Usare l'optogenetica per invertire la neuroplasticità e inibire la ricerca di cocaina nei ratti

Riepilogo

I metodi qui descritti delineano una procedura utilizzata per invertire optogeneticamente la plasticità indotta dalla cocaina in un circuito comportamentale rilevante nei ratti. La stimolazione ottica sostenuta a bassa frequenza delle sinapsi talamo-amigdala induce depressione a lungo termine (LTD). La LTD indotta optogeneticamente in vivo in ratti con esperienza di cocaina ha determinato la successiva attenuazione della ricerca di droga motivata da spunti.

Abstract

Questo protocollo dimostra i passaggi necessari per utilizzare strumenti optogenetici per invertire la plasticità indotta dalla cocaina nei circuiti talamo-amigdala per ridurre i successivi comportamenti di ricerca della cocaina nel ratto. Nella nostra ricerca, abbiamo scoperto che quando i ratti si auto-somministrano cocaina per via endovenosa accoppiata con un segnale audiovisivo, le sinapsi si formano agli input dal nucleo genicolato mediale del talamo (MGN) sui principali neuroni dell'amigdala laterale (LA) diventano più forti man mano che viene appresa l'associazione cue-cocaina. Abbiamo ipotizzato che l'inversione della plasticità indotta dalla cocaina in queste sinapsi ridurrebbe il comportamento di ricerca della cocaina motivato dal segnale. Per realizzare questo tipo di neuromodulazione in vivo, abbiamo voluto indurre la depressione sinaptica a lungo termine (LTD), che diminuisce la forza delle sinapsi MGN-LA. A tal fine, abbiamo usato l'optogenetica, che consente la neuromodulazione dei circuiti cerebrali usando la luce. L'opsina eccitatoria oChiEF è stata espressa sui terminali presinaptici MGN nel LA infondendo un AAV contenente oChiEF nel MGN. Le fibre ottiche sono state quindi impiantate nel LA e la luce laser a 473 nm è stata pulsata ad una frequenza di 1 Hz per 15 minuti per indurre LTD e invertire la plasticità indotta dalla cocaina. Questa manipolazione produce una riduzione duratura della capacità dei segnali associati alla cocaina di indurre azioni di ricerca di droga.

Introduzione

L'abuso di sostanze è un problema di salute pubblica molto serio negli Stati Uniti e in tutto il mondo. Nonostante decenni di intensa ricerca, ci sono pochissime opzioni terapeutiche efficaci ^1,2. Una grave battuta d'arresto per il trattamento è il fatto che l'uso cronico di droghe genera memorie associative a lungo termine tra i segnali ambientali e il farmaco stesso. La riesposizione a segnali correlati alla droga guida risposte fisiologiche e comportamentali che motivano il consumo continuato di droghe e la ricaduta³. Una nuova strategia terapeutica è quella di mettere in atto trattamenti basati sulla memoria che mirano a manipolare i circuiti coinvolti nella regolazione delle associazioni farmaco-segnale. Recentemente, è stato osservato che le sinapsi nell'amigdala laterale (LA), in particolare quelle derivanti dal nucleo genicolato mediale (MGN) del talamo, sono rafforzate da ripetute auto-somministrazioni di cocaina associate a cue, e che questo potenziamento può supportare il comportamento di ricerca della cocaina ^4,5. Pertanto, è stato proposto che il reintegro indotto dal cue potrebbe essere attenuato invertendo la plasticità nelle sinapsi MGN-LA.

La capacità di indirizzare con precisione la plasticità sinaptica di uno specifico circuito cerebrale è stata una grande sfida per il campo. Gli strumenti farmacologici tradizionali hanno avuto un certo successo nel ridurre i comportamenti di ricaduta, ma sono limitati dall'incapacità di manipolare le singole sinapsi. Tuttavia, il recente sviluppo dell'optogenetica in vivo ha fornito gli strumenti necessari per superare queste limitazioni e controllare i percorsi neurali con precisione temporale e spaziale 6,7,8. Esprimendo opsine sensibili alla luce in uno specifico circuito cerebrale, la luce laser può quindi essere utilizzata per attivare o inibire il circuito. La stimolazione ottica dipendente dalla frequenza può essere utilizzata per manipolare specificamente la plasticità sinaptica del circuito in un animale che si comporta.

Questo manoscritto delinea la procedura adottata per manipolare il circuito MGN-LA rilevante dal punto di vista comportamentale utilizzando l'optogenetica in vivo . In primo luogo, l'opsina eccitatoria oChIEF è stata espressa nel MGN e le fibre ottiche sono state impiantate bilateralmente nel LA. Gli animali sono stati quindi addestrati ad auto-somministrarsi cocaina in modo dipendente dal segnale, che potenzia il percorso MGN-LA. Successivamente, la stimolazione sostenuta a bassa frequenza con luce laser a 473 nm è stata utilizzata per produrre LTD specifico del circuito. L'inversione della plasticità indotta dall'uso di cocaina ha generato una riduzione duratura della capacità dei segnali di innescare azioni associate al comportamento di ricerca di droghe.

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Protocollo

Gli esperimenti descritti in questo protocollo erano coerenti con le linee guida stabilite dalla National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Pittsburgh. Tutte le procedure sono state eseguite utilizzando ratti Sprague-Dawley adulti e ingenui che pesavano 275-325 g all'arrivo.

1. Costruzione di impianti in fibra ottica e cavi patch

1. Preparare impianti di fibre ottiche seguendo protocolli precedentemente pubblicati⁹. Gli esperimenti descritti in questo protocollo hanno utilizzato una fibra centrale da 200 μm (0,5 NA) e una ghiera ceramica multimodale LC/PC Ø1,25 mm, dimensione del foro Ø230 μm.
   1. Usate uno strumento Dremel per segnare il terzo inferiore di una ghiera (più vicina all'estremità piatta della ghiera). Segnare le ghiere li aiuta a rimanere attaccati al cemento dentale, aumentando la probabilità che rimangano sicuri durante l'intera portata della sperimentazione.
   2. Utilizzare tronchesi per tagliare ~ 35 mm di fibra. Utilizzare lo strumento di rimozione delle fibre per rimuovere ~ 25 mm di fibra, lasciando 10 mm non esposti.
   3. Preparare la resina epossidica termopolimerizzabile secondo le istruzioni del produttore. Sciogliere 1 g di resina in polvere in 100 mg di composto indurente. Collegare un ago smussato da 25 gauge a una siringa da 1 ml. Riempire la siringa con resina epossidica e attaccare una punta dell'ago smussata calibro 25.
   4. Utilizzare una morsa o un morsetto per tenere saldamente la ghiera con il lato piatto rivolto verso l'alto e il lato convesso rivolto verso il basso. Con la siringa riempita di resina epossidica, aggiungere una goccia di resina epossidica sul lato piatto della ghiera, usando cautela per rimuovere la resina epossidica in eccesso dai lati della ghiera.
   5. Inserire la porzione di fibra spogliata attraverso la ghiera consentendo un extra di 5 mm di fibra spogliata esposta. Nel caso di impianti LA, la fibra verrà impiantata ventrale di 7,9 mm al bregma, quindi la lunghezza esposta della fibra non spogliata dovrebbe essere ~ 13 mm.
   6. Polimerizzare la resina epossidica con una pistola termica per circa 30-40 s fino a quando non diventa di colore nero / ambra.
   7. Segna la fibra direttamente all'interfaccia dell'estremità convessa della ghiera con coltello diamantato e usa un dito per toccare delicatamente la fibra.
   8. Lucidare l'estremità convessa della ghiera tenendo con un emostato, assicurandosi di applicare una pressione uniforme e facendo 20 rotazioni circolari ciascuna su una serie di carta lucidante (da alta a bassa qualità; 5, 3, 1, 0,3 μm).
   9. Fissare la fibra non spogliata al tavolo utilizzando nastro adesivo e fibra strippata, lasciando 2 mm in più oltre la coordinata ventrale (per gli impianti LA, la lunghezza finale della fibra è ~ 10 mm). Usa un emostatico per tirare la ghiera e rompere uniformemente la fibra dove è stata segnata. Fare attenzione a non tagliare completamente la fibra durante il punteggio, altrimenti il nucleo della fibra sarà danneggiato.
2. Costruisci cavi patch compatibili con gli impianti in fibra ottica. Sono stati acquistati cavi patch progettati su misura (vedi tabella dei materiali). In alternativa, i cavi patch possono essere costruiti^{seguendo i protocolli} 9 precedentemente pubblicati.
   NOTA: il diametro e il NA della fibra di ghiera e della fibra del cavo patch devono corrispondere alla giunzione di accoppiamento per evitare un'eccessiva perdita di luce, che può comportare un fallimento nello stimolare sufficientemente l'attività neurale.
3. Misurare l'emissione luminosa attraverso il cavo patch e gli impianti in fibra ottica collegando il cavo patch/fibra ottica a una sorgente di luce laser appropriata (473 nm, uscita 1 mW) e misurando l'uscita con un sensore di luce. Una fibra costruita con successo emetterà un cerchio concentrico di luce e non avrà più del 30% di perdita di luce.

2. Cateterismo endovenoso dei roditori, consegna del virus e impianto di fibre ottiche

1. Preparare l'animale per l'intervento chirurgico.
   1. Anestetizzare completamente i ratti con anestetico di scelta basato su linee guida istituzionali. Un'opzione è la ketamina cloridrato (87,5-100 mg/kg, i.m.) e la xilazina cloridrato (5 mg/kg, i.m.). Assicurarsi che il ratto sia completamente anestetizzato controllando la mancanza di un riflesso del pizzico della punta.
      ATTENZIONE: La ketamina è una sostanza controllata che deve essere maneggiata secondo le linee guida istituzionali.
      NOTA: L'iniezione intramuscolare di anestetici viene utilizzata in questo studio in quanto ha prodotto un'induzione dell'anestesia più rapida e affidabile rispetto all'iniezione intraperitoneale. Monitorare continuamente la respirazione e la reattività del ratto e fornire supporto termico durante l'intervento chirurgico.
   2. Rasare una vasta area della schiena del ratto (parte superiore della schiena da appena sopra le scapole al centro della schiena) e l'area del collo sotto l'arto anteriore destro e il cuoio capelluto.
   3. Posizionare il ratto nell'area chirurgica e applicare puralube (lacrime artificiali) agli occhi. Iniettare un volume corporeo di carprofen (analgesico) per via sottocutanea (s.c.) attraverso la pelle della parte superiore della schiena, quindi iniettare 5 mL di soluzione di Ringer lattato s.c. attraverso la pelle della parte bassa della schiena.
   4. Disinfettare tutti i siti chirurgici bagnando un pezzo di garza sterile con betadine e asciugandolo lungo l'area chirurgica rasata con un movimento circolare. Quindi ripetere il processo con etanolo al 70%. Ripeti questo ciclo alternato tre volte.
2. Eseguire l'impianto di catetere endovenoso secondo i protocolli precedentemente pubblicati ^4,10.
   NOTA: Durante questo intervento chirurgico non viene utilizzato un drappo chirurgico per evitare irritazioni durante l'impianto del catetere. Sterilizzare tutti gli strumenti e le attrezzature prima dell'uso. Utilizzare guanti sterili e cambiare i guanti se viene contattata una superficie non sterile.
3. Immediatamente dopo l'impianto del catetere, fissare il ratto in un telaio stereotassico per eseguire iniezioni AAV.
   1. Somministrare un'iniezione sottocutanea (s.c) di lidocaina al 2% (0,2-0,3 ml) sul cuoio capelluto come anestetico locale.
      NOTA: L'anestetico locale non viene utilizzato durante l'impianto del catetere endovenoso per evitare alterazioni degli esiti chirurgici.
   2. Collegare una cannula di iniezione in acciaio inossidabile calibro 26 a una siringa Hamilton riempita con 1 μL di soluzione concentrata di AAV: AAV5-hSyn-tdPomodoro o AAV5-hSyn-oChIEF-tdPomodoro
      NOTA: oChIEF è una variante della canale opsina sensibile alla luce blurhodopsin (ChR2), che può rispondere ad una vasta gamma di frequenze ^8,11, e quindi ha utilità per gli esperimenti LTD a bassa frequenza discussi in questo protocollo, ma anche per esperimenti LTP ad alta frequenza (non discussi qui). Il costrutto oChIEF è stato donato dal Dr. Roger Tsien e lavorato per il confezionamento e la purificazione dal Duke Viral Vector Core. Sono necessarie almeno 3-4 settimane tra il giorno dell'iniezione e il giorno dell'induzione della LTD per consentire un'espressione ottimale del virus nei terminali assoni MGN.
      ATTENZIONE: Generalmente, AAV è considerato un organismo di livello 1 di biosicurezza (BSL-1), con basso rischio di autoinfezione a meno che non venga utilizzato un virus helper nella sua produzione. Il suo utilizzo richiede l'approvazione IACUC e DPI adeguati devono essere utilizzati in ogni momento in conformità con le linee guida istituzionali per limitare l'esposizione non necessaria.
   3. Usando un bisturi, fai un'incisione di 0,5 mm dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio e rimuovi il tessuto sovrastante per esporre la superficie del cranio.
   4. Livellare la testa del ratto nell'asse anteriore/posteriore e zero coordinate stereotassiche al bregma.
   5. Praticare tre piccoli fori attraverso il cranio usando uno strumento Dremel dotato di una piccola punta da trapano. Utilizzare un cacciavite per montare saldamente le viti in acciaio inossidabile (M2x4 965-A2) in posizione.
      NOTA: Le viti sono necessarie per il corretto legame del cemento dentale e la creazione di tappi robusti e duraturi. La posizione delle viti deve essere distribuita lungo l'asse antero-posteriore del cranio e lontano dal sito di iniezione AAV.
   6. Praticare fori bilaterali per l'iniezione di AAV in base alle coordinate del Rat Brain Atlas (Watson e Paxinos)¹² per la porzione mediale del nucleo genicolato mediale (MGN); in mm da bregma, AP: -5.4; ML: ±3.0; DV: -6.6. Abbassare lentamente le cannule di iniezione (4 mm/min) fino a posizionarle nel MGN. Iniettare una soluzione concentrata di AAV ad una velocità di 0,1 μL/min.
   7. Lasciare la cannula iniettabile in posizione per 5 minuti dopo che le infusioni sono state completate per consentire la diffusione lontano dalla cannula e quindi ritirare lentamente la cannula dal cervello.
4. Subito dopo le iniezioni di virus, continuare a impiantare fibre ottiche ^4,9 mirate ai terminali MGN-LA.
   1. Utilizzare uno strumento Dremel per praticare fori bilaterali per impianti in fibra ottica mirati all'amigdala laterale (in mm da bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. Utilizzare una pinza per afferrare la ghiera dell'impianto in fibra ottica e fissarla agli adattatori stereotassici in modo che siano tenuti saldamente in posizione.
   3. Abbassare lentamente le fibre ad una velocità di 2 mm / min, fino a quando la punta della fibra si trova nella porzione dorsale del LA (DV: -7,9 mm).
   4. Fissare le ghiere al cranio utilizzando prima un sottile strato di adesivo istantaneo Loctite, seguito da cemento dentale e ghiere di copertura con manicotti di ghiera di 1,25 mm di diametro e coperture antipolvere.
      NOTA: La scelta dell'adesivo per fissare le ghiere al cranio deve essere approvata dal comitato locale o istituzionale per la cura e l'uso degli animali. La loctite viene utilizzata per questo studio per fissare in modo affidabile le ghiere al cranio dopo tentativi ed errori con adesivi multipli; tuttavia, le alternative disponibili possono essere considerate.
5. A seguito di procedure chirurgiche, i ratti domestici individualmente e forniscono libero accesso a cibo e acqua. Fornire cure postoperatorie coerenti con le linee guida istituzionali. Cateteri di lavaggio ogni giorno con soluzione salina contenente gentamicina (5 mg / ml) ed eparina (30 USP / ml) per mantenere la pervietà. Almeno 5 giorni dopo l'intervento chirurgico e 24 ore prima dell'inizio degli esperimenti comportamentali, il cibo limita i ratti a ~ 90% del loro peso di alimentazione libera.

3. Autosomministrazione di cocaina nei roditori ed estinzione della leva strumentale

NOTA: Tutte le procedure comportamentali sono condotte in camere di condizionamento operanti standard, dotate di due leve retrattili su una parete, una luce di stimolo sopra ogni leva, un generatore di toni, una luce domestica e una pompa di infusione.

1. Sottoporre ratti a sessioni giornaliere di auto-somministrazione di cocaina (2 mg / ml) di 1 ora secondo un programma di rinforzo FR1.
   1. Metti i ratti in camera operante ogni giorno e consenti ai ratti di premere a leva. Una pressione sulla "leva attiva" designata (controbilanciata tra le leve sinistra e destra) provoca un'infusione di cocaina (1,0 mg/kg/infusione) e una presentazione di 10 s di un segnale luminoso e tonale composto. Una pressione sulla "leva inattiva" designata non ha effetti programmati.
   2. Continuare gli esperimenti di auto-somministrazione per almeno 10 giorni e fino a quando i ratti ottengono con successo almeno 8 infusioni / giorno in 3 giorni consecutivi. Il mancato raggiungimento dei criteri di acquisizione entro il giorno 20 comporta l'esclusione dallo studio.
2. Dopo che i criteri di acquisizione sono stati soddisfatti con successo, sottoporre i ratti a sessioni di estinzione strumentale di 1 ora per 6-10 d.
   1. Posizionare i ratti in camere operanti e consentire ai ratti di premere liberamente. Tuttavia, le risposte su entrambe le leve attive e inattive non hanno conseguenze programmate.
   2. Fai in modo che i ratti continuino l'estinzione strumentale ogni giorno fino a quando non si verifica una media di < 25 pressioni a leva per due giorni consecutivi.

4. Induzione optogenetica in vivo di LTD

NOTA: Gli esperimenti di inibizione optogenetica si svolgono 24 ore dopo l'ultimo giorno di estinzione strumentale.

1. Collegare i cavi patch a un diodo laser blu da 473 nm tramite un giunto rotante sospeso sopra una gabbia di alloggiamento per roditori standard e pulita con il coperchio rimosso. Questa configurazione consente ai roditori di muoversi liberamente intorno alla gabbia durante la stimolazione optogenetica.
2. Accendere il diodo laser secondo le istruzioni operative e collegarlo a un generatore di impulsi. Regola le impostazioni, in modo che quando acceso il ratto riceverà 900 impulsi di luce da 2 ms a 1 Hz.
   ATTENZIONE: È necessario utilizzare sempre un'adeguata protezione per gli occhi durante l'utilizzo del laser.
3. Misurare l'intensità della luce attraverso il cavo patch utilizzando un sensore di luce. Regolare l'intensità del laser in modo che l'emissione luminosa attraverso il cavo patch sia ~5-7 mW.
4. Metti i ratti in una gabbia pulita. Rimuovere i coperchi antipolvere e i manicotti di ghiera, esponendo le ghiere. Collegare bilateralmente i cavi patch agli impianti in fibra ottica. Consentire ai ratti di esplorare l'ambiente per 3 minuti prima dell'induzione di LTD.
5. Accendere il generatore di impulsi per avviare la stimolazione optogenetica.
   NOTA: Sebbene improbabile, se il ratto sperimenta reazioni avverse alla stimolazione, l'esperimento viene immediatamente interrotto e i ratti vengono adeguatamente eutanizzati in base alle linee guida istituzionali.
6. Dopo l'induzione LTD, tenere i ratti nella gabbia per 3 minuti, quindi rimetterli nelle loro gabbie domestiche.
7. Per gli esperimenti di controllo, utilizzare la stessa procedura di stimolazione sui ratti che esprimono il virus di controllo AAV5-tdTomato. Per esperimenti fittizi, attaccare un cavo patch alla fibra ottica dei ratti che esprimono il virus AAV5-oChIEF, ma nessuna stimolazione viene erogata durante una sessione di 15 minuti.

5. Testare l'effetto della stimolazione optogenetica sulla ricerca di cocaina indotta da cue

1. 24 ore dopo le stimolazioni optogenetiche in vivo, rimettere i ratti in camere di condizionamento operanti. I ratti sono sottoposti a una sessione di reintegrazione indotta da segnali standard di 1 ora per valutare il comportamento di ricerca della cocaina.
   NOTA: Durante il reintegro indotto dal cue, una risposta sulla leva attiva produce una presentazione di 10 secondi del segnale associato alla cocaina, ma nessuna infusione di cocaina.
2. Dare un secondo test di reintegrazione almeno 1 settimana dopo il primo test per determinare se l'induzione optogenetica LTD provoca una soppressione a lungo termine della ricerca di cocaina

6. Colorazione, fluorescenza e imaging per la verifica istologica dell'espressione virale e del posizionamento delle fibre ottiche

1. Produrre 1x tampone fosfato salino (PBS) e 4% paraformaldeide (PFA). Conservare entrambe le soluzioni su ghiaccio. Il volume totale dipenderà dal numero di ratti nello studio (~ 100 ml di PBS e 200 ml di PFA saranno utilizzati per ratto).
   ATTENZIONE: Il PFA è una sostanza chimica tossica e cancerogena nota. Faccia attenzione per evitare l'inalazione e il contatto con la pelle. Il suo uso e smaltimento dovrebbero essere conformi alle linee guida istituzionali, compreso l'uso di DPI adeguati e di una cappa a flusso chimico.
2. Impostare la pompa peristaltica ad una portata di 20 ml/min. Riempire il tubo della pompa con 1x PBS. Attaccare un ago smussato calibro 20 all'estremità del tubo.
3. Anestetizzare profondamente i ratti con pentobarbital di sodio (100 mg/kg, i.p.). Confermare la profondità dell'anestesia per mancanza di risposta al pizzicamento del dito del piede prima di procedere ulteriormente.
   NOTA: Il pentobarbital di sodio viene utilizzato poiché la perfusione è una procedura terminale.
4. Utilizzare le forbici chirurgiche per tagliare la cavità addominale del ratto sotto il diaframma. Tagliare la gabbia toracica rostralmente lungo i bordi laterali per esporre il cuore del topo. Utilizzare emostatico per bloccare la porzione rostrale della gabbia toracica lontano dal cuore. Tagliare via qualsiasi tessuto adiposo sovrastante che circonda il cuore.
5. Inserire l'ago smussato attraverso il ventricolo sinistro e fino all'aorta. Tagliare un piccolo foro nell'atrio destro per drenare la soluzione mentre ritorna al cuore.
6. Perfondere ogni ratto con 1x PBS per 5 minuti seguito da 4% PFA, pH 7,4 per 10 min.
7. Decapitare il ratto, estrarre il cervello e postfissarlo in PFA al 4% per 24 ore. Quindi trasferire il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% per 2-3 d.
8. Sezione cervelli a 50 μm usando un criostato.
9. Montare tutte le fette contenenti LA o MGN su vetrini e coprivetrino.
10. Fette di immagine utilizzando un microscopio epifluorescente per verificare l'espressione di AAV-oChIEF-tdTomato nel MGN e le sue proiezioni al LA, nonché il posizionamento della fibra ottica sopra il LA.

7. Preparazione di perfusione e fette acute di cervello per esperimenti di elettrofisiologia

NOTA: Gli esperimenti elettrofisiologici vengono eseguiti su un sottogruppo di animali per convalidare il successo della LTD in vivo .

1. Preparare soluzioni elettrofisiologiche utilizzando i reagenti elencati nelle tabelle 1-3 ^4,13. Regolare il pH di tutte le soluzioni a 7,4 con HCl e regolare l'osmolarità a 300-310 mOsm/kg H₂O. Preparare le soluzioni fresche prima degli esperimenti e conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana. Saturare tutte le soluzioni con carbogeno (95% O 2/5% CO₂) in ogni momento durante l'uso.
2. Usando l'isoflurano secondo le linee guida locali o istituzionali per la cura e l'uso degli animali, anestetizzare profondamente il ratto in una camera di eutanasia chiusa.  Confermare che l'animale sia completamente anestetizzato tramite il riflesso del pizzico della punta.
3. Riempire un piccolo becher con 50 ml di soluzione di taglio ghiacciata. Riempire il tubo della pompa peristaltica con soluzione e regolare la portata a 20 mL/min. Attaccare un ago smussato calibro 20 all'estremità del tubo.
4. Aprire la cavità addominale (vedere i punti 6.4 e 6.5) e perfondere brevemente il ratto con la soluzione di taglio (massimo 1-2 minuti).
5. Dopo la perfusione, decapitare immediatamente il ratto. Rimuovere il cervello e metterlo in un piccolo becher riempito con una soluzione di taglio a 4 °C per 30 s-1 min.
6. Trasferisci i cervelli con una spatola e fissali rapidamente alla camera di un vibratomo. Rimuovere la pia usando una pinza fine. Riempire la camera con una soluzione di taglio a 4 °C e preparare fette coronali acute (250 μm di spessore) dell'amigdala ad una velocità di 0,37 mm/sec e una frequenza di 70 Hz.
7. Una volta ottenute le fette, porre ciascuna in una camera di mantenimento riempita con soluzione di taglio e incubare a 37 °C per 10-12 minuti. Si possono ottenere circa 5-7 fette contenenti il LA per animale.
8. Trasferire le fette in un becher di soluzione di mantenimento a temperatura ambiente (RT) e lasciare recuperare per >30 minuti prima della sperimentazione.
   NOTA: Le fette rimangono generalmente sane mentre vengono conservate in soluzione per 4-6 ore. A causa della natura fluorescente dell'AAV, le fette vengono mantenute in condizioni di scarsa illuminazione.

8. Registrazioni elettrofisiologiche ex vivo

1. Preparare soluzioni intracellulari utilizzando i reagenti elencati nelle tabelle 4-5.
   NOTA: Le soluzioni intracellulari devono essere preparate prima degli esperimenti e possono essere conservate a lungo termine (3-12 mesi) a -80 °C o a breve termine (1-2 mesi) a -20 °C. Le soluzioni sono regolate a pH a 7,3 (con CsOH per la soluzione intracellulare a base di Cs e con KOH per la soluzione intracellulare a base di K). Regolare ad un'osmolarità finale di 290-300 mOsm/kg H₂O.
2. Preparare 500 mM di soluzione madre di picrotossina disciolta in dimetilsolfossido (DMSO).
   NOTA: le scorte di picrotossina sono aliquotate e conservate a -20 °C. Il giorno dell'uso, le aliquote vengono scongelate e aggiunte alla soluzione di registrazione fino a una concentrazione finale di 100 μM.
   ATTENZIONE: La picrotossina è un antagonista non competitivo dei recettori GABA_A , quindi l'infusione di picrotossina ha un effetto stimolante. È gravemente tossico per ingestione orale o assorbimento cutaneo. DPI adeguati devono essere utilizzati in ogni momento quando si lavora con picrotossina.
3. Trasferire le fette su un microscopio verticale progettato per esperimenti di elettrofisiologia.
4. Durante gli esperimenti, bagnare continuamente le fette di perfuse con soluzione di registrazione riscaldata a 31-33 °C.
5. Ingrandisci il LA usando un obiettivo 4x. Identificare i principali neuroni per morfologia con una lente ad immersione in acqua 40x.
6. Utilizzare una pipetta di vetro (3-5 MΩ) riempita con una soluzione intracellulare basata su Cs (per esperimenti di morsetto di tensione) o una soluzione intracellulare a base di K (per esperimenti di pinza in corso) per ottenere registrazioni di patch clamp a cellule intere.
7. Identificare le proiezioni assonale MGN infette da AAV in fluorescenza (utilizzando un filtro RFP). Stimolare le proiezioni utilizzando un laser DPSS a luce blu (473 nm) collegato a un generatore di impulsi.
   ATTENZIONE: Per limitare l'esposizione laser, la luce laser collimata è accoppiata a una porta fluorescente sul microscopio e focalizzata sulla fetta attraverso l'obiettivo.
   NOTA: In modalità morsetto di tensione, le correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) sono evocate otticamente a 0,1 Hz. I neuroni che ricevono input da neuroni MGN infetti da AAV mostreranno EPSC affidabili.
8. Per indurre ex vivo LTD, in modalità corrente di morsetto, registrare una linea basale stabile di potenziali postsinaptici eccitatori (EPSP) per almeno 10 minuti. Successivamente, fornire 900 impulsi da 2 ms di luce a 473 nm a una frequenza di 1 Hz (tempo totale = 15 min). Quindi registrare continuamente EPSP a 0,1 Hz per ≥60 minuti.

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Risultati

Una sequenza temporale che delinea l'ordine degli esperimenti è mostrata nella Figura 1. Durante gli esperimenti comportamentali, il numero di infusioni di cocaina e il numero di risposte effettuate sulla leva attiva servono come misura dell'intensità del comportamento di ricerca della cocaina. Durante i primi giorni di auto-somministrazione di cocaina, il numero di risposte attive dovrebbe aumentare gradualmente durante ogni giorno di acquisizione, prima di stabilizzarsi durante la second...

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Discussione

Come descritto sopra, ci sono diversi passaggi critici che sono importanti per ottenere i risultati sperimentali corretti. Il protocollo sarà probabilmente efficace solo negli animali che acquisiscono correttamente l'autosomministrazione di cocaina e, ad oggi, è stato testato solo utilizzando i parametri sopra descritti. È possibile che la dose di cocaina, il programma di rinforzo e i parametri di cue possano essere modificati con probabilmente scarso effetto sui risultati comportamentali, con l'eccezione che un progr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP Magnesium Salt	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calcium chloride	Fisher Scientific	C1016
Cesium chloride	Fisher Scientific	289329
Cesium hydroxide	Fisher Scientific	516988
Cesium methanesulfonate	Fisher Scientific	C1426
Cocaine HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemistry Stockroom	200C5000
Ferrule Dust Caps	Thor Labs	CAPL	White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic	Thor Labs	FP200URT	200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint	Prizmatix	(Ordered from Amazon)	18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodium Salt	Fisher Scientific	G8877
Hamilton syringe	Hamilton	80085	10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
Ketamine HCl	Henry Schein	55853	Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s	Henry Schein	9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione	Fisher Scientific	G4251
Lidocaine	Butler Schein	14583
Light Sensor	Thor Labs	PM100D	Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive	Grainger	5E207
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump	Harvard Apparatus	70-4501	Dual syringe
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microscope for electrophysiology
Microscope	Olympus	BX61VS	Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet dental cement, liquid	Lang Dental	1504BLK	black
Orthojet dental cement, powder	Lang Dental	1530BLK	Contemporary powder, black
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch Cables	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polishing Disc	Thor Labs	D50FC
Polishing Pad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polishing Paper	Thor Labs	LFG5P	5 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG3P	3 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG1P	1 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm grit
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	P5958
Potassium methanesulfonate	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1064980500
Sodium L-Ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Sodium Pentobarbital	Henry Schein	24352
Sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphocreatine	Fisher Scientific	P7936
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Stainless steel machine screws	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Tissue Adhesive	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198