Detección de esporozoítos de Plasmodium en mosquitos Anopheles mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas

Resumen

Este protocolo describe un ensayo de inmunoadsorción enzimática en sándwich para detectar esporozoítos de glándulas salivales en mosquitos. Mediante el uso de anticuerpos monoclonales fácilmente disponibles, el método permite la detección rentable y de alto rendimiento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. El método es adecuado para la investigación de la transmisión del paludismo, incluidos los estudios de vectores.

Resumen

Los esporozoítos de Plasmodium son la etapa infecciosa de los parásitos de la malaria que infectan a los humanos. Los esporozoítos que residen en las glándulas salivales de las hembras de mosquitos Anopheles se transmiten a los humanos a través de las picaduras de mosquitos durante la alimentación con sangre. Por lo tanto, la presencia de esporozoítos en las glándulas salivales del mosquito define la infecciosidad del mosquito. Para determinar si un mosquito Anopheles es portador de esporozoítos de Plasmodium, el método de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) ha sido la herramienta estándar para detectar la proteína circunsporozoíto de Plasmodium (CSP), la principal proteína de superficie de los esporozoítos. En este método, la cabeza junto con el tórax de cada mosquito se separa del abdomen, se homogeneiza y se somete a un ELISA sándwich para detectar la presencia de CSP específica de Plasmodium falciparum y de cada uno de los dos subtipos, VK210 y VK247, de Plasmodium vivax. Este método se ha utilizado para estudiar la transmisión del paludismo, incluida la dinámica estacional de la infección por mosquitos y las especies de los principales vectores del paludismo en los sitios de estudio.

Introducción

Los esporozoítos de Plasmodium son la etapa infecciosa de los parásitos de la malaria en los mosquitos. Los esporozoítos se entregan a los humanos a través de las picaduras de mosquitos. En el mosquito, los esporozoítos se forman primero dentro de los ooquistes en la pared del intestino medio. Una vez listos, se liberan en el hemocelo y viajan a las glándulas salivales del mosquito. Allí, maduran y se preparan para la transmisión a los humanos durante la alimentación sanguínea. En los seres humanos, los esporozoítos se depositan en la dermis. Luego, ingresan al vaso sanguíneo y viajan a lo largo de la circulación sanguínea para llegar al hígado y establecer la infección en los hepatocitos ^1,2.

Se han utilizado tres métodos diferentes para determinar la infección por esporozoíto de las glándulas salivales del mosquito. El primer método es la disección de las glándulas salivales, seguida de un examen directo de los esporozoítos bajo un microscopio óptico. Este método es el estándar de oro para detectar y cuantificar esporozoítos en las glándulas salivales del mosquito Anopheles ³. Sin embargo, requiere un técnico bien entrenado tanto en disección como en examen microscópico. Además, no se puede utilizar para determinar las especies de Plasmodium y la subtipificación de CSP (para P. vivax)^4,5. El segundo método utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar el ADN de Plasmodium en la parte superior del cuerpo del mosquito⁶. Dada la especificidad de la PCR, tanto la especie como el subtipo del parásito son posibles 7,8,9,10. Aunque la PCR se utiliza cada vez más, requiere equipos relativamente caros y personal bien capacitado. El último método, el ELISA para detectar la proteína circumsporozoíto específica (CSP) de Plasmodium, ha sido el pilar durante tres décadas 11,12,13. La CSP está presente tanto en esporozoítos de ooquistes como en esporozoítos de glándulas salivales^12,14. Utilizando anticuerpos específicos, este método permite la identificación de especies de Plasmodium y la subtipificación CSP de esporozoítos de P. vivax. La justificación de este ensayo es la necesidad de un ensayo simple de alto rendimiento para examinar un gran número de mosquitos silvestres con el fin de comprender la transmisión de la malaria (es decir, determinar la tasa de infección por esporozoítos).

El método ELISA tiene dos ventajas clave sobre el examen microscópico. En primer lugar, permite a los investigadores conservar las muestras de mosquitos hasta que estén listas para su procesamiento. En segundo lugar, el método ELISA se puede utilizar para diferenciar especies de Plasmodium a través de anticuerpos monoclonales específicos de cada especie. Además, ELISA puede acomodar un mayor número de especímenes de mosquitos, lo que permite un rendimiento mucho mayor¹⁵. En comparación con la PCR, que detecta el ADN de los esporozoítos, el procedimiento ELISA lleva más tiempo pero^{cuesta menos.} El ensayo ELISA descrito aquí se desarrolló para determinar la infectividad del mosquito y detectar por separado la CSP de P. falciparum y cada una de las dos variantes de CSP de P. vivax, VK210 y VK247. Este método ELISA ha sido utilizado en muchos estudios para determinar la dinámica estacional de la infección por mosquitos e identificar las especies de los principales vectores de la malaria en el campo 12,13,17,18. Para realizar este ensayo, basta con un laboratorio estándar equipado con un lector de placas ELISA.

El enfoque general se resume en la Figura 1. En este ELISA sándwich, el anticuerpo monoclonal (mAb) primario (captura) específico para cada especie/subtipo de Plasmodium se utiliza primero para recubrir la placa ELISA. Cada placa está recubierta con un solo mAb de captura. La función del mAb es capturar el antígeno CSP correspondiente en los homogeneizados de mosquitos. Después de la captura del antígeno y el lavado de la placa, se utiliza un segundo anticuerpo específico de CSP marcado con peroxidasa para detectar la presencia de CSP unido al mAb de captura. La reacción química catalizada por la peroxidasa da como resultado el desarrollo de color en pozos positivos para CSP.

Protocolo

1. Preparación de reactivos

NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para obtener una lista de equipos, reactivos y otros consumibles utilizados en este protocolo y la Tabla 1 para obtener una lista de soluciones y su composición.

1. Captura y mAbs conjugados con peroxidasa
   1. Para reconstituir el mAb, resuspenda el mAb liofilizado en una mezcla 1:1 de agua destilada:glicerol a 0,5 mg/mL. Prepare alícuotas según sea necesario para evitar la congelación y descongelación repetidas y guárdelas a -20 °C.
2. Búfer de bloqueo (BB)
   1. Prepare el tampón de bloqueo disolviendo 5 g de caseína de grado ELISA en 100 mL de NaOH 0,1 N. Añadir 900 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (ver Tabla 1) para llevar el volumen final a 1,0 L.
   2. Añadir 0,02 g de rojo fenol como indicador y ajustar el pH a 7,4 con HCl. Almacene BB a 4 °C durante un máximo de una semana, o alícuota a 50 mL para almacenamiento a largo plazo a -20 °C.
3. Controles positivos
   1. Para reconstituir los controles positivos, rehidratar las proteínas liofilizadas añadiendo 1.000 μL de BB. Prepare alícuotas de las soluciones de control positivo en stock según sea necesario y guárdelas a -20 °C.
   2. Para la dilución en serie, diluir aún más cada testigo positivo hasta la concentración final de trabajo en BB de la siguiente manera: Pf, 2 pg/μL; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 pg/μL.
      NOTA: Las concentraciones exactas de los controles positivos pueden variar de un lote a otro. Consulte la hoja de información del producto para conocer la concentración exacta necesaria. Las concentraciones de control positivo, a partir de la concentración de trabajo anterior, son 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL para Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μL para PV210; y 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 pg/μL PV247.
4. Controles negativos
   NOTA: El control negativo ideal es el homogeneizado cabeza-tórax de las hembras de mosquitos Anopheles preparado de manera idéntica a las muestras de prueba. Sin embargo, BB también se puede utilizar como control negativo.
   1. Con BB como control negativo, utilice el umbral de absorbancia de 2 veces para obtener lecturas positivas fiables.

2. Preparación de la muestra de mosquitos

1. Separe la cabeza y el tórax de cada mosquito adulto recolectado del abdomen con una cuchilla de afeitar estéril. Coloque la cabeza y el tórax en un tubo de molienda centrífuga de 1,5 mL preetiquetado. Cabezas de piscina y toracas de hasta 10 mosquitos si lo desea.
   NOTA: Para la preparación de la muestra, por lo general, la glándula salival de un mosquito infectado se diseccionará y se someterá a CS-ELISA. Sin embargo, la cabeza y el tórax de los mosquitos recolectados también se pueden utilizar para realizar CS-ELISA directamente (sin disección de glándulas salivales)12,13,19.
2. Añadir 50 μL de tampón de molienda (GB) en cada tubo y homogeneizar la muestra con un mortero limpio (lavado con jabón). Enjuague el mortero usado con 250 μL de GB en el tubo que contiene los mosquitos homogeneizados hasta un volumen final de ~300 μL.
3. Mantenga la muestra en un congelador (-20 °C) hasta su uso o proceda inmediatamente a la realización de ELISA.

3. ELISA de esporozoíto

1. Complete la hoja de trabajo ELISA de esporozoíto (consulte el Material complementario 1). Prepare una placa ELISA para cada CSP (Pf, Pv-210 o Pv-247).
2. Preparar la solución de trabajo de mAb de captura disolviendo el anticuerpo en PBS: 4 μg/mL Pf; 2 μg/mL Pv-210; 2 μg/mL de Pv-247. Calcular los volúmenes necesarios en base a la adición de 5 mL por placa. Agita la solución suavemente.
3. Pipetear 50 μL de cada solución de mAb de trabajo del paso 3.2 en cada pocillo de la placa ELISA. Cubra la placa con una tapa de plástico e incube durante 30 minutos o toda la noche a temperatura ambiente.
4. Aspire el contenido del pocillo y golpee el plato boca abajo sobre toallas de papel al menos 5 veces para eliminar todo el líquido.
   NOTA: Si no se dispone de un sistema de aspiración (succión de vacío multicanal conectada a puntas limpias), vierta los anticuerpos en el fregadero y luego golpee la placa con toallas de papel.
5. Añadir 200 μL de BB para llenar todos los pocillos de la placa. Cubra el plato con una tapa de plástico. Incubar la placa durante 1 h a temperatura ambiente. Aspire o vacie el contenido del pozo. Golpee el plato boca abajo sobre toallas de papel 5 veces para eliminar todo el líquido.
6. Cargue el homogeneizado de mosquitos y el control en el plato de la siguiente manera.
   1. Añada 50 μL del control positivo a los pocillos H1 y H2.
   2. Añada 50 μL de BB a los pocillos de las columnas 1 y 2 de la fila C a la G. A continuación, añada 50 μL del control positivo en los pocillos G1 y G2. Realice una dilución en serie del control positivo a partir de G1 y G2 seguidos de F1 y F2 hasta C1 y C2.
      NOTA: Todos los pocillos de control positivo deben contener 50 μL.
   3. Agregue 50 μL de BB (control negativo) a los pocillos A1, A2, B1 y B2.
   4. Añadir 50 μL de cada muestra homogeneizada a un pocillo Unknown (Unk).
   5. Cubrir la placa e incubar durante 2 h a temperatura ambiente.
7. Pasadas aproximadamente 2 h, comienza a preparar los sustratos. Para el kit de 2 componentes de sustrato ABTS, mezcle el sustrato A y el sustrato B en una proporción de 1:1.
   NOTA: Una placa completa de 96 pocillos requiere 5 mL de sustrato A y 5 mL de sustrato B.
8. Prepare las soluciones de trabajo de los anticuerpos monoclonales marcados con peroxidasa para Pf, Pv-210 y Pv-247 añadiendo BB al mAb conjugado reconstituido para obtener una concentración de trabajo de 1 μg/mL.
   1. Calcule los volúmenes necesarios en función de la adición de 5 mL de solución de mAb conjugada de trabajo por placa.
   2. Pruebe la actividad de la peroxidasa mezclando 5 μL del mAb marcado con peroxidasa producido en el paso 3.8 con 100 μL del sustrato producido en el paso 3.7 en un tubo separado de 1,5 mL. Vórtice suavemente.
      NOTA: Debe haber un cambio rápido de color de claro a verde, lo que indica que la enzima peroxidasa y los sustratos están funcionando.
9. Aspire o vierta el contenido del pocillo y golpee el plato boca abajo sobre toallas de papel 5 veces para eliminar todo el líquido.
10. Lave los pocillos dos veces con 200 μL de PBS-Tween, aspire el contenido del pocillo y golpee la placa 5 veces cada uno.
11. Añada 50 μL de mAb marcado con peroxidasa elaborado en el paso 3.8 a cada pocillo. Cubra la placa e incube durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Aspire o vierta el contenido del pocillo y golpee el plato boca abajo sobre una toalla de papel 5 veces.
12. Lave los pocillos 3 veces con 200 μL de PBS-Tween, aspire el contenido del pocillo y golpee la placa 5 veces cada uno.
13. Añadir 100 μL de la solución de sustrato preparada en el paso 3.7 a cada pocillo. Cubra la placa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
14. Después de 30 minutos, lea la absorbancia a 405-414 nm utilizando un lector de placas ELISA.
    NOTA: Siga las instrucciones específicas para el lector de placas ELISA utilizado. Para obtener más información sobre las instrucciones del software utilizado para este protocolo, consulte el Material complementario S2. Debería haber un cambio de color notable de claro a verde en los pocillos de control positivo.

4. Análisis

1. Detección de muestras positivas.
   1. Etiquete las muestras con valores de absorbancia por encima del punto de corte (el doble del valor medio de absorbancia de las muestras negativas) como positivas.
2. Cuantificación de la CSP
   1. Estime la concentración de CSP en la muestra utilizando la curva estándar construida a partir de la serie de dilución de control de la siguiente manera.
      1. Cree la curva estándar trazando los valores de absorbancia (eje y) de los controles diluidos en serie con respecto a sus concentraciones (eje x).
      2. Realice una regresión lineal para determinar el mejor ajuste utilizando y = A + Bx, donde A y B son parámetros libres.
      3. Determine la concentración de CSP para cada muestra positiva resolviendo la ecuación para un valor de absorbancia dado.

Resultados

Los resultados representativos de ELISA se muestran en la Figura 2. En este experimento, el ELISA de P. falciparum detectó infección por esporozoíto en el pocillo A7. El pozo positivo podía ser detectado visualmente por su tenue color verde (Figura 2A). El valor de absorbancia de este pozo estuvo por encima del umbral de corte (el doble del valor medio de los cuatro pozos de control negativos) (Figura 2B). La distribuci...

Discusión

El CSP-ELISA proporciona un método muy específico y rentable para detectar la CSP por Plasmodium. Permite discriminar entre los esporozoítos de P. falciparum y P. vivax, así como entre los dos subtipos, VK210 y VK247, de P vivax 11,13,14,15. Se deben tener en cuenta ciertos puntos críticos para obtener resultados fiables y reproducibles. Todas las soluci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
ELISA plate reader	BioTek Instrument, Inc.	Synergy H1	Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestle	Axygen	PES-15-B-SI	For homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-component	KPL	50-62-00	For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB)			Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs)			Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
Casein	Sigma aldrich	9000-71-9	For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB)			Note: solution
Igepal CA-630	Sigma aldrich	9002-93-1	For grinding buffer preparation
KCl	Sigma aldrich	7447-40-7	For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4	Sigma aldrich	7778-77-0	For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4	Sigma aldrich	7558-79-4	For phosphate buffer saline preparation
NaCl	Sigma aldrich	7647-14-5	For phosphate buffer saline preparation
NaOH	Sigma aldrich	1310-73-2	For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAb	CDC	Pf-CAP	For capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAb	CDC	Pf-HRP	For detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive control	CDC	Pf-PC	Pf positive control
Phenol red	Sigma aldrich	143-74-8	For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS)			Note: solution
Positive controls			Note: solution
Pv210 capture mAb	CDC	Pv210-CAP	For capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAb	CDC	Pv210-HRP	For detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive control	CDC	Pv210-PC	Pv210 positive control
Pv247 capture mAb	CDC	Pv247-CAP	For capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAb	CDC	Pv247-HRP	For detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive control	CDC	Pv247-PC	Pv247 positive control
Tween20	Sigma aldrich	9005-64-5	For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirs	Generic		For working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS	Corning Life Science	2797	For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer gloves	Generic		For personal protection
Lab gown	Generic		for personal protection
Multichannel Pipette P30-300	Generic		For solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000	Generic		For solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL	Generic		For solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mL	Generic		For solution transfer
Transfer pipettes	Generic		For solution transfer