Rilevamento di Plasmodium Sporozoites nelle zanzare Anopheles utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico

Riepilogo

Questo protocollo descrive un test di immunoassorbimento enzimatico a sandwich per rilevare gli sporozoiti delle ghiandole salivari nelle zanzare. Utilizzando anticorpi monoclonali facilmente disponibili, il metodo consente di rilevare in modo economico e ad alto rendimento le zanzare portatrici di Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. Il metodo è adatto per la ricerca sulla trasmissione della malaria, comprese le indagini sui vettori.

Abstract

Gli sporozoiti del Plasmodium sono lo stadio infettivo dei parassiti della malaria che infettano l'uomo. Gli sporozoiti che risiedono nelle ghiandole salivari delle femmine di zanzara Anopheles vengono trasmessi all'uomo attraverso le punture di zanzara durante l'alimentazione del sangue. La presenza di sporozoiti nelle ghiandole salivari delle zanzare definisce quindi l'infettività delle zanzare. Per determinare se una zanzara Anopheles è portatrice di Plasmodium sporozoites, il metodo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) è stato lo strumento standard per rilevare la proteina Plasmodium circumsporozoite (CSP), la principale proteina di superficie degli sporozoiti. In questo metodo, la testa insieme al torace di ciascuna zanzara viene separata dall'addome, omogeneizzata e sottoposta a un ELISA a sandwich per rilevare la presenza di CSP specifico per Plasmodium falciparum e ciascuno dei due sottotipi, VK210 e VK247, di Plasmodium vivax. Questo metodo è stato utilizzato per studiare la trasmissione della malaria, comprese le dinamiche stagionali dell'infezione da zanzare e le specie dei principali vettori di malaria nei siti di studio.

Introduzione

Gli sporozoiti Plasmodium sono lo stadio infettivo dei parassiti della malaria nelle zanzare. Gli sporozoiti vengono consegnati all'uomo tramite punture di zanzara. Nella zanzara, gli sporozoiti si formano prima all'interno delle oocisti sulla parete dell'intestino medio. Una volta pronti, vengono rilasciati nell'emocele e viaggiano verso le ghiandole salivari delle zanzare. Lì, maturano e diventano pronti per la trasmissione all'uomo durante l'alimentazione del sangue. Nell'uomo, gli sporozoiti si depositano nel derma. Quindi, entrano nel vaso sanguigno e viaggiano lungo la circolazione sanguigna per raggiungere il fegato e stabilire l'infezione negli epatociti ^1,2.

Tre diversi metodi sono stati utilizzati per determinare l'infezione da sporozoite delle ghiandole salivari delle zanzare. Il primo metodo è la dissezione delle ghiandole salivari seguita dall'esame diretto degli sporozoiti al microscopio ottico. Questo metodo è il gold standard per rilevare e quantificare gli sporozoiti nelle ghiandole salivari della zanzara Anopheles ³. Tuttavia, richiede un tecnico ben addestrato sia nella dissezione che nell'esame microscopico. Inoltre, non può essere utilizzato per determinare le specie di Plasmodium e la sottotipizzazione CSP (per P. vivax)^4,5. Il secondo metodo utilizza la reazione a catena della polimerasi (PCR) per rilevare il DNA del Plasmodio nella parte superiore del corpo della zanzara⁶. Data la specificità della PCR, sono possibili sia la specie che la sottotipizzazione del parassita 7,8,9,10. Sebbene la PCR sia sempre più utilizzata, richiede attrezzature relativamente costose e personale ben addestrato. L'ultimo metodo, l'ELISA per rilevare la proteina circonfusozoite specifica del Plasmodium (CSP), è stato il pilastro per tre decenni 11,12,13. La CSP è presente sia negli sporozoiti delle oocisti che negli sporozoiti delle ghiandole salivari^12,14. Utilizzando anticorpi specifici, questo metodo consente l'identificazione delle specie di Plasmodium e la sottotipizzazione CSP degli sporozoiti di P. vivax. Il razionale di questo test è la necessità di un semplice test ad alto rendimento per esaminare un gran numero di zanzare selvatiche per comprendere la trasmissione della malaria (cioè, determinare il tasso di infezione da sporozoiti).

Il metodo ELISA presenta due vantaggi chiave rispetto all'esame microscopico. In primo luogo, consente ai ricercatori di conservare i campioni di zanzara fino a quando non sono pronti per l'elaborazione dei campioni. In secondo luogo, il metodo ELISA può essere utilizzato per differenziare le specie di Plasmodium attraverso anticorpi monoclonali specie-specifici. Inoltre, l'ELISA può ospitare un numero maggiore di esemplari di zanzare, consentendo una produttività molto più elevata¹⁵. Rispetto alla PCR, che rileva il DNA degli sporozoiti, la procedura ELISA richiede più tempo ma costa meno¹⁶. Il test ELISA qui descritto è stato sviluppato per determinare l'infettività della zanzara e rilevare separatamente il CSP di P. falciparum e ciascuna delle due varianti CSP di P. vivax, VK210 e VK247. Questo metodo ELISA è stato utilizzato in molti studi per determinare le dinamiche stagionali dell'infezione da zanzare e identificare le specie dei principali vettori di malaria sul campo 12,13,17,18. Per eseguire questo test è sufficiente un laboratorio standard dotato di un lettore di piastre ELISA.

L'approccio generale è riassunto nella Figura 1. In questo ELISA a sandwich, l'anticorpo monoclonale primario (di cattura) specifico per ogni specie/sottotipo di Plasmodium viene utilizzato per la prima volta per rivestire la piastra ELISA. Ogni piastra è rivestita con un singolo mAb a cattura. La funzione dell'anticorpo monoclonale è quella di catturare l'antigene CSP corrispondente negli omogeneizzati di zanzara. Dopo la cattura dell'antigene e il lavaggio delle piastre, viene utilizzato un secondo anticorpo specifico per CSP marcato con perossidasi per rilevare la presenza di CSP legato al mAb di cattura. La reazione chimica catalizzata dalla perossidasi determina lo sviluppo del colore nei pozzetti positivi per CSP.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per un elenco di apparecchiature, reagenti e altri materiali di consumo utilizzati in questo protocollo e alla Tabella 1 per un elenco delle soluzioni e della loro composizione.

1. Cattura e anticorpi monoclonali coniugati con perossidasi
   1. Per ricostituire l'anticorpo monoclonale, risospendere l'anticorpo monoclonale liofilizzato in una miscela 1:1 di acqua distillata:glicerolo a 0,5 mg/mL. Preparare le aliquote secondo necessità per evitare ripetuti congelamenti-scongelamenti e conservarle a -20 °C.
2. Buffer di blocco (BB)
   1. Preparare il tampone bloccante sciogliendo 5 g di caseina di grado ELISA in 100 mL di NaOH 0,1 N. Aggiungere 900 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (vedere Tabella 1) per portare il volume finale a 1,0 L.
   2. Aggiungere 0,02 g di rosso fenolo come indicatore e regolare il pH a 7,4 con HCl. Conservare BB a 4 °C per un massimo di una settimana o aliquotare in 50 mL per la conservazione a lungo termine a -20 °C.
3. Controlli positivi
   1. Per ricostituire i controlli positivi, reidratare le proteine liofilizzate aggiungendo 1.000 μL di BB. Se necessario, fare delle aliquote delle soluzioni di controllo positivo stock e conservarle a -20 °C.
   2. Per la diluizione in serie, diluire ulteriormente ciascun controllo positivo fino alla concentrazione di lavoro finale in BB come segue: Pf, 2 pg/μL; Pv (VK210), 182 (pg/μL); PV (VK247), 89 pg/μL.
      NOTA: L'esatta concentrazione dei controlli positivi può variare da un lotto all'altro. Consultare la scheda informativa del prodotto per l'esatta concentrazione necessaria. Le concentrazioni di controllo positive, a partire dalla concentrazione di lavoro di cui sopra, sono 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL per Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μl per PV210; e 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 pg/μL PV247.
4. Controlli negativi
   NOTA: Il controllo negativo ideale è l'omogeneizzato testa-torace delle zanzare femmine di Anopheles preparato in modo identico ai campioni di prova. Tuttavia, BB può essere utilizzato anche come controllo negativo.
   1. Con BB come controllo negativo, utilizzare la soglia di assorbanza di 2 volte per letture positive affidabili.

2. Preparazione del campione di zanzara

1. Separare la testa e il torace di ogni zanzara adulta raccolta dall'addome con una lama di rasoio sterile. Posizionare la testa e il torace in una provetta da centrifuga da 1,5 ml preetichettata. Teste di piscina e toraci fino a 10 zanzare, se lo si desidera.
   NOTA: Per la preparazione del campione, in genere, la ghiandola salivare di una zanzara infetta verrà sezionata e sottoposta a CS-ELISA. Tuttavia, la testa e il torace delle zanzare raccolte possono anche essere utilizzati per eseguire direttamente il CS-ELISA (senza sezionare le ghiandole salivari)12,13,19.
2. Aggiungere 50 μl di tampone di macinazione (GB) in ciascuna provetta e omogeneizzare il campione con un pestello pulito (lavato con sapone). Sciacquare il pestello usato con 250 μL di GB nel tubo contenente la/e zanzara/e omogeneizzata/e fino a un volume finale di ~300 μL.
3. Conservare il campione in congelatore (-20 °C) fino all'uso o procedere immediatamente all'esecuzione dell'ELISA.

3. ELISA di sporozoite

1. Compila il foglio di lavoro ELISA sugli sporozoiti (vedi Materiale supplementare 1). Preparare una piastra ELISA per ogni CSP (Pf, Pv-210 o Pv-247).
2. Preparare la soluzione di lavoro per l'anticorpo monoclonale di cattura sciogliendo l'anticorpo in PBS: 4 μg/mL Pf; 2 μg/mL di Pv-210; 2 μg/mL di Pv-247. Calcolare i volumi necessari in base all'aggiunta di 5 mL per piastra. Agitare delicatamente la soluzione.
3. Pipettare 50 μl di ciascuna soluzione di mAb funzionante dalla fase 3.2 in ciascun pozzetto della piastra ELISA. Coprire la piastra con un coperchio di plastica e incubare per 30 minuti o per una notte a temperatura ambiente.
4. Aspirare il contenuto del pozzetto e picchiettare la piastra capovolta su carta assorbente almeno 5 volte per rimuovere tutto il liquido.
   NOTA: Se non è disponibile un sistema di aspirazione (aspirazione multicanale collegata ai puntali puliti), scaricare gli anticorpi nel lavandino e quindi picchiettare la piastra su carta assorbente.
5. Aggiungere 200 μl di BB per riempire tutti i pozzetti della piastra. Coprite il piatto con un coperchio di plastica. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente. Aspirare o scaricare il contenuto del pozzo. Picchiettare 5 volte la piastra capovolta su carta assorbente per rimuovere tutto il liquido.
6. Caricare l'omogeneizzato di zanzara e il controllo sulla piastra come segue.
   1. Aggiungere 50 μl di controllo positivo ai pozzetti H1 e H2.
   2. Aggiungere 50 μl di BB ai pozzetti nelle colonne 1 e 2 dalla riga C a G. Quindi, aggiungere 50 μl del controllo positivo nei pozzetti G1 e G2. Effettuare una diluizione seriale del controllo positivo partendo da G1 e G2 seguiti da F1 e F2 fino a C1 e C2.
      NOTA: Tutti i pozzetti di controllo positivo devono contenere 50 μl.
   3. Aggiungere 50 μl di BB (controllo negativo) ai pozzetti A1, A2, B1 e B2.
   4. Aggiungere 50 μl di ciascun campione di omogeneizzato in un pozzetto sconosciuto (Unk).
   5. Coprire la piastra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
7. Dopo circa 2 ore, iniziare a preparare i substrati. Per il kit a 2 componenti del substrato ABTS, miscelare il substrato A e il substrato B in un rapporto 1:1.
   NOTA: Una piastra completa a 96 pozzetti richiede 5 mL di substrato A e 5 mL di substrato B.
8. Preparare le soluzioni di lavoro di anticorpi monoclonali marcati con perossidasi per Pf, Pv-210 e Pv-247 aggiungendo BB al mAb coniugato ricostituito per ottenere una concentrazione di lavoro di 1 μg/mL.
   1. Calcolare i volumi necessari in base all'aggiunta di 5 mL di soluzione di mAb coniugato di lavoro per piastra.
   2. Testare l'attività della perossidasi mescolando 5 μL di mAb marcato con perossidasi prodotto nella fase 3.8 con 100 μL del substrato prodotto nella fase 3.7 in una provetta separata da 1,5 mL. Vorticare delicatamente.
      NOTA: Dovrebbe esserci un rapido cambiamento di colore da trasparente a verde, indicando che l'enzima perossidasi e i substrati stanno funzionando.
9. Aspirare o scaricare il contenuto del pozzetto e picchiettare 5 volte la piastra capovolta su carta assorbente per rimuovere tutto il liquido.
10. Lavare i pozzetti due volte con 200 μl di PBS-Tween, aspirare il contenuto del pozzetto e picchiettare la piastra 5 volte ciascuno.
11. Aggiungere 50 μL di mAb marcato con perossidasi prodotto al punto 3.8 in ciascun pozzetto. Coprire la piastra e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Aspirare o scaricare il contenuto del pozzetto e picchiettare la piastra a testa in giù su un tovagliolo di carta 5 volte.
12. Lavare i pozzetti 3 volte con 200 μl di PBS-Tween, aspirare il contenuto del pozzetto e picchiettare la piastra 5 volte ciascuno.
13. Aggiungere 100 μl della soluzione di substrato preparata al punto 3.7 a ciascun pozzetto. Coprire la piastra e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
14. Dopo 30 minuti, leggere l'assorbanza a 405-414 nm utilizzando un lettore di piastre ELISA.
    NOTA: Seguire le istruzioni specifiche per il lettore di piastre ELISA utilizzato. Per i dettagli sulle istruzioni del software utilizzato per questo protocollo, fare riferimento a Materiale supplementare S2. Dovrebbe esserci un notevole cambiamento di colore da trasparente a verde nei pozzetti di controllo positivo.

4. Analisi

1. Rilevamento di campioni positivi.
   1. Etichettare i campioni con valori di assorbanza superiori al cut-off (il doppio del valore medio di assorbanza dei campioni negativi) come positivi.
2. Quantificazione del CSP
   1. Stimare la concentrazione di CSP nel campione utilizzando la curva standard costruita dalla serie di diluizione di controllo come segue.
      1. Creare la curva standard tracciando i valori di assorbanza (asse y) dei controlli diluiti in serie rispetto alle loro concentrazioni (asse x).
      2. Esegui la regressione lineare per determinare l'adattamento migliore utilizzando y = A + Bx, dove A e B sono parametri liberi.
      3. Determinare la concentrazione CSP per ogni campione positivo risolvendo l'equazione per un dato valore di assorbanza.

Risultati

I risultati ELISA rappresentativi sono mostrati nella Figura 2. In questo esperimento, l'ELISA di P. falciparum ha rilevato un'infezione da sporozoiti nel pozzetto A7. Il pozzo positivo potrebbe essere rilevato visivamente dal suo debole colore verde (Figura 2A). Il valore di assorbanza di questo pozzetto era superiore alla soglia di cut-off (il doppio del valore medio dei quattro pozzetti di controllo negativo) (Figura 2B)...

Discussione

Il CSP-ELISA fornisce un metodo altamente specifico ed economico per rilevare il CSP del Plasmodium. Permette la discriminazione tra gli sporozoiti di P. falciparum e P. vivax, nonché tra i due sottotipi, VK210 e VK247, di P vivax^11,13,14,15. Alcuni punti critici dovrebbero essere considerati per ottenere risultati affidabili e riproducibili. Tutte le soluzi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
ELISA plate reader	BioTek Instrument, Inc.	Synergy H1	Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode
Grinder pestle	Axygen	PES-15-B-SI	For homogenizing the mosquito head/thorax
Reagents
ABTS substrate 2-component	KPL	50-62-00	For peroxidase driven detection
Blocking buffer (BB)			Note: solution
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs)			Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
Casein	Sigma aldrich	9000-71-9	For blocking buffer preparation
Grinding buffer (GB)			Note: solution
Igepal CA-630	Sigma aldrich	9002-93-1	For grinding buffer preparation
KCl	Sigma aldrich	7447-40-7	For phosphate buffer saline preparation
KH2PO4	Sigma aldrich	7778-77-0	For phosphate buffer saline preparation
Na2HPO4	Sigma aldrich	7558-79-4	For phosphate buffer saline preparation
NaCl	Sigma aldrich	7647-14-5	For phosphate buffer saline preparation
NaOH	Sigma aldrich	1310-73-2	For blocking buffer preparation
PBS-Tween
Pf capture mAb	CDC	Pf-CAP	For capturing Pf circumsporozoite protein
Pf peroxidase mAb	CDC	Pf-HRP	For detecting Pf circumsporozoite protein
Pf positive control	CDC	Pf-PC	Pf positive control
Phenol red	Sigma aldrich	143-74-8	For blocking buffer preparation
Phosphate buffered saline (PBS)			Note: solution
Positive controls			Note: solution
Pv210 capture mAb	CDC	Pv210-CAP	For capturing Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 peroxidase mAb	CDC	Pv210-HRP	For detecting Pv210 circumsporozoite protein
Pv210 positive control	CDC	Pv210-PC	Pv210 positive control
Pv247 capture mAb	CDC	Pv247-CAP	For capturing Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 peroxidase mAb	CDC	Pv247-HRP	For detecting Pv247 circumsporozoite protein
Pv247 positive control	CDC	Pv247-PC	Pv247 positive control
Tween20	Sigma aldrich	9005-64-5	For PBS-Tween preparation
Consumables
Disposable pipetting reservoirs	Generic		For working reagents
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS	Corning Life Science	2797	For ELISA
Gloves: disposable gloves and freezer gloves	Generic		For personal protection
Lab gown	Generic		for personal protection
Multichannel Pipette P30-300	Generic		For solution transfer
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000	Generic		For solution transfer
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL	Generic		For solution transfer
Serological pipettes 5 mL, 10 mL	Generic		For solution transfer
Transfer pipettes	Generic		For solution transfer