 7,4 com HCl. Armazene BB a 4 ° C por até uma semana ou alíquota em 50 mL para armazenamento de longo prazo a -20 ° C.
3. Controles positivos
   1. Para reconstituir os controles positivos, reidratar as proteínas liofilizadas adicionando 1.000 μL de BB. Elaborar alíquotas das soluções de controlo positivo de stock conforme necessário e armazená-las a -20 °C.
   2. Para a diluição em série, diluir ainda mais cada controlo positivo até à concentração final de trabalho em BB do seguinte modo: Pf, 2 pg/μl; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 pg/μL.
      NOTA: As concentrações exactas dos controlos positivos podem variar de um lote para outro. Consulte a ficha de informações do produto para obter a concentração exata necessária. As concentrações de controle positivo, a partir da concentração de trabalho acima, são 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL para Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μL para PV210; e 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 pg/μL PV247.
4. Controlos negativos
   NOTA: O controle negativo ideal é o homogeneizado cabeça-tórax de mosquitos Anopheles fêmeas preparados de forma idêntica às amostras de teste. No entanto, o BB também pode ser usado como controle negativo.
   1. Com BB como controle negativo, use o limite de absorbância de 2 vezes para leituras positivas confiáveis.

2. Preparação da amostra do mosquito

1. Separe a cabeça e o tórax de cada mosquito adulto coletado do abdômen com uma lâmina de barbear estéril. Coloque a cabeça e o tórax em um tubo de moagem de centrífuga pré-rotulado de 1,5 mL. Cabeças de piscina e toráceos de até 10 mosquitos, se desejar.
   NOTA: Para a preparação da amostra, normalmente, a glândula salivar de um mosquito infectado será dissecada e submetida a CS-ELISA. No entanto, a cabeça e o tórax dos mosquitos coletados também podem ser usados para realizar o CS-ELISA diretamente (sem dissecar as glândulas salivares)12,13,19.
2. Adicione 50 μL de tampão de moagem (GB) em cada tubo e homogeneize a amostra com um pilão limpo (lavado com sabão). Enxágue o pilão usado com 250 μL de GB no tubo que contém o(s) mosquito(s) homogeneizado(s) até um volume final de ~300 μL.
3. Manter a amostra num congelador (-20 °C) até à utilização ou proceder imediatamente à realização do ELISA.

3. ELISA de esporozoíto

1. Preencha a planilha ELISA de esporozoítos (consulte o Material Suplementar 1). Prepare uma placa ELISA para cada CSP (Pf, Pv-210 ou Pv-247).
2. Preparar a solução de trabalho de mAb de captura dissolvendo o anticorpo em PBS: 4 μg/ml Pf; 2 μg/mL Pv-210; 2 μg/mL de Pv-247. Calcule os volumes necessários com base na adição de 5 mL por placa. Vortex a solução suavemente.
3. Pipetar 50 μL de cada solução de mAb de trabalho da etapa 3.2 em cada poço da placa ELISA. Cubra o prato com uma tampa de plástico e incube por 30 min ou durante a noite em temperatura ambiente.
4. Aspire o conteúdo do poço e bata o prato de cabeça para baixo em toalhas de papel pelo menos 5 vezes para remover todo o líquido.
   NOTA: Se um sistema de aspiração (sucção a vácuo multicanal conectada a pontas limpas) não estiver disponível, despeje os anticorpos na pia e bata no prato em toalhas de papel.
5. Adicione 200 μL de BB para encher todos os poços na placa. Cubra o prato com uma tampa de plástico. Incubar a placa durante 1 h à temperatura ambiente. Aspire ou despeje o conteúdo do poço. Bata o prato de cabeça para baixo em toalhas de papel 5 vezes para remover todo o líquido.
6. Carregue o homogeneizado de mosquitos e o controle na placa da seguinte maneira.
   1. Adicionar 50 μL do controlo positivo aos alvéolos H1 e H2.
   2. Adicione 50 μL de BB aos poços nas colunas 1 e 2 da linha C a G. Em seguida, adicione 50 μL do controle positivo nos poços G1 e G2. Fazer uma diluição em série do controlo positivo a partir de G1 e G2, seguida de F1 e F2 até C1 e C2.
      NOTA: Todos os alvéolos de controle positivo devem conter 50 μL.
   3. Adicione 50 μL de BB (controle negativo) aos poços A1, A2, B1 e B2.
   4. Adicione 50 μL de cada amostra homogeneizada a um poço desconhecido (Unk).
   5. Cubra a placa e incube por 2 h em temperatura ambiente.
7. Após aproximadamente 2 h, comece a preparar os substratos. Para o kit de 2 componentes do substrato ABTS, misture o substrato A e o substrato B na proporção de 1:1.
   NOTA: Uma placa completa de 96 poços requer 5 mL de substrato A e 5 mL de substrato B.
8. Prepare as soluções de trabalho de mAbs marcados com peroxidase para Pf, Pv-210 e Pv-247 adicionando BB ao mAb conjugado reconstituído para obter uma concentração de trabalho de 1 μg / mL.
   1. Calcule os volumes necessários com base na adição de 5 mL de solução conjugada de mAb de trabalho por placa.
   2. Teste a atividade da peroxidase misturando 5 μL do mAb marcado com peroxidase feito na etapa 3.8 com 100 μL do substrato feito na etapa 3.7 em um tubo separado de 1,5 mL. Vórtice suavemente.
      NOTA: Deve haver uma rápida mudança de cor de claro para verde, indicando que a enzima peroxidase e os substratos estão funcionando.
9. Aspire ou despeje o conteúdo do poço e bata o prato de cabeça para baixo em toalhas de papel 5 vezes para remover todo o líquido.
10. Lave os poços duas vezes com 200 μL de PBS-Tween, aspire o conteúdo do poço e bata na placa 5 vezes cada.
11. Adicione 50 μL de mAb marcado com peroxidase feito na etapa 3.8 a cada poço. Cubra a placa e incube por 1 h em temperatura ambiente no escuro. Aspire ou despeje o conteúdo do poço e bata o prato de cabeça para baixo em uma toalha de papel 5 vezes.
12. Lave os poços 3 vezes com 200 μL de PBS-Tween, aspire o conteúdo do poço e bata na placa 5 vezes cada.
13. Adicione 100 μL da solução de substrato preparada na etapa 3.7 a cada poço. Cubra a placa e incube por 30 min em temperatura ambiente no escuro.
14. Após 30 min, leia a absorbância a 405-414 nm usando um leitor de placas ELISA.
    NOTA: Siga as instruções específicas para o leitor de placas ELISA usado. Para obter detalhes sobre as instruções do software usado para este protocolo, consulte Material Suplementar S2. Deve haver uma mudança de cor perceptível de claro para verde nos poços de controle positivo.

4. Análise

1. Detecção de amostras positivas.
   1. Rotular as amostras com valores de absorbância acima do limite (duas vezes o valor médio de absorbância das amostras negativas) como positivas.
2. Quantificando o CSP
   1. Estimar a concentração de CSP na amostra utilizando a curva-padrão construída a partir da série de diluições de controlo do seguinte modo.
      1. Crie a curva padrão plotando os valores de absorbância (eixo y) dos controles diluídos em série em relação às suas concentrações (eixo x).
      2. Execute a regressão linear para determinar o melhor ajuste usando y = A + Bx, onde A e B são parâmetros livres.
      3. Determinar a concentração de CSP para cada amostra positiva resolvendo a equação para um determinado valor de absorvância.

Resultados

Os resultados representativos do ELISA são mostrados na Figura 2. Neste experimento, o ELISA de P. falciparum detectou infecção por esporozoítos no poço A7. O poço positivo pode ser detectado visualmente por sua cor verde fraca (Figura 2A). O valor de absorbância deste poço estava acima do limite de corte (duas vezes o valor médio dos quatro poços de controle negativo) (Figura 2B). A distribuição dos valores de ...

Discussão

O CSP-ELISA, fornece um método altamente específico e econômico para detectar Plasmodium CSP. Permite a discriminação entre esporozoítos de P. falciparum e P. vivax, bem como entre os dois subtipos, VK210 e VK247, de P vivax 11,13,14,15. Certos pontos críticos devem ser considerados para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Todas as soluçõe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
ELISA plate reader	BioTek Instrument, Inc.	Synergy H1	Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestle	Axygen	PES-15-B-SI	For homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-component	KPL	50-62-00	For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB)			Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs)			Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
Casein	Sigma aldrich	9000-71-9	For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB)			Note: solution
Igepal CA-630	Sigma aldrich	9002-93-1	For grinding buffer preparation
KCl	Sigma aldrich	7447-40-7	For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4	Sigma aldrich	7778-77-0	For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4	Sigma aldrich	7558-79-4	For phosphate buffer saline preparation
NaCl	Sigma aldrich	7647-14-5	For phosphate buffer saline preparation
NaOH	Sigma aldrich	1310-73-2	For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAb	CDC	Pf-CAP	For capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAb	CDC	Pf-HRP	For detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive control	CDC	Pf-PC	Pf positive control
Phenol red	Sigma aldrich	143-74-8	For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS)			Note: solution
Positive controls			Note: solution
Pv210 capture mAb	CDC	Pv210-CAP	For capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAb	CDC	Pv210-HRP	For detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive control	CDC	Pv210-PC	Pv210 positive control
Pv247 capture mAb	CDC	Pv247-CAP	For capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAb	CDC	Pv247-HRP	For detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive control	CDC	Pv247-PC	Pv247 positive control
Tween20	Sigma aldrich	9005-64-5	For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirs	Generic		For working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS	Corning Life Science	2797	For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer gloves	Generic		For personal protection
Lab gown	Generic		for personal protection
Multichannel Pipette P30-300	Generic		For solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000	Generic		For solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL	Generic		For solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mL	Generic		For solution transfer
Transfer pipettes	Generic		For solution transfer