Uso de la optogenética para revertir la neuroplasticidad e inhibir la búsqueda de cocaína en ratas

Resumen

Los métodos descritos aquí describen un procedimiento utilizado para revertir optogenéticamente la plasticidad inducida por la cocaína en un circuito conductualmente relevante en ratas. La estimulación óptica sostenida de baja frecuencia de las sinapsis tálamo-amígdala induce depresión a largo plazo (LTD). La LTD inducida optogenéticamente in vivo en ratas experimentadas con cocaína resultó en la posterior atenuación de la búsqueda de drogas motivada por señales.

Resumen

Este protocolo demuestra los pasos necesarios para usar herramientas optogenéticas para revertir la plasticidad inducida por la cocaína en los circuitos tálamo-amígdala para reducir los comportamientos posteriores de búsqueda de cocaína en la rata. En nuestra investigación, descubrimos que cuando las ratas se autoadministran cocaína intravenosa combinada con una señal audiovisual, las sinapsis formadas en las entradas del núcleo geniculado medial del tálamo (MGN) en las neuronas principales de la amígdala lateral (LA) se vuelven más fuertes a medida que se aprende la asociación señal-cocaína. Planteamos la hipótesis de que la reversión de la plasticidad inducida por la cocaína en estas sinapsis reduciría el comportamiento de búsqueda de cocaína motivado por señales. Para lograr este tipo de neuromodulación in vivo, queríamos inducir la depresión sináptica a largo plazo (LTD), que disminuye la fuerza de las sinapsis MGN-LA. Para ello, utilizamos la optogenética, que permite la neuromodulación de los circuitos cerebrales utilizando la luz. La opsina excitatoria oChiEF se expresó en terminales MGN presinápticos en el LA mediante la infusión de un AAV que contenía oChiEF en el MGN. Luego se implantaron fibras ópticas en el LA y se pulsó luz láser de 473 nm a una frecuencia de 1 Hz durante 15 minutos para inducir LTD y revertir la plasticidad inducida por la cocaína. Esta manipulación produce una reducción duradera en la capacidad de las señales asociadas con la cocaína para inducir acciones de búsqueda de drogas.

Introducción

El abuso de sustancias es un problema de salud pública muy grave en los Estados Unidos y en todo el mundo. A pesar de décadas de intensa investigación, hay muy pocas opciones terapéuticas efectivas ^1,2. Un revés importante para el tratamiento es el hecho de que el uso crónico de drogas genera recuerdos asociativos a largo plazo entre las señales ambientales y la droga en sí. La reexposición a señales relacionadas con las drogas impulsa respuestas fisiológicas y conductuales que motivan el uso continuo de drogas y la recaída³. Una estrategia terapéutica novedosa es promulgar tratamientos basados en la memoria que tienen como objetivo manipular los circuitos involucrados en la regulación de las asociaciones de señales de drogas. Recientemente, se observó que las sinapsis en la amígdala lateral (LA), específicamente las que surgen del núcleo geniculado medial (MGN) del tálamo, se fortalecen con la autoadministración repetida de cocaína asociada a la señal, y que esta potenciación puede apoyar el comportamiento de búsqueda de cocaína ^4,5. Por lo tanto, se propuso que la reincorporación inducida por señales podría atenuarse invirtiendo la plasticidad en las sinapsis MGN-LA.

La capacidad de apuntar con precisión a la plasticidad sináptica de un circuito cerebral específico ha sido un gran desafío para el campo. Las herramientas farmacológicas tradicionales han tenido cierto éxito en la disminución de los comportamientos de recaída, pero están limitadas por la incapacidad de manipular las sinapsis individuales. Sin embargo, el reciente desarrollo de la optogenética in vivo ha proporcionado las herramientas necesarias para superar estas limitaciones y controlar las vías neuronales con precisión temporal y espacial ^6,7,8. Al expresar opsinas sensibles a la luz en un circuito cerebral específico, la luz láser se puede usar para activar o inhibir el circuito. La estimulación óptica dependiente de la frecuencia se puede utilizar para manipular específicamente la plasticidad sináptica del circuito en un animal que se comporta.

Este manuscrito describe el procedimiento tomado para manipular el circuito MGN-LA relevante para el comportamiento utilizando optogenética in vivo . En primer lugar, la opsina excitatoria oChIEF se expresó en el MGN y las fibras ópticas se implantaron bilateralmente en el LA. Luego, los animales fueron entrenados para autoadministrarse cocaína de una manera dependiente de la señal, lo que potencia la vía MGN-LA. A continuación, se utilizó estimulación sostenida de baja frecuencia con luz láser de 473 nm para producir LTD específico para el circuito. Revertir la plasticidad inducida por el consumo de cocaína generó una reducción duradera en la capacidad de las señales para desencadenar acciones que están asociadas con el comportamiento de búsqueda de drogas.

Protocolo

Los experimentos descritos en este protocolo fueron consistentes con las pautas establecidas por la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Todos los procedimientos se realizaron con ratas Sprague-Dawley adultas e ingenuas que pesaban 275-325 g a su llegada.

1. Construcción de implantes de fibra óptica y cables de conexión

1. Preparar los implantes de fibra óptica siguiendo los protocolos publicados anteriormente⁹. Los experimentos descritos en este protocolo utilizaron fibra de núcleo de 200 μm (0,5 NA) y virola cerámica LC/PC multimodo de Ø1,25 mm, tamaño de orificio de Ø230 μm.
   1. Use una herramienta Dremel para puntuar el tercio inferior de una virola (más cercano al extremo plano de la virola). La puntuación de las virolas les ayuda a mantenerse unidos al cemento dental, lo que aumenta la probabilidad de que permanezcan seguros durante toda la experimentación.
   2. Use cortadores de alambre para cortar ~ 35 mm de fibra. Use la herramienta de extracción de fibra para pelar ~ 25 mm de fibra, dejando 10 mm sin exponer.
   3. Prepare epoxi curable por calor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Disuelva 1 g de polvo de resina en 100 mg de compuesto endurecedor. Coloque una aguja roma de calibre 25 a una jeringa de 1 ml. Llene la jeringa con epoxi y coloque una punta de aguja roma de calibre 25.
   4. Use un vicio o abrazadera para sujetar firmemente la virola con el lado plano hacia arriba y el lado convexo hacia abajo. Con la jeringa llena de epoxi, agregue una gota de epoxi al lado plano de la virola, teniendo cuidado de limpiar el exceso de epoxi de los lados de la virola.
   5. Inserte la porción pelada de fibra a través de la virola dejando expuestos 5 mm adicionales de fibra pelada. En el caso de los implantes LA, la fibra se implantará 7,9 mm ventral a bregma, por lo que la longitud expuesta de la fibra sin pelar debe ser ~ 13 mm.
   6. Cura el epoxi con una pistola de calor durante unos 30-40 s hasta que se vuelva de color negro / ámbar.
   7. Marque la fibra directamente en la interfaz del extremo convexo de la virola con un cuchillo de diamante y use un dedo para golpear suavemente la fibra.
   8. Pule el extremo convexo de la virola sosteniendo con un hemostático, asegurándose de aplicar una presión uniforme y haciendo 20 rotaciones circulares cada una en una serie de papel de pulir (de alto grado a bajo grado; 5, 3, 1, 0.3 μm).
   9. Asegure la fibra sin pelar a la mesa con cinta adhesiva y puntúe la fibra pelada, dejando 2 mm adicionales más allá de la coordenada ventral (para los implantes LA, la longitud final de la fibra es ~ 10 mm). Use un hemostático para tirar de la virola y romper uniformemente la fibra donde se ha marcado. Tenga cuidado de no cortar la fibra por completo al puntuar, o de lo contrario el núcleo de la fibra se dañará.
2. Construya cables de conexión que sean compatibles con implantes de fibra óptica. Se compraron cables de conexión diseñados a medida (consulte la Tabla de materiales). Alternativamente, los cables de conexión se pueden construir siguiendo los protocolos⁹ publicados anteriormente.
   NOTA: El diámetro y la NA de la fibra de virola y la fibra del cable de conexión deben coincidir en la unión de acoplamiento para evitar la pérdida excesiva de luz, lo que puede resultar en una falla para estimular suficientemente la actividad neuronal.
3. Mida la salida de luz a través del cable de conexión y los implantes de fibra óptica conectando el cable de conexión/fibra óptica a una fuente de luz láser adecuada (473 nm, salida de 1 mW) y midiendo la salida con un sensor de luz. Una fibra construida con éxito emitirá un círculo concéntrico de luz y no tendrá más del 30% de pérdida de luz.

2. Cateterismo intravenoso de roedores, administración de virus e implantación de fibra óptica

1. Preparar al animal para la cirugía.
   1. Anestesiar completamente a las ratas con anestesia de elección basada en pautas institucionales. Una opción es clorhidrato de ketamina (87,5-100 mg/kg, m.i.) y clorhidrato de xilazina (5 mg/kg, m.i.). Asegúrese de que la rata esté completamente anestesiada comprobando la falta de un reflejo de pellizco del dedo del pie.
      PRECAUCIÓN: La ketamina es una sustancia controlada que debe manejarse de acuerdo con las pautas institucionales.
      NOTA: La inyección intramuscular de anestésicos se utiliza en este estudio, ya que produjo una inducción de anestesia más rápida y confiable que la inyección intraperitoneal. Controle continuamente la respiración y la capacidad de respuesta de la rata y proporcione soporte térmico durante toda la cirugía.
   2. Afeite un área grande de la espalda de la rata (parte superior de la espalda desde justo por encima de los omóplatos hasta la mitad de la espalda), así como el área del cuello debajo de la extremidad anterior derecha y el cuero cabelludo.
   3. Coloque la rata en el área quirúrgica y aplique puralube (lágrimas artificiales) en los ojos. Inyecte un volumen de peso corporal de carprofeno (analgésico) por vía subcutánea (s.c.) a través de la piel de la parte superior de la espalda, luego inyecte 5 ml de solución de Ringer lactato s.c. a través de la piel de la espalda baja.
   4. Desinfecte todos los sitios quirúrgicos humedeciendo un trozo de gasa estéril con betadine y limpiándolo en el área quirúrgica afeitada con un movimiento circular. Luego repita el proceso con etanol al 70%. Repita este ciclo alterno tres veces.
2. Realizar la implantación de catéter intravenoso de acuerdo con protocolos previamente publicados ^4,10.
   NOTA: No se utiliza un paño quirúrgico durante esta cirugía para evitar la irritación durante la implantación del catéter. Esterilice todos los instrumentos y equipos antes de usarlos. Use guantes estériles y cámbielos si entra en contacto alguna superficie no estéril.
3. Inmediatamente después de los implantes del catéter, asegure a la rata en un marco estereotáxico para realizar inyecciones de AAV.
   1. Administrar una inyección subcutánea (s.c) de lidocaína al 2% (0.2-0.3 ml) en el cuero cabelludo como anestésico local.
      NOTA: No se utiliza anestesia local durante la implantación del catéter intravenoso para evitar alteraciones en los resultados quirúrgicos.
   2. Conecte una cánula de inyección de acero inoxidable calibre 26 a una jeringa Hamilton llena de 1 μL de solución AAV concentrada: AAV5-hSyn-tdTomato o AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      NOTA: oChIEF es una variante de la opsina canalrodopsina sensible a la luz azul (ChR2), que puede responder a una amplia gama de frecuencias ^8,11, y por lo tanto tiene utilidad para los experimentos LTD de baja frecuencia discutidos en este protocolo, pero también para experimentos LTP de alta frecuencia (no discutidos aquí). La construcción oChIEF fue donada por el Dr. Roger Tsien y procesada para su envasado y purificación por el Duke Viral Vector Core. Se necesitan al menos 3-4 semanas entre el día de la inyección y el día de la inducción de LTD para permitir una expresión óptima del virus en los terminales del axón MGN.
      PRECAUCIÓN: En general, el AAV se considera un organismo de nivel de bioseguridad 1 (BSL-1), con bajo riesgo de autoinfección a menos que se use un virus auxiliar en su producción. Su uso requiere la aprobación de IACUC y se debe usar el EPP adecuado en todo momento de acuerdo con las pautas institucionales para limitar la exposición innecesaria.
   3. Usando un bisturí, haga una incisión de 0,5 mm desde la parte frontal hacia la parte posterior del cráneo y retire el tejido suprayacente para exponer la superficie del cráneo.
   4. Nivelar la cabeza de la rata en el eje anterior/posterior y cero coordenadas estereotáxicas a bregma.
   5. Perfore tres pequeños agujeros a través del cráneo con una herramienta Dremel equipada con una pequeña broca. Use un destornillador para montar firmemente los tornillos de acero inoxidable (M2x4 965-A2) en su lugar.
      NOTA: Los tornillos son necesarios para la unión adecuada del cemento dental y la creación de tapas de cabeza resistentes y duraderas. La posición de los tornillos debe extenderse a través del eje anterior-posterior del cráneo y lejos del sitio de inyección de AAV.
   6. Perforar agujeros bilaterales para inyección de AAV basados en las coordenadas del Atlas Cerebral de Rata (Watson y Paxinos)¹² para la porción medial del núcleo geniculado medial (MGN); en mm de bregma, AP: -5.4; ML: ±3,0; DV: -6.6. Baje lentamente las cánulas de inyección (4 mm/min) hasta colocarlas en el MGN. Inyecte la solución concentrada de AAV a una velocidad de 0,1 μL/min.
   7. Deje la cánula de inyección en su lugar durante 5 minutos después de que se completen las infusiones para permitir la difusión lejos de la cánula y luego retire lentamente la cánula del cerebro.
4. Inmediatamente después de las inyecciones de virus, continúe implantando fibras ópticas ^4,9 dirigidas a terminales MGN-LA.
   1. Utilice una herramienta Dremel para perforar agujeros bilaterales para implantes de fibra óptica dirigidos a la amígdala lateral (en mm de bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. Use fórceps para agarrar la virola del implante de fibra óptica y fijarla a los adaptadores estereotáxicos para que se mantengan firmemente en su lugar.
   3. Baje lentamente las fibras a una velocidad de 2 mm/min, hasta que la punta de la fibra se asiente en la porción dorsal del LA (DV: -7.9 mm).
   4. Asegure las virolas al cráneo primero con una capa delgada de adhesivo instantáneo Loctite seguido de cemento dental y virolas de cubierta con fundas de virola de 1,25 mm de diámetro y cubiertas antipolvo.
      NOTA: La elección del adhesivo para asegurar las virolas al cráneo debe ser aprobada por el comité local o institucional de cuidado y uso de animales. Loctite se utiliza para este estudio para asegurar de manera confiable las virolas al cráneo después de prueba y error con múltiples adhesivos; sin embargo, se pueden considerar las alternativas disponibles.
5. Después de los procedimientos quirúrgicos, aloje ratas individualmente y proporcione acceso gratuito a alimentos y agua. Proporcionar atención postoperatoria consistente con las pautas institucionales. Enjuague los catéteres diariamente con solución salina que contenga gentamicina (5 mg/ml) y heparina (30 USP/ml) para mantener la permeabilidad. Al menos 5 días después de la cirugía y 24 h antes del inicio de los experimentos conductuales, los alimentos restringen a las ratas a ~ 90% de su peso de alimentación libre.

3. Autoadministración de cocaína de roedores y extinción de palanca instrumental

NOTA: Todos los procedimientos conductuales se llevan a cabo en cámaras de acondicionamiento operante estándar, equipadas con dos palancas retráctiles en una pared, una luz de estímulo sobre cada palanca, un generador de tonos, una luz de la casa y una bomba de infusión.

1. Someter a las ratas a sesiones diarias de entrenamiento de autoadministración de 1 hora de cocaína (2 mg / ml) bajo un programa de refuerzo FR1.
   1. Coloque a las ratas en la cámara operante todos los días y permita que las ratas presionen la palanca. Una presión en la "palanca activa" designada (contrapesada a través de las palancas izquierda y derecha) da como resultado una infusión de cocaína (1,0 mg / kg / infusión) y una presentación de 10 s de una señal compuesta de luz y tono. Una pulsación en la "palanca inactiva" designada no tiene efectos programados.
   2. Continuar los experimentos de autoadministración durante al menos 10 días y hasta que las ratas ganen con éxito al menos 8 infusiones / día durante 3 días consecutivos. Si no se alcanzan los criterios de adquisición para el día 20, se excluye del estudio.
2. Después de que los criterios de adquisición se cumplan con éxito, someta a las ratas a sesiones de extinción instrumental de 1 h durante 6-10 días.
   1. Coloque a las ratas en cámaras operantes y permita que las ratas presionen libremente. Sin embargo, las respuestas tanto en las palancas activas como en las inactivas no tienen consecuencias programadas.
   2. Haga que las ratas continúen la extinción instrumental diariamente hasta que ocurra un promedio de < 25 prensas de palanca durante dos días consecutivos.

4. Inducción optogenética in vivo de LTD

NOTA: Los experimentos de inhibición optogenética tienen lugar 24 h después del último día de extinción instrumental.

1. Conecte los cables de conexión a un diodo láser azul de 473 nm a través de una junta giratoria suspendida sobre una jaula de alojamiento de roedores limpia y estándar con la cubierta retirada. Esta configuración permite que los roedores se muevan libremente alrededor de la jaula durante la estimulación optogenética.
2. Encienda el diodo láser de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento y conéctelo a un generador de impulsos. Ajuste la configuración, de modo que cuando se encienda, la rata reciba 900 pulsos de luz de 2 ms a 1 Hz.
   PRECAUCIÓN: Se debe usar protección ocular adecuada en todo momento mientras se opera el láser.
3. Mida la intensidad de la luz a través del cable de conexión con un sensor de luz. Ajuste la intensidad del láser para que la salida de luz a través del cable de conexión sea ~ 5-7 mW.
4. Coloque a las ratas en una jaula de alojamiento limpia. Retire las cubiertas antipolvo y las mangas de virola, exponiendo las virolas. Conecte los cables de conexión bilateralmente a los implantes de fibra óptica. Permita que las ratas exploren el medio ambiente durante 3 minutos antes de la inducción de LTD.
5. Encienda el generador de pulsos para iniciar la estimulación optogenética.
   NOTA: Aunque es poco probable, si la rata experimenta alguna reacción adversa a la estimulación, el experimento se termina inmediatamente y las ratas son sacrificadas adecuadamente según las pautas institucionales.
6. Después de la inducción de LTD, mantenga a las ratas en la jaula durante 3 minutos y luego vuelva a colocarlas en sus jaulas domésticas.
7. Para experimentos de control, use el mismo procedimiento de estimulación en ratas que expresan el virus de control AAV5-tdTomato. Para experimentos simulados, conecte un cable de conexión a la fibra óptica de las ratas que expresan el virus AAV5-oChIEF, pero no se administra estimulación durante una sesión de 15 minutos.

5. Probar el efecto de la estimulación optogenética en la búsqueda de cocaína inducida por señales

1. 24 h después de las estimulaciones optogenéticas in vivo, coloque a las ratas de nuevo en cámaras de condicionamiento operantes. Las ratas son sometidas a una sesión de reincorporación inducida por señales estándar de 1 hora para evaluar el comportamiento de búsqueda de cocaína.
   NOTA: Durante el restablecimiento inducido por la señal, una respuesta en la palanca activa produce una presentación de 10-s de la señal asociada a la cocaína, pero no infusiones de cocaína.
2. Realizar una segunda prueba de restablecimiento al menos 1 semana después de la primera prueba para determinar si la inducción optogenética de LTD resulta en una supresión a largo plazo de la búsqueda de cocaína

6. Tinción, fluorescencia e imágenes para la verificación histológica de la expresión viral y la colocación de la fibra óptica

1. Hacer 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y paraformaldehído al 4% (PFA). Almacene ambas soluciones en hielo. El volumen total dependerá del número de ratas en el estudio (~ 100 ml de PBS y 200 ml de PFA se utilizarán por rata).
   PRECAUCIÓN: El PFA es un químico tóxico y carcinógeno conocido. Tenga el cuidado adecuado para evitar la inhalación, así como el contacto con la piel. Su uso y eliminación deben estar de acuerdo con las directrices institucionales, incluido el uso de EPP adecuado y una campana de flujo químico.
2. Instale la bomba peristáltica a un caudal de 20 mL/min. Llene la tubería de la bomba con 1x PBS. Coloque una aguja roma de calibre 20 en el extremo del tubo.
3. Anestesiar profundamente a las ratas con pentobarbital sódico (100 mg/kg, i.p.). Confirme la profundidad de la anestesia por falta de respuesta al pellizco del dedo del pie antes de continuar.
   NOTA: El pentobarbital sódico se utiliza ya que la perfusión es un procedimiento terminal.
4. Use tijeras quirúrgicas para abrir la cavidad abdominal de la rata debajo del diafragma. Corte a través de la caja torácica rostralmente a lo largo de los bordes laterales para exponer el corazón de la rata. Use hemostático para sujetar la porción rostral de la caja torácica lejos del corazón. Cortar cualquier tejido graso suprayacente que rodea el corazón.
5. Inserte la aguja embotada a través del ventrículo izquierdo y hasta la aorta. Corte un pequeño orificio en la aurícula derecha para drenar la solución a medida que regresa al corazón.
6. Perfundir cada rata con 1x PBS durante 5 min seguido de 4% PFA, pH 7.4 durante 10 min.
7. Decapitar a la rata, extraer el cerebro y posfijarlo en PFA al 4% durante 24 h. Luego transfiera el cerebro a una solución de sacarosa al 30% durante 2-3 días.
8. Sección de cerebros a 50 μm usando un criostato.
9. Monte todas las rodajas que contengan LA o MGN en portaobjetos de vidrio y cubreobjetos.
10. Cortes de imágenes utilizando un microscopio epifluorescente para verificar la expresión de AAV-oChIEF-tdTomato en el MGN y sus proyecciones al LA, así como la colocación de la fibra óptica por encima del LA.

7. Perfusión y preparación de corte cerebral agudo para experimentos de electrofisiología

NOTA: Los experimentos electrofisiológicos se realizan en un subconjunto de animales para validar el éxito de in vivo LTD.

1. Preparar soluciones electrofisiológicas utilizando los reactivos enumerados en las Tablas 1-3 ^4,13. Ajustar el pH de todas las soluciones a 7,4 con HCl y ajustar la osmolaridad a 300-310 mOsm/kg_H2O. Preparar las soluciones frescas antes de los experimentos y almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana. Sature todas las soluciones con carbógeno (95% O 2/5% CO₂) en todo momento durante el uso.
2. Usando isoflurano de acuerdo con las pautas locales o institucionales de cuidado y uso de animales, anestesiar profundamente a la rata en una cámara de eutanasia cerrada.  Confirme que el animal está completamente anestesiado a través del reflejo de pellizco del dedo del pie.
3. Llene un vaso de precipitados pequeño con 50 ml de solución de corte helada. Llene el tubo de la bomba peristáltica con solución y ajuste el caudal a 20 ml / min. Coloque una aguja roma de calibre 20 en el extremo del tubo.
4. Abrir la cavidad abdominal (ver pasos 6.4 y 6.5) y perfundir brevemente la rata con solución cortante (máximo 1-2 min).
5. Después de la perfusión, decapitar inmediatamente a la rata. Extraer el cerebro y colocarlo en un vaso de precipitados pequeño lleno de solución de corte a 4 °C durante 30 s-1 min.
6. Transfiera cerebros con una espátula y fíjelos rápidamente a la cámara de un vibratomo. Retire la pia con pinzas finas. Llenar la cámara con una solución de corte a 4 °C y preparar cortes coronales agudos (250 μm de espesor) de la amígdala a una velocidad de 0,37 mm/seg y una frecuencia de 70 Hz.
7. A medida que se obtienen las rodajas, colocar cada una en una cámara de retención llena de solución de corte e incubar a 37 °C durante 10-12 min. Se pueden obtener alrededor de 5-7 rebanadas que contienen el LA por animal.
8. Transfiera las rodajas a un vaso de precipitados de solución de retención a temperatura ambiente (RT) y deje que se recuperen durante >30 minutos antes de la experimentación.
   NOTA: Las rodajas generalmente permanecen saludables mientras se mantienen en solución de retención durante 4-6 h. Debido a la naturaleza fluorescente del AAV, las rebanadas se mantienen en condiciones de poca luz.

8. Registros electrofisiológicos ex vivo

1. Preparar soluciones intracelulares utilizando los reactivos enumerados en las Tablas 4-5.
   NOTA: Las soluciones intracelulares deben prepararse antes de los experimentos y pueden almacenarse a largo plazo (3-12 meses) a -80 °C o a corto plazo (1-2 meses) a -20 °C. Las soluciones tienen un pH ajustado a 7,3 (con CsOH para la solución intracelular basada en Cs y con KOH para la solución intracelular basada en K). Ajustar a una osmolaridad final de 290-300 mOsm/kg_H2O.
2. Preparar una solución madre de picrotoxina de 500 mM disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO).
   NOTA: Las cepas de piperotoxinas se alícotizan y almacenan a -20 °C. El día de su utilización, las alícuotas se descongelan y se añaden a la solución de registro hasta una concentración final de 100 μM.
   PRECAUCIÓN: La piperotoxina es un antagonista no competitivo de los receptores_{GABA A} , por lo que la infusión de picrotoxina tiene un efecto estimulante. Es severamente tóxico por ingestión oral o absorción de la piel. Se debe usar el EPP adecuado en todo momento cuando se trabaja con picrotoxina.
3. Transfiera los cortes a un microscopio vertical diseñado para experimentos de electrofisiología.
4. Durante los experimentos, el baño perfunde continuamente las rodajas con una solución de grabación que se calienta a 31-33 °C.
5. Magnifica el LA usando un objetivo 4x. Identifique las neuronas principales por morfología con una lente de inmersión en agua 40x.
6. Utilice una pipeta de vidrio (3-5 MΩ) llena con una solución intracelular basada en Cs (para experimentos de pinza de voltaje) o una solución intracelular basada en K (para experimentos de pinza de corriente) para obtener registros de pinza de parche de células enteras.
7. Identificar proyecciones axonales de MGN infectadas con AAV bajo fluorescencia (utilizando un filtro RFP). Estimule las proyecciones utilizando un láser DPSS de luz azul (473 nm) conectado a un generador de pulsos.
   PRECAUCIÓN: Para limitar la exposición al láser, la luz láser colimada se acopla a un puerto fluorescente en el microscopio y se enfoca en el corte a través del objetivo.
   NOTA: En el modo de pinza de voltaje, las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC) se evocan ópticamente a 0.1 Hz. Las neuronas que reciben entradas de neuronas MGN infectadas con AAV exhibirán EPSC confiables.
8. Para inducir LTD ex vivo , en modo de pinza actual, registre una línea de base estable de potenciales postsinápticos excitatorios (EPSP) durante al menos 10 min. A continuación, proporcione 900 pulsos de 2 ms de luz de 473 nm a una frecuencia de 1 Hz (tiempo total = 15 min). A continuación, grabe continuamente EPSP a 0,1 Hz durante ≥60 min.

Resultados

En la Figura 1 se muestra una línea de tiempo que describe el orden de los experimentos. A lo largo de los experimentos conductuales, el número de infusiones de cocaína, así como el número de respuestas realizadas en la palanca activa sirve como una medida de la intensidad del comportamiento de búsqueda de cocaína. Durante los primeros días de autoadministración de cocaína, el número de respuestas activas debe aumentar gradualmente a lo largo de cada día de adquisición, antes de...

Discusión

Como se describió anteriormente, hay varios pasos críticos que son importantes para lograr los resultados experimentales adecuados. Es probable que el protocolo solo sea efectivo en animales que adquieran adecuadamente la autoadministración de cocaína, y hasta la fecha, solo se ha probado utilizando los parámetros descritos anteriormente. Es posible que la dosis de cocaína, el programa de refuerzo y los parámetros de señal puedan modificarse con probablemente poco efecto sobre los resultados conductuales, con la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP Magnesium Salt	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calcium chloride	Fisher Scientific	C1016
Cesium chloride	Fisher Scientific	289329
Cesium hydroxide	Fisher Scientific	516988
Cesium methanesulfonate	Fisher Scientific	C1426
Cocaine HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemistry Stockroom	200C5000
Ferrule Dust Caps	Thor Labs	CAPL	White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic	Thor Labs	FP200URT	200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint	Prizmatix	(Ordered from Amazon)	18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodium Salt	Fisher Scientific	G8877
Hamilton syringe	Hamilton	80085	10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
Ketamine HCl	Henry Schein	55853	Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s	Henry Schein	9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione	Fisher Scientific	G4251
Lidocaine	Butler Schein	14583
Light Sensor	Thor Labs	PM100D	Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive	Grainger	5E207
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump	Harvard Apparatus	70-4501	Dual syringe
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microscope for electrophysiology
Microscope	Olympus	BX61VS	Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet dental cement, liquid	Lang Dental	1504BLK	black
Orthojet dental cement, powder	Lang Dental	1530BLK	Contemporary powder, black
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch Cables	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polishing Disc	Thor Labs	D50FC
Polishing Pad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polishing Paper	Thor Labs	LFG5P	5 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG3P	3 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG1P	1 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm grit
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	P5958
Potassium methanesulfonate	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1064980500
Sodium L-Ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Sodium Pentobarbital	Henry Schein	24352
Sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphocreatine	Fisher Scientific	P7936
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Stainless steel machine screws	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Tissue Adhesive	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198