JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает иммуноферментный анализ для обнаружения спорозоитов слюнных желез у комаров. Используя легкодоступные моноклональные антитела, этот метод позволяет экономично и с высокой пропускной способностью обнаруживать комаров, переносящих Plasmodium falciparum или Plasmodium vivax. Метод подходит для исследований передачи малярии, в том числе для обследования переносчиков.

Аннотация

Спорозоиты Plasmodium являются инфекционной стадией малярийных паразитов, которые заражают человека. Спорозоиты, обитающие в слюнных железах самок комаров Anopheles, передаются человеку через укусы комаров во время кормления кровью. Таким образом, наличие спорозоитов в слюнных железах комаров определяет заразность комаров. Чтобы определить, является ли комар Anopheles переносчиком спорозоитов Plasmodium, метод иммуноферментного анализа (ИФА) был стандартным инструментом для обнаружения белка Plasmodium circumsporozoite (CSP), основного поверхностного белка спорозоитов. В этом методе голову вместе с грудной клеткой каждого комара отделяют от брюшка, гомогенизируют и подвергают многофункциональному тесту ИФА для обнаружения присутствия CSP, специфичного для Plasmodium falciparum и каждого из двух подтипов, VK210 и VK247, Plasmodium vivax. Этот метод был использован для изучения передачи малярии, включая сезонную динамику инфекции комаров и виды основных переносчиков малярии в исследуемых районах.

Введение

Plasmodium sporozoites являются инфекционной стадией малярийных паразитов у комаров. Спорозоиты попадают к человеку через укусы комаров. У комаров спорозоиты сначала образуются внутри ооцист на стенке средней кишки. Когда они готовы, они выпускаются в гемоцел и отправляются в слюнные железы комаров. Там они созревают и становятся готовыми к передаче человеку во время кормления кровью. У человека спорозоиты откладываются в дерме. Затем они попадают в кровеносный сосуд и путешествуют по циркуляции крови, чтобы достичь печени, чтобы установить инфекцию в гепатоцитах 1,2.

Для определения спорозоитной инфекции слюнных желез комаров использовались три различных метода. Первый метод – вскрытие слюнных желез с последующим непосредственным исследованием спорозоитов под световым микроскопом. Этот метод является золотым стандартом для обнаружения и количественного определения спорозоитов в слюнных железах комаров Anopheles 3. Тем не менее, для этого требуется техник, хорошо обученный как вскрытию, так и микроскопическому исследованию. Более того, он не может быть использован для определения видов Plasmodium и подтипирования CSP (для P. vivax)4,5. Второй метод использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для обнаружения ДНК плазмодия в верхней части тела комара6. Учитывая специфичность ПЦР, возможны как виды, так и подтипы паразита 7,8,9,10. Хотя ПЦР используется все чаще, для этого требуется относительно дорогое оборудование и хорошо обученный персонал. Последний метод, ИФА для обнаружения специфичного для Plasmodium циркумспорозоитного белка (CSP), был основным в течение трех десятилетий 11,12,13. CSP присутствует как в спорозоитах ооцист, так и в спорозоитах слюнных желез12,14. Используя специфические антитела, этот метод позволяет идентифицировать виды Plasmodium и подтипировать ЦСП спорозоитов P. vivax. Обоснованием для этого анализа является требование простого высокопроизводительного анализа для изучения большого количества диких комаров для понимания передачи малярии (т.е. определения уровня заражения спорозоитами).

Метод ИФА имеет два ключевых преимущества перед микроскопическим исследованием. Во-первых, это позволяет исследователям хранить образцы комаров до тех пор, пока они не будут готовы к обработке образцов. Во-вторых, метод ИФА может быть использован для дифференцировки видов Plasmodium с помощью видоспецифичных моноклональных антител. Кроме того, ИФА может вместить большее количество образцов комаров, что позволяет обеспечить гораздо более высокуюпроизводительность15. По сравнению с ПЦР, которая обнаруживает ДНК спорозоита, процедура ИФА занимает больше времени, но стоит дешевле16. Описанный здесь анализ ИФА был разработан для определения инфекционности комаров и отдельного обнаружения CSP P. falciparum и каждого из двух вариантов CSP P. vivax, VK210 и VK247. Этот метод ИФА использовался во многих исследованиях для определения сезонной динамики инфекции комаров и выявления видов основных переносчиков малярии в полевых условиях 12,13,17,18. Для проведения этого анализа достаточно стандартной лаборатории, оснащенной планшетным считывателем ИФА.

Общий подход кратко изложен на рисунке 1. В этом сэндвич-ИФА первичное (захватывающее) моноклональное антитело (mAb), специфичное для каждого вида/подтипа Plasmodium , сначала используется для покрытия планшета ИФА. Каждая пластина покрыта одним захватным mAb. Функция mAb заключается в захвате соответствующего антигена CSP в гомогенатах комаров. После захвата антигена и промывки планшетов второе CSP-специфичное антитело, меченное пероксидазой, используется для обнаружения присутствия CSP, связанного с захватом mAb. Химическая реакция, катализируемая пероксидазой, приводит к развитию цветности в скважинах, положительных на CSP.

протокол

1. Приготовление реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Список оборудования, реагентов и других расходных материалов, используемых в данном протоколе, см. в Таблице материалов, а список растворов и их состав см. в Таблице 1 .

  1. Захват и пероксидаза-конъюгированные mAb
    1. Чтобы восстановить mAb, ресуспендируйте лиофилизированный mAb в смеси дистиллированной воды:глицерина в соотношении 1:1 в концентрации 0,5 мг/мл. Вносите аликвоты по мере необходимости, чтобы избежать повторного замораживания-размораживания, и храните их при температуре -20 °C.
  2. Блокирующий буфер (BB)
    1. Приготовьте блокирующий буфер, растворив 5 г казеина класса ИФА в 100 мл 0,1 Н NaOH. Добавьте 900 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. таблицу 1), чтобы довести конечный объем до 1,0 л.
    2. Добавьте 0,02 г фенола красного в качестве индикатора и отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl. Храните BB при температуре 4 °C до одной недели или добавьте аликвоту в 50 мл для длительного хранения при температуре -20 °C.
  3. Позитивный контроль
    1. Чтобы восстановить положительный контроль, регидратируйте лиофилизированные белки, добавив 1000 мкл BB. При необходимости приготовьте аликвоты из исходных растворов положительного контроля и храните их при температуре -20 °С.
    2. При серийном разведении каждое положительное контрольное разбавление до конечной рабочей концентрации в ВВ следующим образом: Pf, 2 пг/мкл; Pv (VK210), 182 (пг/μл); Pv (VK247), 89 пг/μл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное значение концентраций положительных контролей может варьироваться от одной партии к другой. Обратитесь к информационному листу продукта для получения точной необходимой концентрации. Положительные контрольные концентрации, начиная с указанной выше рабочей концентрации, составляют 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 пг/мкл для Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 пг/мкл для PV210; и 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 пг/мкл PV247.
  4. Негативный контроль
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальным отрицательным контролем является гомогенат головы и грудной клетки самок комаров Anopheles, приготовленный идентично исследуемым образцам. Тем не менее, BB также можно использовать в качестве негативного контроля.
    1. При использовании BB в качестве отрицательного контроля используйте 2-кратный порог поглощения для надежных положительных показаний.

2. Подготовка образцов от комаров

  1. Отделите голову и грудную клетку каждого собранного взрослого комара от брюшка с помощью стерильного бритвенного лезвия. Поместите голову и грудную клетку в предварительно маркированную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Бассейн до 10 комаров по желанию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки образца, как правило, слюнная железа инфицированного комара рассекается и подвергается воздействию КС-ИФА. Тем не менее, голова и грудная клетка собранных комаров также могут быть использованы для проведения КС-ИФА непосредственно (без вскрытия для слюнных желез)12,13,19.
  2. Добавьте 50 μL буфера для измельчения (GB) в каждую пробирку и гомогенизируйте образец чистым пестиком (промытым с мылом). Промойте использованный пестик 250 мкл GB в пробирке, содержащей гомогенизированных комаров, до конечного объема ~300 мкл.
  3. Храните образец в морозильной камере (-20 °C) до использования или немедленно приступайте к выполнению ИФА.

3. Спорозоит ИФА

  1. Заполните рабочий лист ИФА для спорозоита (см. Дополнительный материал 1). Подготовьте по одной пластине ИФА для каждого CSP (Pf, Pv-210 или Pv-247).
  2. Готовят рабочий раствор Capture mAb путем растворения антитела в PBS: 4 мкг/мл Pf; 2 мкг/мл Pv-210; 2 мкг/мл Pv-247. Рассчитайте необходимые объемы, исходя из добавления 5 мл на пластину. Осторожно перебейте раствор в вихрь.
  3. Пипетку по 50 мкл каждого рабочего раствора mAb из шага 3.2 в каждую лунку планшета ИФА. Накройте тарелку пластиковой крышкой и выдерживайте 30 минут или ночь при комнатной температуре.
  4. Отсадите содержимое лунки и постучите по перевернутой тарелке по бумажным полотенцам не менее 5 раз, чтобы удалить всю жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если система аспирации (многоканальная вакуумная аспирация, подключенная к чистым наконечникам) недоступна, вылейте антитела в раковину, а затем постучите пластиной по бумажным полотенцам.
  5. Добавьте 200 μL BB, чтобы заполнить все лунки в пластине. Накройте тарелку пластиковой крышкой. Выдержать тарелку в течение 1 ч при комнатной температуре. Отсасывайте или высыпайте содержимое лунки. Постучите по тарелке вверх дном по бумажным полотенцам 5 раз, чтобы удалить всю жидкость.
  6. Загрузите на пластину гомогенат комара и средство контроля следующим образом.
    1. Добавьте 50 мкл положительного контроля в лунки H1 и H2.
    2. Добавьте 50 мкл BB в лунки в столбцах 1 и 2 из строки C в G. Затем добавьте 50 мкл положительного контроля в лунки G1 и G2. Произведите последовательное разведение положительного контроля, начиная с G1 и G2, затем F1 и F2 до C1 и C2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все положительные контрольные лунки должны содержать 50 мкл.
    3. Добавьте 50 мкл BB (отрицательный контроль) в лунки A1, A2, B1 и B2.
    4. Добавьте по 50 мкл каждого образца гомогената в лунку Unknown (Unk).
    5. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте 2 ч при комнатной температуре.
  7. Примерно через 2 часа приступайте к подготовке субстрата. Для 2-компонентного набора подложки ABTS смешайте подложку А и подложку В в соотношении 1:1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для полного 96-луночного планшета требуется 5 мл субстрата А и 5 мл субстрата В.
  8. Готовят рабочие растворы меченых пероксидазой mAb для Pf, Pv-210 и Pv-247 путем добавления BB к восстановленному конъюгату mAb для получения рабочей концентрации 1 мкг/мл.
    1. Рассчитайте необходимые объемы исходя из добавления 5 мл рабочего сопряженного раствора mAb на одну пластину.
    2. Проверяют активность пероксидазы путем смешивания 5 мкл меченого пероксидазой mAb, полученного на стадии 3.8, со 100 мкл субстрата, полученного на стадии 3.7, в отдельной пробирке объемом 1,5 мл. Вихрь мягко.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Должна наблюдаться быстрая смена цвета с прозрачного на зеленый, указывающая на то, что фермент пероксидаза и субстраты работают.
  9. Отсадите или слейте содержимое лунки и постучите по пластине вверх дном по бумажным полотенцам 5 раз, чтобы удалить всю жидкость.
  10. Дважды промойте лунки 200 μл PBS-Tween, всадите содержимое лунки и постучите по тарелке 5 раз каждая.
  11. Добавьте 50 мкл меченого пероксидазой mAb, полученного на шаге 3.8, в каждую лунку. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте 1 ч при комнатной температуре в темноте. Отсадите или слейте содержимое лунки и постучите по пластине вверх дном по бумажному полотенцу 5 раз.
  12. Промойте лунки 3 раза 200 μл PBS-Tween, аспирируйте содержимое лунки и постучите по пластине 5 раз каждая.
  13. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата, приготовленного на шаге 3.7. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте 30 минут при комнатной температуре в темноте.
  14. Через 30 мин считайте абсорбцию на длине волны 405-414 нм с помощью планшетного ридера ELISA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте конкретным инструкциям для используемого планшетного считывателя ELISA. Подробные инструкции к программному обеспечению, используемому для этого протокола, см. в Дополнительном материале S2. В положительных контрольных лунках должно наблюдаться заметное изменение цвета с прозрачного на зеленый.

4. Анализ

  1. Выявление положительных проб.
    1. Пометьте образцы со значениями поглощения выше порогового значения (в два раза превышающим среднее значение поглощения отрицательных образцов) как положительные.
  2. Количественная оценка CSP
    1. Оцените концентрацию CSP в образце с помощью стандартной кривой, построенной на основе ряда контрольного разбавления следующим образом.
      1. Создайте стандартную кривую, построив значения поглощения (ось y) серийно разбавленных элементов управления в зависимости от их концентраций (ось x).
      2. Выполните линейную регрессию для определения наилучшего соответствия, используя y = A + Bx, где A и B — свободные параметры.
      3. Определите концентрацию CSP для каждой положительной пробы, решив уравнение для заданного значения поглощения.

Результаты

Репрезентативные результаты ИФА показаны на рисунке 2. В этом эксперименте методом иммуноферментного анализа P. falciparum была обнаружена спорозоитная инфекция в скважине А7. Положительная лунка может быть визуально обнаружена по ее слабому зеленому цвету (...

Обсуждение

CSP-ELISA представляет собой высокоспецифичный и экономически эффективный метод обнаружения Plasmodium CSP. Это позволяет проводить различие между P. falciparum и P. vivax спорозоитами, а также между двумя подтипами, VK210 и VK247, P vivax 11,13,14,15.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим г-на Киракорн Киатибутр, MVRU, за обучение и руководство. Мы также благодарим г-жу Пиньяпат Коннгнген, MVRU, за ее техническую помощь в подготовке рисунка 2. Эта работа была поддержана грантом Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и Национального института здравоохранения (U19 AI089672).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
ELISA plate readerBioTek Instrument, Inc.Synergy H1Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestleAxygenPES-15-B-SIFor homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-componentKPL50-62-00For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB)Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs)Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
CaseinSigma aldrich9000-71-9For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB)Note: solution
Igepal CA-630Sigma aldrich9002-93-1For grinding buffer preparation
KClSigma aldrich7447-40-7For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4Sigma aldrich7778-77-0For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4Sigma aldrich7558-79-4For phosphate buffer saline preparation
NaClSigma aldrich7647-14-5For phosphate buffer saline preparation
NaOHSigma aldrich1310-73-2For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAbCDCPf-CAPFor capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAbCDCPf-HRPFor detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive controlCDCPf-PCPf positive control
Phenol redSigma aldrich143-74-8For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS)Note: solution
Positive controlsNote: solution
Pv210 capture mAbCDCPv210-CAPFor capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAbCDCPv210-HRPFor detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive controlCDCPv210-PCPv210 positive control
Pv247 capture mAbCDCPv247-CAPFor capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAbCDCPv247-HRPFor detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive controlCDCPv247-PCPv247 positive control
Tween20Sigma aldrich9005-64-5For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirsGenericFor working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVSCorning Life Science2797For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer glovesGenericFor personal protection
Lab gownGenericfor personal protection
Multichannel Pipette P30-300GenericFor solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000GenericFor solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µLGenericFor solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mLGenericFor solution transfer
Transfer pipettesGenericFor solution transfer

Ссылки

  1. Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
  2. Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
  3. World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , (1975).
  4. Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
  5. Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
  6. Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230 (2017).
  7. Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
  8. Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
  9. Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
  10. Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
  11. Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
  12. Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
  13. Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
  14. Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
  15. Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
  16. Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224 (2013).
  17. Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738 (2021).
  18. Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263 (2021).
  19. Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
  20. Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Plasmodium sporozoitesAnophelesPlasmodium CSPPlasmodium falciparumPlasmodium vivax

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены