איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

Summary

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' כדי לזהות ספורוזואיטים של בלוטת הרוק ביתושים. באמצעות נוגדנים חד-שבטיים הזמינים בקלות, השיטה מאפשרת זיהוי חסכוני ובתפוקה גבוהה של יתושים הנושאים פלסמודיום פלציפרום או פלסמודיום ויוואקס. השיטה מתאימה לחקר העברת מלריה, כולל סקרים וקטוריים.

Abstract

פלסמודיום ספורוזואיטים הם השלב הזיהומי של טפילי מלריה המדביקים בני אדם. הספורוזואיטים השוכנים בבלוטות הרוק של נקבות יתושי אנופלס מועברים לבני אדם באמצעות עקיצות יתושים במהלך הזנת הדם. נוכחותם של ספורוזואיטים בבלוטות הרוק של היתוש מגדירה אפוא את זיהומיות היתושים. כדי לקבוע אם יתוש אנופלס נושא ספורוזואיטים של פלסמודיום , שיטת בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) הייתה הכלי הסטנדרטי לזיהוי חלבון פלסמודיום סירקוספוזואיט (CSP), חלבון פני השטח העיקרי של הספורוזואיטים. בשיטה זו, הראש יחד עם בית החזה של כל יתוש מופרד מהבטן, הומוגני, נתון ELISA סנדוויץ 'כדי לזהות את נוכחותו של CSP ספציפי פלסמודיום falciparum וכל אחד משני תת סוגים, VK210 ו VK247, של פלסמודיום vivax. שיטה זו שימשה לחקר העברת מלריה, כולל הדינמיקה העונתית של זיהום יתושים והמינים של וקטורי המלריה העיקריים באתרי המחקר.

Introduction

פלסמודיום ספורוזואיטים הם השלב המדבק של טפילי המלריה ביתושים. הספורוזואיטים מועברים לבני אדם באמצעות עקיצות יתושים. אצל היתוש, הספורוזואיטים נוצרים לראשונה בתוך הביציות שעל דופן המעי. ברגע שהם מוכנים, הם משוחררים לתוך ההמוקול ונוסעים לבלוטות הרוק של היתושים. שם, הם מתבגרים ונעשים מוכנים להעברה לבני אדם במהלך הזנת הדם. בבני אדם, sporozoites מופקדים בדרמיס. לאחר מכן, הם נכנסים לכלי הדם ונוסעים לאורך מחזור הדם כדי להגיע לכבד כדי ליצור זיהום בהפטוציטים ^1,2.

שלוש שיטות שונות שימשו כדי לקבוע זיהום sporozoite של בלוטות הרוק יתושים. השיטה הראשונה היא דיסקציה של בלוטות הרוק ואחריה בדיקה ישירה של sporozoites תחת מיקרוסקופ אור. שיטה זו היא תקן הזהב לזיהוי וכימות ספורוזואיטים בבלוטות רוק יתוש אנופלס ³. עם זאת, זה דורש טכנאי מיומן היטב הן בדיסקציה והן בבדיקה מיקרוסקופית. יתר על כן, לא ניתן להשתמש בו כדי לקבוע מיני פלסמודיום ותת-הקלדה CSP (עבור P. vivax)^4,5. השיטה השנייה משתמשת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לזהות DNA פלסמודיום בחלק העליון של גוף היתוש⁶. בהתחשב בספציפיות של PCR, שני המינים ותת-הקלדה של הטפיל אפשריים 7,8,9,10. למרות PCR משמש יותר ויותר, זה דורש ציוד יקר יחסית צוות מאומן היטב. השיטה האחרונה, ELISA לזיהוי חלבון פלסמודיום ספציפי circumsporozoite (CSP), כבר עמוד התווך במשך שלושה עשורים 11,12,13. CSP קיים הן sporozoites ביצית ו sporozoites בלוטת הרוק sporozoites^12,14. באמצעות נוגדנים ספציפיים, שיטה זו מאפשרת זיהוי מיני פלסמודיום ותת-הקלדה CSP של P. vivax sporozoites. הרציונל מאחורי בדיקה זו הוא הדרישה של בדיקה פשוטה בתפוקה גבוהה כדי לבחון מספר רב של יתושי בר כדי להבין את העברת המלריה (כלומר, לקבוע את שיעור הזיהום sporozoite).

לשיטת ELISA שני יתרונות מרכזיים על פני בדיקה מיקרוסקופית. ראשית, הוא מאפשר לחוקרים לשמור דגימות יתושים עד שהן מוכנות לעיבוד דגימות. שנית, ניתן להשתמש בשיטת ELISA כדי להבדיל בין מיני פלסמודיום באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים למין. בנוסף, ELISA יכולה להכיל מספר גדול יותר של דגימות יתושים, מה שמאפשר תפוקה גבוהה בהרבה¹⁵. בהשוואה ל- PCR, המזהה DNA ספורוזואיטים, הליך ELISA לוקח יותר זמן אך עולה פחות¹⁶. בדיקת ELISA המתוארת כאן פותחה כדי לקבוע את זיהום היתושים ולזהות בנפרד CSP של P. falciparum וכל אחת משתי גרסאות CSP של P. vivax, VK210 ו- VK247. שיטת ELISA זו שימשה במחקרים רבים כדי לקבוע את הדינמיקה העונתית של זיהום יתושים ולזהות את המינים של וקטורי המלריה העיקריים בשדה 12,13,17,18. כדי לבצע בדיקה זו, מעבדה סטנדרטית מצוידת בקורא לוחות ELISA מספיק.

הגישה הכוללת מסוכמת באיור 1. בכריך זה ELISA, הנוגדן החד-שבטי הראשוני (לכידה) (mAb) הספציפי לכל מין/תת-סוג פלסמודיום משמש תחילה לציפוי צלחת ELISA. כל צלחת מצופה ב- mAb לכידה יחיד. תפקידו של mAb הוא ללכוד את האנטיגן CSP המתאים בהומוגנאטים של היתושים. לאחר לכידת אנטיגן ושטיפת צלחות, נוגדן שני ספציפי ל- CSP המסומן בפרוקסידז משמש לזיהוי נוכחות CSP הקשור ל- mAb הלכידה. התגובה הכימית המזורזת על ידי peroxidase גורמת להתפתחות צבע בבארות חיוביות עבור CSP.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של ציוד, ריאגנטים וחומרים מתכלים אחרים המשמשים בפרוטוקול זה ובטבלה 1 לקבלת רשימה של פתרונות והרכבם.

1. לכידה ו mAbs מצומד peroxidase
   1. כדי לשחזר את mAb, להשהות מחדש את mAb lyophilized בתערובת 1: 1 של מים מזוקקים:גליצרול ב 0.5 מ"ג / מ"ל. הכינו אליציטוטים לפי הצורך כדי למנוע הפשרה חוזרת ונשנית בהקפאה, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20°C.
2. מאגר חוסם (BB)
   1. הכן את מאגר החסימה על ידי המסת 5 גרם קזאין בדרגת ELISA ב 100 מ"ל של 0.1 N NaOH. הוסף 900 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) (ראה טבלה 1) כדי להביא את הנפח הסופי ל -1.0 ליטר.
   2. הוסף 0.02 גרם של פנול אדום כאינדיקטור והתאם את ה- pH ל- 7.4 עם HCl. אחסן BB ב -4 ° C עד שבוע אחד, או aliquot לתוך 50 מ"ל לאחסון לטווח ארוך ב -20 ° C.
3. בקרות חיוביות
   1. כדי לשחזר את הבקרות החיוביות, יש לייבש מחדש את החלבונים שעברו ליופיליזציה על ידי הוספת 1,000 μL של BB. בצע aliquots של פתרונות הבקרה החיובית של המניות לפי הצורך, ואחסן אותם ב -20 ° C.
   2. עבור דילול סדרתי, לדלל עוד יותר כל בקרה חיובית לריכוז העבודה הסופי ב- BB כדלקמן: Pf, 2 pg/μL; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 עמ' / μL.
      הערה: הריכוזים המדויקים של הבקרות החיוביות עשויים להשתנות ממגרש אחד למשנהו. עיין בדף המידע של המוצר לקבלת הריכוז המדויק הדרוש. ריכוזי הבקרה החיוביים, החל מריכוז העבודה לעיל, הם 2, 1, 0.5, 0.25, 0.13, 0.06 pg/μL עבור Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5.7 pg/μL עבור PV210; ו-89, 45, 22, 11, 5.6, 2.8 pg/μL PV247.
4. בקרות שליליות
   הערה: ההדברה השלילית האידיאלית היא הומוגנט ראש-בית החזה של נקבות יתושי אנופלס שהוכנו באופן זהה לדגימות הבדיקה. עם זאת, BB יכול לשמש גם כשליטה שלילית.
   1. עם BB כבקרה שלילית, השתמש בסף ספיגה של פי 2 לקריאות חיוביות אמינות.

2. הכנת דגימת יתושים

1. הפרידו את הראש ואת בית החזה של כל יתוש בוגר שנאסף מהבטן בעזרת סכין גילוח סטרילי. הניחו את הראש ובית החזה בצינור השחזה של צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל שכותרתו מראש. ראשי בריכה ו thoraces של עד 10 יתושים אם תרצה.
   הערה: להכנת דגימה, בדרך כלל, בלוטת הרוק של יתוש נגוע תנותח ותהיה נתונה ל- CS-ELISA. עם זאת, הראש ובית החזה של יתושים שנאספו יכולים לשמש גם לביצוע CS-ELISA ישירות (מבלי לנתח את בלוטות הרוק)12,13,19.
2. הוסף 50 μL של חיץ טחינה (GB) לתוך כל צינור הומוגניזציה הדגימה עם מזיק נקי (שטף עם סבון). שטפו את המזיק המשומש עם 250 μL של GB לתוך הצינור המכיל את היתושים ההומוגניים לנפח סופי של ~300 μL.
3. יש לשמור את הדגימה במקפיא (-20°C) עד לשימוש או להמשיך מיד לביצוע ELISA.

3. ספורוזויט אליסה

1. מלא את גליון העבודה sporozoite ELISA (ראה חומר משלים 1). הכן צלחת ELISA אחת לכל CSP (Pf, Pv-210 או Pv-247).
2. הכן את פתרון העבודה mAb ללכידה על ידי המסת הנוגדן ב- PBS: 4 מיקרוגרם / מ"ל Pf; 2 מיקרוגרם/מ"ל Pv-210; 2 מיקרוגרם/מ"ל של Pv-247. חשב את אמצעי האחסון הנדרשים על סמך תוספת של 5 מ"ל לצלחת. מערבלים את הפתרון בעדינות.
3. פיפטה 50 μL של כל פתרון mAb עובד משלב 3.2 לתוך כל באר של צלחת ELISA. מכסים את הצלחת במכסה פלסטיק ודגרים במשך 30 דקות או לילה בטמפרטורת החדר.
4. שאפו את תכולת הבאר וטפחו על הצלחת הפוכה על מגבות נייר לפחות 5 פעמים כדי להסיר את כל הנוזלים.
   הערה: אם מערכת שאיפה (שאיבת ואקום רב-ערוצית המחוברת לקצוות נקיים) אינה זמינה, זרוק את הנוגדנים לכיור ולאחר מכן הקש על הצלחת על מגבות נייר.
5. מוסיפים 200 μL של BB כדי למלא את כל הבארות בצלחת. מכסים את הצלחת במכסה פלסטיק. דוגרים על הצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לשאוף או לזרוק את תכולת הבאר. טפחו על הצלחת הפוך על מגבות נייר 5 פעמים כדי להסיר את כל הנוזלים.
6. טען את היתוש homogenate ואת הבקרה על הצלחת כדלקמן.
   1. הוסף 50 μL של הבקרה החיובית לבארות H1 ו- H2.
   2. הוסף 50 μL של BB לבארות בעמודות 1 ו -2 משורה C עד G. לאחר מכן, הוסף 50 μL של הבקרה החיובית לבארות G1 ו- G2. בצע דילול סדרתי של הבקרה החיובית החל מ- G1 ו- G2 ואחריו F1 ו- F2 עד C1 ו- C2.
      הערה: כל בארות הבקרה החיובית צריכות להכיל 50 μL.
   3. הוסף 50 μL של BB (בקרה שלילית) לבארות A1, A2, B1 ו- B2.
   4. הוסף 50 μL מכל דגימה הומוגנית לבאר לא ידועה (Unk).
   5. מכסים את הצלחת ודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
7. לאחר כשעתיים מתחילים להכין את המצעים. עבור ערכת 2 רכיבים של מצע ABTS, ערבבו מצע A ומצע B ביחס של 1:1.
   הערה: צלחת מלאה של 96 בארות דורשת 5 מ"ל של מצע A ו-5 מ"ל של מצע B.
8. הכן את פתרונות העבודה של mAbs המסומנים בפרוקסידז עבור Pf, Pv-210 ו- Pv-247 על ידי הוספת BB ל- mAb המצומד מחדש כדי לקבל ריכוז עבודה של 1 מיקרוגרם / מ"ל.
   1. חשב את הכרכים הנדרשים בהתבסס על תוספת של 5 מ"ל של פתרון mAb מצומד עובד לכל צלחת.
   2. בדוק את פעילות הפרוקסידז על ידי ערבוב 5 μL של mAb המסומן בפרוקסידז שנעשה בשלב 3.8 עם 100 μL של המצע שנעשה בשלב 3.7 בצינור נפרד של 1.5 מ"ל. מערבלים בעדינות.
      הערה: אמור להיות שינוי צבע מהיר משקוף לירוק, המציין כי אנזים peroxidase ואת הסובסטרטים פועלים.
9. שאפו או שפכו את תכולת הבאר וטפחו על הצלחת הפוכה על מגבות נייר 5 פעמים כדי להסיר את כל הנוזלים.
10. שטפו את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר של PBS-Tween, שאפו את תכולת הבאר והקישו על הצלחת 5 פעמים כל אחת.
11. הוסף 50 μL של mAb המסומן peroxidase שנעשו בשלב 3.8 לכל באר. מכסים את הצלחת ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. שאפו או זרקו את תכולת הבאר וטפחו על הצלחת הפוכה על מגבת נייר 5 פעמים.
12. שטפו את הבארות 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר של PBS-Tween, שאפו את תכולת הבאר והקישו על הצלחת 5 פעמים כל אחת.
13. הוסף 100 μL של תמיסת המצע שהוכנה בשלב 3.7 לכל באר. מכסים את הצלחת ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
14. לאחר 30 דקות, קרא את הספיגה ב 405-414 ננומטר באמצעות קורא לוחות ELISA.
    הערה: בצע את ההוראות הספציפיות עבור קורא הלוחות של ELISA שבו נעשה שימוש. לקבלת פרטים על ההוראות עבור התוכנה המשמשת לפרוטוקול זה, עיין בחומר משלים S2. אמור להיות שינוי צבע ניכר מירוק לירוק בבארות הבקרה החיוביות.

4. ניתוח

1. איתור דגימות חיוביות.
   1. תייג דגימות עם ערכי ספיגה מעל החתך (כפול מערך הספיגה הממוצע של הדגימות השליליות) כחיוביות.
2. כימות CSP
   1. הערך את ריכוז CSP במדגם באמצעות העקומה הסטנדרטית הבנויה מסדרת דילול הבקרה באופן הבא.
      1. צור את העקומה הסטנדרטית על-ידי התוויית ערכי הבליעה (ציר y) של הפקדים המדוללים טורית כנגד ריכוזיהם (ציר x).
      2. בצע רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את ההתאמה הטובה ביותר באמצעות y = A + Bx, כאשר A ו- B הם פרמטרים חופשיים.
      3. קבע את ריכוז CSP עבור כל דגימה חיובית על-ידי פתרון המשוואה עבור ערך ספיגה נתון.

תוצאות

תוצאות ELISA מייצגות מוצגות באיור 2. בניסוי זה, P. falciparum ELISA זיהה זיהום sporozoite בבאר A7. ניתן היה לזהות את הבאר החיובית באופן חזותי על-ידי צבעה הירוק הקלוש (איור 2A). ערך הספיגה של באר זו היה מעל סף החיתוך (כפול מהערך הממוצע של ארבע בארות הבקרה השליליות) (

Discussion

CSP-ELISA מספק שיטה ספציפית מאוד וחסכונית לזיהוי פלסמודיום CSP. הוא מאפשר הבחנה בין P. falciparum ו- P. vivax sporozoites וכן בין שני תת-הסוגים, VK210 ו- VK247, של P vivax 11,13,14,15. יש לקחת בחשבון נקודות קריטיות מסוימות כדי להשיג תוצא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
ELISA plate reader	BioTek Instrument, Inc.	Synergy H1	Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestle	Axygen	PES-15-B-SI	For homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-component	KPL	50-62-00	For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB)			Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs)			Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
Casein	Sigma aldrich	9000-71-9	For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB)			Note: solution
Igepal CA-630	Sigma aldrich	9002-93-1	For grinding buffer preparation
KCl	Sigma aldrich	7447-40-7	For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4	Sigma aldrich	7778-77-0	For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4	Sigma aldrich	7558-79-4	For phosphate buffer saline preparation
NaCl	Sigma aldrich	7647-14-5	For phosphate buffer saline preparation
NaOH	Sigma aldrich	1310-73-2	For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAb	CDC	Pf-CAP	For capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAb	CDC	Pf-HRP	For detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive control	CDC	Pf-PC	Pf positive control
Phenol red	Sigma aldrich	143-74-8	For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS)			Note: solution
Positive controls			Note: solution
Pv210 capture mAb	CDC	Pv210-CAP	For capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAb	CDC	Pv210-HRP	For detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive control	CDC	Pv210-PC	Pv210 positive control
Pv247 capture mAb	CDC	Pv247-CAP	For capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAb	CDC	Pv247-HRP	For detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive control	CDC	Pv247-PC	Pv247 positive control
Tween20	Sigma aldrich	9005-64-5	For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirs	Generic		For working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS	Corning Life Science	2797	For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer gloves	Generic		For personal protection
Lab gown	Generic		for personal protection
Multichannel Pipette P30-300	Generic		For solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000	Generic		For solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL	Generic		For solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mL	Generic		For solution transfer
Transfer pipettes	Generic		For solution transfer