استخدام علم البصريات الوراثي لعكس المرونة العصبية وتثبيط البحث عن الكوكايين في الفئران

Summary

تحدد الطرق الموضحة هنا إجراء يستخدم لعكس اللدونة التي يسببها الكوكايين بصريا في دائرة ذات صلة سلوكيا في الفئران. يؤدي التحفيز البصري المستمر منخفض التردد لمشابك المهاد اللوزة إلى الاكتئاب على المدى الطويل (LTD). في الجسم الحي ، أدى LTD المستحث بصريا في الفئران ذات الخبرة في الكوكايين إلى التوهين اللاحق للبحث عن المخدرات بدافع جديلة.

Abstract

يوضح هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لاستخدام أدوات علم البصريات الوراثي لعكس اللدونة التي يسببها الكوكايين في دوائر المهاد اللوزة لتقليل سلوكيات البحث عن الكوكايين اللاحقة في الفئران. في بحثنا ، وجدنا أنه عندما تقوم الفئران بإعطاء الكوكايين عن طريق الوريد مقترنا بإشارة سمعية بصرية ، فإن نقاط الاشتباك العصبي التي تشكلت عند مدخلات من النواة الوراثية الإنسية للمهاد (MGN) على الخلايا العصبية الرئيسية في اللوزة الجانبية (LA) تصبح أقوى مع تعلم ارتباط الكوكايين. افترضنا أن عكس اللدونة التي يسببها الكوكايين في هذه المشابك من شأنه أن يقلل من سلوك البحث عن الكوكايين بدافع الإشارة. من أجل تحقيق هذا النوع من التعديل العصبي في الجسم الحي ، أردنا إحداث اكتئاب طويل الأجل متشابك (LTD) ، مما يقلل من قوة نقاط الاشتباك العصبي MGN-LA. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمنا علم البصريات الوراثي ، والذي يسمح بالتعديل العصبي لدوائر الدماغ باستخدام الضوء. تم التعبير عن opsin oChiEF المثير على محطات MGN قبل المشبكية في لوس أنجلوس عن طريق غرس AAV يحتوي على oChiEF في MGN. ثم تم زرع الألياف الضوئية في لوس أنجلوس وتم نبض ضوء الليزر 473 نانومتر بتردد 1 هرتز لمدة 15 دقيقة للحث على اللدونة التي يسببها الكوكايين LTD وعكسها. ينتج عن هذا التلاعب انخفاض طويل الأمد في قدرة الإشارات المرتبطة بالكوكايين على حث إجراءات البحث عن المخدرات.

Introduction

يعد تعاطي المخدرات مشكلة صحية عامة خطيرة للغاية في الولايات المتحدة وفي جميع أنحاء العالم. على الرغم من عقود من البحث المكثف ، هناك عدد قليل جدا من الخيارات العلاجية الفعالة ^1,2. نكسة كبيرة للعلاج هي حقيقة أن تعاطي المخدرات المزمن يولد ذكريات ترابطية طويلة الأجل بين الإشارات البيئية والدواء نفسه. تؤدي إعادة التعرض للإشارات المتعلقة بالمخدرات إلى استجابات فسيولوجية وسلوكية تحفز استمرار تعاطي المخدرات والانتكاس³. تتمثل الإستراتيجية العلاجية الجديدة في سن علاجات قائمة على الذاكرة تهدف إلى التلاعب بالدوائر المشاركة في تنظيم ارتباطات إشارات الأدوية. في الآونة الأخيرة ، لوحظ أن نقاط الاشتباك العصبي في اللوزة الجانبية (LA) ، وتحديدا تلك الناشئة عن النواة التناسلية الإنسية (MGN) للمهاد ، يتم تعزيزها عن طريق الإدارة الذاتية المتكررة المرتبطة بالكوكايين ، وأن هذا التقوية يمكن أن يدعم سلوك البحث عن الكوكايين ^4,5. لذلك ، تم اقتراح أنه يمكن تخفيف الإعادة التي يسببها جديلة عن طريق عكس اللدونة في نقاط الاشتباك العصبي MGN-LA.

كانت القدرة على استهداف اللدونة المشبكية بدقة لدائرة دماغية معينة تحديا كبيرا لهذا المجال. حققت الأدوات الدوائية التقليدية بعض النجاح في تقليل سلوكيات الانتكاس ، ولكنها محدودة بسبب عدم القدرة على التلاعب بنقاط الاشتباك العصبي الفردية. ومع ذلك ، فإن التطور الأخير في علم البصريات الوراثي في الجسم الحي قد وفر الأدوات اللازمة للتغلب على هذه القيود والتحكم في المسارات العصبية بدقة زمنية ومكانية⁶،^7،8. من خلال التعبير عن الأوبسينات الحساسة للضوء في دائرة دماغية معينة ، يمكن بعد ذلك استخدام ضوء الليزر لتنشيط الدائرة أو تثبيطها. يمكن استخدام التحفيز البصري المعتمد على التردد لمعالجة اللدونة المشبكية للدائرة على وجه التحديد في يتصرف.

توضح هذه المخطوطة الإجراء المتخذ لمعالجة دائرة MGN-LA ذات الصلة سلوكيا باستخدام علم البصريات الوراثي في الجسم الحي . أولا ، تم التعبير عن opsin oChIEF المثير في MGN وتم زرع الألياف الضوئية بشكل ثنائي في لوس أنجلوس. ثم تم تدريب الحيوانات على إعطاء الكوكايين ذاتيا بطريقة تعتمد على الإشارات ، مما يعزز مسار MGN-LA. بعد ذلك ، تم استخدام التحفيز المستمر منخفض التردد مع ضوء ليزر 473 نانومتر لإنتاج LTD خاص بالدائرة. أدى عكس اللدونة الناجمة عن تعاطي الكوكايين إلى انخفاض طويل الأمد في قدرة الإشارات على إطلاق الإجراءات المرتبطة بسلوك البحث عن المخدرات.

Protocol

كانت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول متسقة مع الإرشادات التي وضعها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة بيتسبرغ. تم تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام فئران Sprague-Dawley البالغة والساذجة التي تزن 275-325 جم عند الوصول.

1. بناء غرسات الألياف البصرية وكابلات التصحيح

1. تحضير غرسات الألياف البصرية باتباع البروتوكولات المنشورة مسبقا⁹. استخدمت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول 200 ميكرومتر من الألياف الأساسية (0.5 NA) و Ø1.25 مم متعدد الأوضاع LC / PC الطويق الخزفي ، حجم ثقب Ø230 μm.
   1. استخدم أداة Dremel لتسجيل الثلث السفلي من الطويق (الأقرب إلى النهاية المسطحة للحلقة). يساعد تسجيل الحلقات على البقاء ملتصقا بأسمنت الأسنان ، مما يزيد من احتمالية بقائهم آمنين طوال فترة التجريب.
   2. استخدم قواطع الأسلاك لقطع ~ 35 مم من الألياف. استخدم أداة تجريد الألياف لتجريد ~ 25 مم من الألياف ، وترك 10 مم غير مكشوفة.
   3. تحضير الايبوكسي القابل للمعالجة بالحرارة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حل 1 غرام من مسحوق الراتنج في 100 ملغ من مركب تصليب. قم بتوصيل إبرة قياس 25 بحقنة سعة 1 مل. املأ المحقنة بالإيبوكسي وأرفق طرف إبرة قياس 25.
   4. استخدم نائبا أو مشبكا لتثبيت الطويق بإحكام بحيث يكون الجانب المسطح متجها لأعلى والجانب المحدب متجها لأسفل. باستخدام المحقنة المملوءة بالإيبوكسي ، أضف قطرة واحدة من الإيبوكسي إلى الجانب المسطح من الطويق ، مع توخي الحذر لمسح الإيبوكسي الزائد من جوانب الطويق.
   5. أدخل الجزء المجرد من الألياف من خلال الطويق مما يسمح بتعريض 5 مم إضافية من الألياف المجردة. في حالة غرسات LA ، سيتم زرع الألياف 7.9 مم بطني إلى بريجما ، لذلك يجب أن يكون الطول المكشوف للألياف غير المجردة ~ 13 مم.
   6. عالج الإيبوكسي بمسدس حراري لمدة 30-40 ثانية حتى يتحول لونه إلى اللون الأسود / الكهرماني.
   7. سجل الألياف مباشرة في واجهة الطرف المحدب من الطويق بسكين الماس واستخدم إصبعك للاستفادة برفق من الألياف.
   8. قم بتلميع الطرف المحدب للحلقة عن طريق الإمساك بمرقئ ، والتأكد من تطبيق ضغط متساو ، وإجراء 20 دورة دائرية لكل منها على سلسلة من ورق التلميع (من الدرجة العالية إلى الدرجة المنخفضة ؛ 5 ، 3 ، 1 ، 0.3 ميكرومتر).
   9. قم بتأمين الألياف غير المجردة على الطاولة باستخدام الشريط والألياف المجردة ، مع ترك 2 مم إضافية خارج الإحداثيات البطنية (بالنسبة لغرسات LA ، الطول النهائي للألياف هو ~ 10 مم). استخدم مرقئ لسحب الطويق وكسر الألياف بالتساوي حيث تم تسجيلها. احرص على عدم قطع الألياف تماما عند التسجيل ، وإلا فسوف يتلف قلب الألياف.
2. بناء كابلات التصحيح المتوافقة مع غرسات الألياف البصرية. تم شراء كابلات تصحيح مصممة خصيصا (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، يمكن إنشاء كبلات التصحيح باتباع البروتوكولات المنشورة مسبقا⁹.
   ملاحظة: يجب أن يتطابق قطر و NA لألياف الطويق وألياف كابل التصحيح عند تقاطع التوصيل لمنع الفقد الزائد للضوء ، مما قد يؤدي إلى فشل في تحفيز النشاط العصبي بشكل كاف.
3. قم بقياس خرج الضوء من خلال كابل التصحيح وغرسات الألياف البصرية عن طريق توصيل كابل التصحيح / الألياف البصرية بمصدر ضوء ليزر مناسب (473 نانومتر ، خرج 1 ميجاوات) وقياس الإخراج باستخدام مستشعر الضوء. ستصدر الألياف التي تم إنشاؤها بنجاح دائرة متحدة المركز من الضوء ولن تفقد الضوء أكثر من 30٪.

2. القسطرة الوريدية للقوارض ، وتوصيل الفيروسات ، وزرع الألياف البصرية

1. إعداد الحيوان للجراحة.
   1. تخدير الفئران بالكامل بمخدر من اختيارك بناء على المبادئ التوجيهية المؤسسية. أحد الخيارات هو كيتامين هيدروكلوريد (87.5-100 ملغم / كغم ، أي متر) وزيلازين هيدروكلوريد (5 ملغم / كغم ، أي متر). تأكد من تخدير الجرذ بالكامل عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.
      تنبيه: الكيتامين مادة خاضعة للرقابة يجب التعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
      ملاحظة: يستخدم الحقن العضلي للتخدير في هذه الدراسة لأنه أنتج تحريضا تخديريا أسرع وأكثر موثوقية من الحقن داخل الصفاق. راقب باستمرار تنفس الفئران واستجابتها وقدم الدعم الحراري طوال الجراحة.
   2. حلق مساحة كبيرة من ظهر الجرذ (أعلى الظهر من أعلى لوحي الكتف مباشرة إلى منتصف الظهر) وكذلك منطقة الرقبة أسفل الطرف الأمامي الأيمن وفروة الرأس.
   3. ضع الجرذ في منطقة الجراحة وقم بتطبيق puralube (دموع اصطناعية) على العينين. حقن حجم وزن الجسم من كاربروفين (مسكن) تحت الجلد (s.c.) من خلال الجلد من الجزء العلوي من الظهر ، ثم حقن 5 مل من محلول Lactated Ringer s.c. من خلال جلد أسفل الظهر.
   4. تعقيم جميع المواقع الجراحية عن طريق ترطيب قطعة من الشاش المعقم بالبيتادين ومسحها أسفل المنطقة الجراحية المحلوقة باستخدام حركة دائرية. ثم كرر العملية مع 70 ٪ من الإيثانول. كرر هذه الدورة المتناوبة ثلاث مرات.
2. إجراء زرع القسطرة في الوريد وفقا للبروتوكولات المنشورة مسبقا^4،10.
   ملاحظة: لا يتم استخدام الستارة الجراحية أثناء هذه الجراحة لتجنب التهيج أثناء زرع القسطرة. تعقيم جميع الأدوات والمعدات قبل الاستخدام. استخدم قفازات معقمة وقم بتغيير القفازات إذا تم ملامسة أي سطح غير معقم.
3. مباشرة بعد زرع القسطرة ، قم بتأمين الجرذ في إطار مجسم لإجراء حقن AAV.
   1. إعطاء حقنة تحت الجلد (s.c) من 2٪ ليدوكائين (0.2-0.3 مل) إلى فروة الرأس كمخدر موضعي.
      ملاحظة: لا يستخدم المخدر الموضعي أثناء زرع القسطرة الوريدية لتجنب التغييرات في النتائج الجراحية.
   2. قم بتوصيل قنية حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ عيار 26 بحقنة هاملتون مملوءة ب 1 ميكرولتر من محلول AAV المركز: إما AAV5-hSyn-tdTomato أو AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      ملاحظة: oChIEF هو نوع مختلف من قناة الأوبسين الحساسة للضوء الأزرقرودوبسين (ChR2) ، والتي يمكن أن تستجيب لمجموعة واسعة من الترددات ^8,11 ، وبالتالي فهي مفيدة لتجارب LTD منخفضة التردد التي تمت مناقشتها في هذا البروتوكول ، ولكن أيضا لتجارب LTP عالية التردد (لم تتم مناقشتها هنا). تم التبرع ببناء oChIEF من قبل الدكتور روجر تسيين ومعالجته للتغليف والتنقية بواسطة Duke Viral Vector Core. هناك حاجة إلى 3-4 أسابيع على الأقل بين يوم الحقن ويوم تحريض LTD للسماح بالتعبير الأمثل للفيروس في نهايات محور MGN.
      تنبيه: بشكل عام ، يعتبر AAV ككائن من المستوى 1 للسلامة الأحيائية (BSL-1) ، مع انخفاض خطر الإصابة بالعدوى الذاتية ما لم يتم استخدام فيروس مساعد في إنتاجه. يتطلب استخدامه موافقة IACUC ويجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات وفقا للإرشادات المؤسسية للحد من التعرض غير الضروري.
   3. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق 0.5 مم من مقدمة الجمجمة إلى مؤخرتها ، وقم بإزالة الأنسجة العلوية لكشف سطح الجمجمة.
   4. قم بتسوية رأس الجرذ في المحور الأمامي / الخلفي والإحداثيات المجسمة الصفرية إلى bregma.
   5. حفر ثلاثة ثقوب صغيرة من خلال الجمجمة باستخدام أداة Dremel مجهزة مثقاب صغير. استخدم مفك البراغي لتركيب مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ (M2x4 965-A2) بإحكام في مكانها.
      ملاحظة: البراغي ضرورية للربط السليم لأسمنت الأسنان وإنشاء أغطية رأس متينة وطويلة الأمد. يجب أن ينتشر موضع البراغي عبر المحور الأمامي الخلفي للجمجمة ، وبعيدا عن موقع حقن AAV.
   6. حفر ثقوب ثنائية لحقن AAV بناء على الإحداثيات من أطلس دماغ الفئران (Watson و Paxinos)¹² للجزء الإنسي من النواة التناسلية الإنسية (MGN) ؛ بالملليمتر من بريغما ، ا ف ب: -5.4 ؛ ML: ±3.0; DV: -6.6. خفض قنية الحقن ببطء (4 مم / دقيقة) حتى يتم وضعها في MGN. حقن محلول AAV المركز بمعدل 0.1 ميكرولتر / دقيقة.
   7. اترك قنية الحقن في مكانها لمدة 5 دقائق بعد اكتمال الحقن للسماح بالانتشار بعيدا عن القنية ثم اسحب القنية ببطء من الدماغ.
4. مباشرة بعد حقن الفيروس ، استمر في زرع الألياف البصرية ^4,9 التي تستهدف محطات MGN-LA.
   1. استخدم أداة Dremel لحفر ثقوب ثنائية لزراعة الألياف البصرية التي تستهدف اللوزة الجانبية (بالملليمتر من bregma ، AP: -3.0 ؛ مل ±5.1).
   2. استخدم الملقط للاستيلاء على حلقة غرسة الألياف البصرية وتثبيتها في المحولات المجسمة بحيث يتم تثبيتها بإحكام في مكانها.
   3. خفض الألياف ببطء بمعدل 2 مم / دقيقة ، حتى يستقر طرف الألياف في الجزء الظهري من LA (DV: -7.9 مم).
   4. قم بتثبيت الحلقات في الجمجمة أولا باستخدام طبقة رقيقة من لاصق Loctite الفوري متبوعا بأسمنت الأسنان وحلقات الغطاء بأكمام الطويق بقطر 1.25 مم وأغطية الغبار.
      ملاحظة: يجب الموافقة على اختيار المادة اللاصقة لتأمين الحلقات إلى الجمجمة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المحلية أو المؤسسية. يستخدم Loctite لهذه الدراسة لتأمين الحلقات بشكل موثوق إلى الجمجمة بعد التجربة والخطأ مع مواد لاصقة متعددة. ومع ذلك ، يمكن النظر في البدائل المتاحة.
5. بعد العمليات الجراحية ، الفئران المنزل بشكل فردي ، وتوفير حرية الوصول إلى الطعام والماء. توفير رعاية ما بعد الجراحة بما يتفق مع المبادئ التوجيهية المؤسسية. اغسل القسطرة يوميا بمحلول ملحي يحتوي على جنتاميسين (5 مجم / مل) وهيبارين (30 USP / مل) للحفاظ على المباح. بعد 5 أيام على الأقل من الجراحة و 24 ساعة قبل بدء التجارب السلوكية ، يقيد الطعام الفئران إلى ~ 90٪ من وزنها الحر.

3. الإدارة الذاتية للقوارض الكوكايين وانقراض رافعة مفيدة

ملاحظة: يتم إجراء جميع الإجراءات السلوكية في غرف تكييف قياسية ، ومجهزة برافعتين قابلتين للسحب على جدار واحد ، وضوء تحفيز فوق كل رافعة ، ومولد نغمة ، ومصباح منزل ، ومضخة تسريب.

1. إخضاع الفئران لدورات تدريبية يومية على الإدارة الذاتية للكوكايين لمدة ساعة واحدة (2 مجم / مل) بموجب جدول FR1 للتعزيز.
   1. ضع الفئران في غرفة التشغيل كل يوم واسمح للفئران بالضغط على الرافعة. يؤدي الضغط على "الرافعة النشطة" المعينة (المتوازنة عبر الرافعات اليمنى واليسرى) إلى تسريب الكوكايين (1.0 مجم / كجم / تسريب) وعرض 10 ثوان لإشارة مركبة للضوء والنغمة. الضغط على "الرافعة غير النشطة" المعينة ليس له تأثيرات مبرمجة.
   2. استمر في تجارب الإدارة الذاتية لمدة 10 أيام على الأقل وحتى تكسب الفئران بنجاح ما لا يقل عن 8 دفعات / يوم على مدار 3 أيام متتالية. يؤدي الفشل في الوصول إلى معايير الاستحواذ بحلول اليوم 20 إلى الاستبعاد من الدراسة.
2. بعد استيفاء معايير الاستحواذ بنجاح ، تخضع الفئران لجلسات انقراض مفيدة لمدة 1 ساعة لمدة 6-10 د.
   1. ضع الفئران في غرف فعالة واسمح للفئران بالضغط بحرية. ومع ذلك ، فإن الاستجابات على كل من الروافع النشطة وغير النشطة ليس لها عواقب مبرمجة.
   2. اجعل الفئران تستمر في الانقراض الفعال يوميا حتى يحدث ما معدله < 25 ضغطة رافعة على مدار يومين متتاليين.

4. في الجسم الحي تحريض البصريات الوراثية المحدودة

ملاحظة: تجري تجارب تثبيط البصريات الوراثية بعد 24 ساعة من اليوم الأخير من الانقراض الآلي.

1. قم بتوصيل أسلاك التصحيح بصمام ليزر أزرق 473 نانومتر عبر مفصل دوار معلق فوق قفص إسكان قوارض قياسي نظيف مع إزالة الغطاء. يسمح هذا الإعداد للقوارض بالتحرك بحرية حول القفص أثناء التحفيز البصري الوراثي.
2. قم بتشغيل صمام الليزر الثنائي وفقا لتعليمات التشغيل وقم بتوصيله بمولد النبض. ضبط الإعدادات ، بحيث عند تشغيل الفئران سوف تتلقى 900 نبضة 2 مللي ثانية من الضوء عند 1 هرتز.
   تنبيه: يجب استخدام حماية العين المناسبة في جميع الأوقات أثناء تشغيل الليزر.
3. قم بقياس شدة الضوء من خلال سلك التصحيح باستخدام مستشعر الضوء. اضبط شدة الليزر بحيث يكون خرج الضوء عبر كابل التصحيح ~ 5-7 ميغاواط.
4. ضع الفئران في قفص سكني نظيف. إزالة أغطية الغبار والأكمام الطويق ، وفضح الحلقات. قم بتوصيل أسلاك التصحيح بشكل ثنائي بغرسات الألياف البصرية. اسمح للفئران باستكشاف البيئة لمدة 3 دقائق قبل تحريض LTD.
5. قم بتشغيل مولد النبض لبدء التحفيز البصري الوراثي.
   ملاحظة: على الرغم من أنه من غير المحتمل ، إذا واجهت الفئران أي ردود فعل سلبية للتحفيز ، يتم إنهاء التجربة على الفور ، ويتم القتل الرحيم للفئران بشكل صحيح بناء على المبادئ التوجيهية المؤسسية.
6. بعد تحريض LTD ، احتفظ بالفئران في القفص لمدة 3 دقائق ، ثم ضعها مرة أخرى في أقفاصها المنزلية.
7. بالنسبة لتجارب التحكم ، استخدم نفس إجراء التحفيز على الفئران التي تعبر عن فيروس التحكم AAV5-tdTomato . بالنسبة للتجارب الوهمية ، قم بتوصيل سلك تصحيح بالألياف البصرية للفئران التي تعبر عن فيروس AAV5-oChIEF ، ولكن لا يتم تقديم أي تحفيز خلال جلسة مدتها 15 دقيقة.

5. اختبار تأثير التحفيز البصري الوراثي على البحث عن الكوكايين الناجم عن جديلة

1. بعد 24 ساعة من التحفيز البصري الوراثي في الجسم الحي ، ضع الفئران مرة أخرى في غرف تكييف فعالة. تخضع الفئران لجلسة إعادة قياسية مستحثة بالإشارة لمدة 1 ساعة لتقييم سلوك البحث عن الكوكايين.
   ملاحظة: أثناء الإعادة المستحثة بالإشارة ، ينتج عن الاستجابة على الرافعة النشطة عرض تقديمي لمدة 10 ثوان للإشارة المرتبطة بالكوكايين ، ولكن بدون حقن الكوكايين.
2. إعطاء اختبار إعادة ثان على الأقل 1 أسبوع بعد الاختبار الأول لتحديد ما إذا كان تحريض OPTOGENETIC LTD يؤدي إلى قمع طويل الأمد للبحث عن الكوكايين

6. تلطيخ ، مضان ، والتصوير للتحقق النسيجي من التعبير الفيروسي ووضع الألياف البصرية

1. اصنع 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) و 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). قم بتخزين كلا الحلين على الجليد. يعتمد الحجم الإجمالي على عدد الفئران في الدراسة (سيتم استخدام ~ 100 مل من PBS و 200 مل من PFA لكل فأر).
   تنبيه: PFA مادة كيميائية سامة ومسرطنة معروفة. توخي الحذر المناسب لتجنب الاستنشاق وكذلك ملامسة الجلد. يجب أن يكون استخدامه والتخلص منه وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ، بما في ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة وغطاء التدفق الكيميائي.
2. قم بإعداد المضخة التمعجية بمعدل تدفق 20 مل / دقيقة. ملء أنابيب المضخة مع 1x PBS. قم بتوصيل إبرة قياس 20 بنهاية الأنبوب.
3. تخدير الفئران بعمق باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغم / كغم ، أي ب). تأكد من عمق التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم قبل المضي قدما.
   ملاحظة: يستخدم بنتوباربيتال الصوديوم لأن التروية هي إجراء نهائي.
4. استخدم المقص الجراحي لفتح تجويف البطن للفأر أسفل الحجاب الحاجز. قطع من خلال القفص الصدري بشكل دائري على طول الحواف الجانبية لفضح قلب الفئران. استخدم مرقئ لتثبيت الجزء المنقاري من القفص الصدري بعيدا عن القلب. اقطع أي أنسجة دهنية تحيط بالقلب.
5. أدخل الإبرة الحادة عبر البطين الأيسر وصولا إلى الشريان الأورطي. اقطع ثقبا صغيرا في الأذين الأيمن لتصريف المحلول عند عودته إلى القلب.
6. قم بأداء كل فأر مع 1x PBS لمدة 5 دقائق متبوعا ب 4٪ PFA ، درجة الحموضة 7.4 لمدة 10 دقائق.
7. قطع رأس الفئران ، واستخراج الدماغ ، وإصلاحه في 4 ٪ PFA لمدة 24 ساعة. ثم نقل الدماغ إلى محلول السكروز 30 ٪ لمدة 2-3 د.
8. قسم الأدمغة عند 50 ميكرومتر باستخدام cryostat.
9. قم بتركيب جميع الشرائح التي تحتوي على LA أو MGN على شرائح زجاجية وغطاء غطاء.
10. شرائح الصورة باستخدام مجهر فوق الفلورسنت للتحقق من تعبير AAV-oChIEF-tdTomato في MGN وإسقاطاته على LA ، بالإضافة إلى وضع الألياف البصرية فوق LA.

7. التروية وإعداد شريحة الدماغ الحادة لتجارب الفيزيولوجيا الكهربية

ملاحظة: يتم إجراء تجارب الفيزيولوجيا الكهربية على مجموعة فرعية من الحيوانات للتحقق من نجاح في الجسم الحي LTD.

1. تحضير محاليل الفيزيولوجيا الكهربية باستخدام الكواشف المدرجة في الجداول 1-3^4،13. اضبط الرقم الهيدروجيني لجميع المحاليل على 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك واضبط الأسمولية على 300-310 مللي أوسم / كجم H₂O. اجعل المحاليل طازجة قبل التجارب وخزنها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تشبع جميع المحاليل بالكاربوجين (95٪ O 2/5٪ CO₂) في جميع الأوقات أثناء الاستخدام.
2. باستخدام isoflurane وفقا لإرشادات رعاية واستخدام الحيوانات المحلية أو المؤسسية ، تخدير الفئران بعمق في غرفة القتل الرحيم المغلقة.  تأكد من أن الحيوان قد تم تخديره بالكامل عن طريق منعكس قرصة إصبع القدم.
3. املأ دورقا صغيرا ب 50 مل من محلول القطع بالثلج البارد. املأ أنبوب المضخة التمعجية بالمحلول واضبط معدل التدفق على 20 مل / دقيقة. قم بتوصيل إبرة قياس 20 بنهاية الأنبوب.
4. افتح تجويف البطن (انظر الخطوتين 6.4 و 6.5) وقم بتغذية الفئران لفترة وجيزة بمحلول القطع (بحد أقصى 1-2 دقيقة).
5. بعد التروية ، قطع رأس الفئران على الفور. قم بإزالة الدماغ وضعه في دورق صغير مملوء بمحلول قطع 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية -1 دقيقة.
6. نقل العقول مع ملعقة وتثبيتها بسرعة إلى غرفة الاهتزاز. قم بإزالة الحنون باستخدام ملقط ناعم. املأ الحجرة بمحلول قطع 4 درجات مئوية وقم بإعداد شرائح إكليلية حادة (بسمك 250 ميكرومتر) من اللوزة بسرعة 0.37 مم / ثانية وتردد 70 هرتز.
7. عند الحصول على الشرائح، توضع كل شريحة في حجرة مملوءة بمحلول التقطيع وتحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة. يمكن الحصول على حوالي 5-7 شرائح تحتوي على LA لكل.
8. انقل الشرائح إلى دورق من محلول تثبيت بدرجة حرارة الغرفة (RT) واتركها تتعافى لمدة >30 دقيقة قبل التجربة.
   ملاحظة: تظل الشرائح صحية بشكل عام مع الاحتفاظ بها في محلول لمدة 4-6 ساعات. نظرا لطبيعة الفلورسنت ل AAV ، يتم الاحتفاظ بالشرائح في ظروف الإضاءة المنخفضة.

8. تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية خارج الجسم الحي

1. تحضير المحاليل داخل الخلايا باستخدام الكواشف المدرجة في الجداول 4-5.
   ملاحظة: يجب عمل المحاليل داخل الخلايا قبل التجارب ويمكن تخزينها على المدى الطويل (3-12 شهرا) عند -80 درجة مئوية أو قصيرة الأجل (1-2 أشهر) عند -20 درجة مئوية. يتم ضبط الأس الهيدروجيني للمحاليل إلى 7.3 (مع CsOH للمحلول داخل الخلايا القائم على Cs ومع KOH للمحلول داخل الخلايا القائم على K). اضبط على الأسمولية النهائية البالغة 290-300 mOsm/kg H₂O.
2. تحضير محلول مخزون بيكروتوكسين 500 مللي مول مذاب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
   ملاحظة: يتم اقتباس مخزونات البيكروتوكسين وتخزينها عند -20 درجة مئوية. في يوم الاستخدام ، يتم إذابة القسمة وإضافتها إلى محلول التسجيل بتركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر.
   تنبيه: البيكروتوكسين هو مضاد غير تنافسي لمستقبلات GABA_A ، لذا فإن تسريب البيكروتوكسين له تأثير تحفيزي. وهو شديد السمية عن طريق الابتلاع عن طريق الفم أو امتصاص الجلد. يجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات عند العمل مع البيكروتوكسين.
3. انقل الشرائح إلى مجهر عمودي مصمم لتجارب الفيزيولوجيا الكهربية.
4. أثناء التجارب ، قم بتسخين شرائح الصمامات باستمرار بمحلول التسجيل الذي يتم تسخينه إلى 31-33 درجة مئوية.
5. قم بتكبير LA باستخدام هدف 4x. تحديد الخلايا العصبية الرئيسية عن طريق التشكل باستخدام عدسة غمر الماء 40x.
6. استخدم ماصة زجاجية (3-5 MΩ) مملوءة إما بمحلول داخل الخلايا قائم على Cs (لتجارب مشبك الجهد) أو محلول داخل الخلايا قائم على K (لتجارب المشبك الحالي) للحصول على تسجيلات مشبك تصحيح الخلية الكاملة.
7. تحديد الإسقاطات المحورية MGN المصابة ب AAV تحت التألق (باستخدام مرشح RFP). تحفيز الإسقاطات باستخدام ليزر DPSS ذو الضوء الأزرق (473 نانومتر) المتصل بمولد النبض.
   تنبيه: للحد من التعرض لليزر ، يقترن ضوء الليزر الموازي بمنفذ فلورسنت على المجهر ويركز على الشريحة من خلال الهدف.
   ملاحظة: في وضع مشبك الجهد ، يتم إثارة التيارات بعد المشبكية المثيرة (EPSCs) بصريا عند 0.1 هرتز. ستظهر الخلايا العصبية التي تتلقى مدخلات من الخلايا العصبية MGN المصابة ب AAV EPSCs موثوقة.
8. للحث على ex vivo LTD ، في وضع المشبك الحالي ، سجل خط أساس مستقر لإمكانات ما بعد المشبكي المثيرة (EPSPs) لمدة 10 دقائق على الأقل. بعد ذلك ، قم بتوصيل 900 نبضة 2 مللي ثانية من ضوء 473 نانومتر بتردد 1 هرتز (الوقت الإجمالي = 15 دقيقة). ثم سجل EPSPs باستمرار عند 0.1 هرتز لمدة ≥60 دقيقة.

النتائج

يوضح الشكل 1 جدولا زمنيا يوضح ترتيب التجارب. خلال التجارب السلوكية ، يعمل عدد دفعات الكوكايين بالإضافة إلى عدد الاستجابات التي يتم إجراؤها على الرافعة النشطة كمقياس لشدة سلوك البحث عن الكوكايين. وخلال الأيام الأولى من تعاطي الكوكايين ذاتيا، ينبغي أن يزداد عدد الاستجابات ?...

Discussion

كما هو موضح أعلاه ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة المهمة لتحقيق النتائج التجريبية المناسبة. من المحتمل أن يكون البروتوكول فعالا فقط في الحيوانات التي تحصل على الإدارة الذاتية للكوكايين بشكل صحيح ، وحتى الآن ، تم اختباره فقط باستخدام المعلمات الموضحة أعلاه. من الممكن تعديل جرعة الكوكايي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP Magnesium Salt	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calcium chloride	Fisher Scientific	C1016
Cesium chloride	Fisher Scientific	289329
Cesium hydroxide	Fisher Scientific	516988
Cesium methanesulfonate	Fisher Scientific	C1426
Cocaine HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemistry Stockroom	200C5000
Ferrule Dust Caps	Thor Labs	CAPL	White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic	Thor Labs	FP200URT	200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint	Prizmatix	(Ordered from Amazon)	18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodium Salt	Fisher Scientific	G8877
Hamilton syringe	Hamilton	80085	10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
Ketamine HCl	Henry Schein	55853	Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s	Henry Schein	9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione	Fisher Scientific	G4251
Lidocaine	Butler Schein	14583
Light Sensor	Thor Labs	PM100D	Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive	Grainger	5E207
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump	Harvard Apparatus	70-4501	Dual syringe
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microscope for electrophysiology
Microscope	Olympus	BX61VS	Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet dental cement, liquid	Lang Dental	1504BLK	black
Orthojet dental cement, powder	Lang Dental	1530BLK	Contemporary powder, black
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch Cables	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polishing Disc	Thor Labs	D50FC
Polishing Pad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polishing Paper	Thor Labs	LFG5P	5 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG3P	3 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG1P	1 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm grit
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	P5958
Potassium methanesulfonate	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1064980500
Sodium L-Ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Sodium Pentobarbital	Henry Schein	24352
Sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphocreatine	Fisher Scientific	P7936
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Stainless steel machine screws	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Tissue Adhesive	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198