Verwendung von Optogenetik zur Umkehrung der Neuroplastizität und zur Hemmung der Kokainsuche bei Ratten

Zusammenfassung

Die hier beschriebenen Methoden skizzieren ein Verfahren, mit dem die Kokain-induzierte Plastizität in einem verhaltensrelevanten Schaltkreis bei Ratten optogenetisch umgekehrt wird. Eine anhaltende niederfrequente optische Stimulation der Thalamo-Amygdala-Synapsen induziert eine langfristige Depression (LTD). In vivo führte eine optogenetisch induzierte LTD bei Kokain-erfahrenen Ratten zu einer anschließenden Abschwächung der Cue-motivierten Drogensuche.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt die Schritte, die erforderlich sind, um optogenetische Werkzeuge zu verwenden, um die Kokain-induzierte Plastizität an Thalamo-Amygdala-Schaltkreisen umzukehren, um das nachfolgende Kokainsuchverhalten bei der Ratte zu reduzieren. In unserer Forschung hatten wir herausgefunden, dass, wenn Ratten intravenöses Kokain gepaart mit einem audiovisuellen Hinweis selbst verabreichen, Synapsen, die an Eingängen aus dem medialen genikulären Kern des Thalamus (MGN) auf die Hauptneuronen der lateralen Amygdala (LA) gebildet werden, stärker werden, wenn die Cue-Kokain-Assoziation erlernt wird. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Umkehrung der Kokain-induzierten Plastizität an diesen Synapsen das Kokain-motivierte Kokain-Suchverhalten reduzieren würde. Um diese Art der Neuromodulation in vivo zu erreichen, wollten wir eine synaptische Langzeitdepression (LTD) induzieren, die die Stärke der MGN-LA-Synapsen verringert. Zu diesem Zweck haben wir die Optogenetik verwendet, die die Neuromodulation von Gehirnschaltkreisen mit Hilfe von Licht ermöglicht. Das exzitatorische Opsin oChiEF wurde an präsynaptischen MGN-Terminals in der LA exprimiert, indem ein AAV, das oChiEF enthält, in das MGN infundiert wurde. Optische Fasern wurden dann in die LA implantiert und 473 nm Laserlicht wurde 15 Minuten lang mit einer Frequenz von 1 Hz gepulst, um LTD zu induzieren und die Kokain-induzierte Plastizität umzukehren. Diese Manipulation führt zu einer lang anhaltenden Verringerung der Fähigkeit von Reizen, die mit Kokain in Verbindung gebracht werden, Drogensuchaktionen zu induzieren.

Einleitung

Drogenmissbrauch ist ein sehr ernstes Problem der öffentlichen Gesundheit in den USA und weltweit. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung gibt es nur sehr wenige wirksame Therapieoptionen ^1,2. Ein großer Rückschlag für die Behandlung ist die Tatsache, dass chronischer Drogenkonsum langfristige assoziative Erinnerungen zwischen Umweltreizen und der Droge selbst erzeugt. Die erneute Exposition gegenüber drogenbezogenen Hinweisen führt zu physiologischen und Verhaltensreaktionen, die zu fortgesetztem Drogenkonsum und Rückfällen motivieren³. Eine neuartige therapeutische Strategie best....

Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente entsprachen den Richtlinien des National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigt. Alle Verfahren wurden mit erwachsenen, naiven Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt, die bei der Ankunft 275-325 g wogen.

1. Konstruktion von Lichtwellenleiterimplantaten und Patchkabeln

1. Bereiten Sie Glasfaserimplantate nach zuvor veröffentlichten Protokollen^{vor 9}. Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente verwendeten ....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine Zeitleiste mit der Reihenfolge der Experimente. In Verhaltensexperimenten dient die Anzahl der Kokaininfusionen sowie die Anzahl der Reaktionen auf den aktiven Hebel als Maß für die Intensität des Kokainsuchverhaltens. In den ersten Tagen der Selbstverabreichung von Kokain sollte die Anzahl der aktiven Reaktionen an jedem Erwerbstag allmählich zunehmen, bevor sie sich in der zweiten Woche stabilisiert. Umgekehrt sollten die inaktiven Hebelreaktionen während des ge.......

Diskussion

Wie oben beschrieben, gibt es mehrere kritische Schritte, die wichtig sind, um die richtigen experimentellen Ergebnisse zu erzielen. Das Protokoll wird wahrscheinlich nur bei Tieren wirksam sein, die eine ordnungsgemäße Selbstverabreichung von Kokain erhalten, und bisher wurde es nur mit den oben genannten Parametern getestet. Es ist möglich, dass die Kokaindosis, das Verstärkungsschema und die Cue-Parameter mit wahrscheinlich geringen Auswirkungen auf die Verhaltensergebnisse modifiziert werden können, mit der Ausn.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP Magnesium Salt	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calcium chloride	Fisher Scientific	C1016
Cesium chloride	Fisher Scientific	289329
Cesium hydroxide	Fisher Scientific	516988
Cesium methanesulfonate	Fisher Scientific	C1426
Cocaine HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemistry Stockroom	200C5000
Ferrule Dust Caps	Thor Labs	CAPL	White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic	Thor Labs	FP200URT	200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint	Prizmatix	(Ordered from Amazon)	18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodium Salt	Fisher Scientific	G8877
Hamilton syringe	Hamilton	80085	10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
Ketamine HCl	Henry Schein	55853	Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s	Henry Schein	9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione	Fisher Scientific	G4251
Lidocaine	Butler Schein	14583
Light Sensor	Thor Labs	PM100D	Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive	Grainger	5E207
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump	Harvard Apparatus	70-4501	Dual syringe
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microscope for electrophysiology
Microscope	Olympus	BX61VS	Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet dental cement, liquid	Lang Dental	1504BLK	black
Orthojet dental cement, powder	Lang Dental	1530BLK	Contemporary powder, black
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch Cables	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polishing Disc	Thor Labs	D50FC
Polishing Pad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polishing Paper	Thor Labs	LFG5P	5 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG3P	3 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG1P	1 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm grit
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	P5958
Potassium methanesulfonate	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1064980500
Sodium L-Ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Sodium Pentobarbital	Henry Schein	24352
Sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphocreatine	Fisher Scientific	P7936
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Stainless steel machine screws	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Tissue Adhesive	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198