שימוש באופטוגנטיקה כדי להפוך גמישות מוחית ולעכב חיפוש קוקאין בחולדות

Summary

השיטות המתוארות כאן מתארות הליך המשמש להיפוך אופטוגנטי של פלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין במעגל רלוונטי התנהגותית בחולדות. גירוי אופטי מתמשך בתדר נמוך של סינפסות תלמו-אמיגדלה גורם לדיכאון ארוך טווח (LTD). In vivo המושרה אופטיגנטית LTD בחולדות שחוו קוקאין הביאה לאחר מכן להחלשה של חיפוש סמים המונע על ידי רמזים.

Abstract

פרוטוקול זה מדגים את הצעדים הדרושים לשימוש בכלים אופטוגנטיים כדי להפוך את הפלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין במעגלי תלמו-אמיגדלה כדי להפחית התנהגויות חיפוש קוקאין עוקבות בחולדה. במחקר שלנו, מצאנו שכאשר חולדות מנהלות בעצמן קוקאין תוך ורידי בשילוב עם רמז אורקולי, סינפסות הנוצרות בקלט מגרעין הגניקולאט המדיאלי של התלמוס (MGN) אל תאי העצב העיקריים של האמיגדלה הצידית (LA) מתחזקות ככל שנלמד הקשר בין רמז לקוקאין. שיערנו כי היפוך הפלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין בסינפסות אלה יפחית התנהגות המונעת על ידי קוקאין המונעת על ידי רמזים. על מנת להשיג סוג זה של נוירומודולציה in vivo, רצינו לגרום לדיכאון סינפטי לטווח ארוך (LTD), אשר מקטין את כוחן של סינפסות MGN-LA. לשם כך השתמשנו באופטוגנטיקה, המאפשרת נוירומודולציה של מעגלים מוחיים באמצעות אור. אופסין oChiEF מעורר בא לידי ביטוי על מסופי MGN presynaptic בלוס אנג'לס על ידי החדרת AAV המכיל oChiEF לתוך MGN. סיבים אופטיים הושתלו אז בלוס אנג'לס ואור לייזר 473 ננומטר פועם בתדר של 1 הרץ למשך 15 דקות כדי לגרום לפלסטיות המושרה על ידי קוקאין ולהפוך אותו. מניפולציה זו מייצרת הפחתה ארוכת טווח ביכולתם של רמזים הקשורים לקוקאין לגרום לפעולות חיפוש סמים.

Introduction

שימוש בסמים הוא נושא רציני מאוד לבריאות הציבור בארה"ב וברחבי העולם. למרות עשרות שנים של מחקר אינטנסיבי, יש מעט מאוד אפשרויות טיפוליות יעילות ^1,2. מכשול עיקרי בטיפול הוא העובדה ששימוש כרוני בסמים יוצר זיכרונות אסוציאטיביים ארוכי טווח בין רמזים סביבתיים לבין התרופה עצמה. חשיפה חוזרת לרמזים הקשורים לסמים מניעה תגובות פיזיולוגיות והתנהגותיות המניעות את המשך השימוש בסמים והישנות^3. אסטרטגיה טיפולית חדשנית היא ליישם טיפולים מבוססי זיכרון שמטרתם לתמרן את המעגלים המעורבים בוויסות אסוציאציות של רמזי סמים. לאחרונה, נצפה כי סינפסות באמיגדלה הצידית (LA), במיוחד אלה הנובעות מגרעין הגניקולאט המדיאלי (MGN) של התלמוס, מחוזקות על ידי מתן עצמי חוזר ונשנה של קוקאין הקשור לרמזים, וכי הגברה זו יכולה לתמוך בהתנהגות המחפשת קוקאין ^4,5. לכן, הוצע כי ניתן להחליש את ההחזרה הנגרמת על ידי רמזים על ידי היפוך הפלסטיות בסינפסות MGN-LA.

היכולת לכוון במדויק לפלסטיות הסינפטית של מעגל מוחי מסוים היוותה אתגר גדול לתחום. כלים פרמקולוגיים מסורתיים נחלו הצלחה מסוימת בהפחתת התנהגויות הישנות, אך הם מוגבלים על ידי חוסר היכולת לתפעל סינפסות בודדות. עם זאת, הפיתוח האחרון של אופטוגנטיקה in vivo סיפק את הכלים הדרושים כדי להתגבר על מגבלות אלה ולשלוט במסלולים עצביים בדיוק זמני ומרחבי ^6,7,8. על ידי ביטוי אופסינים רגישים לאור במעגל מוחי מסוים, אור לייזר יכול לשמש כדי להפעיל או לעכב את המעגל. ניתן להשתמש בגירוי אופטי תלוי תדר כדי לתפעל באופן ספציפי את הפלסטיות הסינפטית של המעגל בחיה מתנהגת.

כתב יד זה מתאר את ההליך שננקט כדי לתפעל את מעגל MGN-LA הרלוונטי מבחינה התנהגותית באמצעות אופטוגנטיקה in vivo . ראשית, האופסין המעורר oChIEF בא לידי ביטוי ב-MGN וסיבים אופטיים הושתלו באופן דו-צדדי בלוס אנג'לס. בעלי חיים אומנו אז לתת קוקאין באופן עצמאי באופן תלוי רמז, אשר מחזק את מסלול MGN-LA. לאחר מכן, גירוי מתמשך בתדר נמוך עם אור לייזר 473 ננומטר שימש לייצור LTD ספציפי למעגל. היפוך הפלסטיות הנגרמת על ידי שימוש בקוקאין יצר ירידה ארוכת טווח ביכולתם של רמזים להפעיל פעולות הקשורות להתנהגות חיפוש סמים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה עלו בקנה אחד עם ההנחיות שנקבעו על ידי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג. כל ההליכים בוצעו באמצעות חולדות בוגרות ותמימות של ספראג-דולי ששקלו 275-325 גרם עם הגעתן.

1. בניית שתלי סיבים אופטיים וכבלי טלאי

1. הכינו שתלי סיבים אופטיים בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו בעבר⁹. ניסויים המתוארים בפרוטוקול זה השתמשו בסיבי ליבה של 200 מיקרומטר (0.5 NA) ו-Ø1.25 מ"מ Multimode LC/PC Ceramic ferrule, בגודל חור Ø230 מיקרומטר.
   1. השתמש בכלי Dremel כדי להבקיע את השליש התחתון של ferrule (הקרוב ביותר לקצה השטוח של ferrule). ניקוד הפרולים עוזר להם להישאר מחוברים לצמנט דנטלי, ומגדיל את הסיכוי שהם יישארו בטוחים לאורך כל תקופת הניסויים.
   2. השתמש חותכי חוט לחתוך ~ 35 מ"מ של סיבים. השתמש בכלי הפשטת סיבים כדי להסיר ~ 25 מ"מ של סיבים, ולהשאיר 10 מ"מ לא חשופים.
   3. הכינו אפוקסי הניתן לריפוי בחום בהתאם להוראות היצרן. יש להמיס 1 גרם אבקת שרף ב-100 מ"ג של תרכובת מקשה. חבר מחט קהה של 25 מד למזרק 1 מ"ל. ממלאים את המזרק באפוקסי ומחברים קצה מחט קהה בעל 25 מד.
   4. השתמש בסגן או מהדק כדי להחזיק היטב את המוט כאשר הצד השטוח פונה כלפי מעלה והצד הקמור פונה כלפי מטה. בעזרת המזרק המלא אפוקסי, מוסיפים טיפה אחת של אפוקסי לצד השטוח של הפרול, תוך זהירות כדי לנגב עודפי אפוקסי מדפנות הפרול.
   5. הכניסו את החלק המופשט של הסיב דרך הפרול ואפשרו חשיפת 5 מ"מ נוספים של סיב מופשט. במקרה של שתלי LA, הסיב יושתל 7.9 מ"מ גחון לברגמה, כך שהאורך החשוף של סיבים לא מופשטים צריך להיות ~ 13 מ"מ.
   6. מרפאים את האפוקסי עם אקדח חום למשך כ-30-40 שניות עד שהוא הופך לשחור/ענברי.
   7. הניחו את הסיב ישירות בממשק של הקצה הקמור של הסיב בעזרת סכין יהלום והשתמשו באצבע כדי להקיש בעדינות על הסיב.
   8. לטש את הקצה הקמור של הפרול על ידי אחיזה עם המוסטט, להקפיד להפעיל לחץ אחיד, וביצוע 20 סיבובים מעגליים כל אחד על סדרה של נייר ליטוש (מדרגה גבוהה לדרגה נמוכה; 5, 3, 1, 0.3 מיקרומטר).
   9. הצמידו סיב לא מופשט לשולחן באמצעות סרט הדבקה וסיב מופשט, והותירו 2 מ"מ נוספים מעבר לקואורדינטה הגחונית (עבור שתלי LA, אורך הסיב הסופי הוא ~10 מ"מ). השתמש hemostat כדי למשוך את ferrule ולשבור באופן שווה את הסיב שבו הוא כבר הבקיע. היזהרו לא לחתוך את הסיבים לחלוטין בעת הניקוד, אחרת ליבת הסיב תיפגע.
2. בנה כבלי תיקון התואמים לשתלי סיבים אופטיים. נרכשו כבלי תיקון בעיצוב אישי (ראה טבלת חומרים). לחלופין, ניתן לבנות כבלי תיקון בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו בעבר⁹.
   הערה: הקוטר וה-NA של סיב הפרול וסיב כבל התיקון חייבים להתאים בצומת הצימוד כדי למנוע אובדן עודף של אור, מה שעלול לגרום לכשל לעורר מספיק פעילות עצבית.
3. מדוד את תפוקת האור באמצעות כבל התיקון ושתלי הסיב האופטי על-ידי חיבור כבל טלאי/סיב אופטי למקור אור לייזר מתאים (473 ננומטר, פלט של 1 mW) ומדידת פלט באמצעות חיישן אור. סיב שנבנה בהצלחה יפלוט מעגל קונצנטרי של אור ויהיה לו לא יותר מ-30% אובדן אור.

2. צנתור תוך ורידי מכרסמים, העברת וירוסים והשתלת סיבים אופטיים

1. הכינו את בעל החיים לניתוח.
   1. הרדמה מלאה של חולדות בחומר הרדמה לפי בחירה בהתאם להנחיות המוסדיות. אפשרות אחת היא קטמין הידרוכלוריד (87.5-100 מ"ג/ק"ג, i.m.) וקסילזין הידרוכלוריד (5 מ"ג/ק"ג, i.m). ודאו שהחולדה מורדמת לחלוטין על ידי בדיקת היעדר רפלקס צביטת בוהן.
      אזהרה: קטמין הוא חומר מבוקר שיש לטפל בו בהתאם להנחיות המוסדיות.
      הערה: הזרקה תוך שרירית של חומרי הרדמה משמשת במחקר זה מכיוון שהיא הפיקה השראת הרדמה מהירה ואמינה יותר מאשר הזרקה תוך צפקית. יש לעקוב באופן רציף אחר הנשימה וההיענות של החולדה ולספק תמיכה תרמית לאורך כל הניתוח.
   2. יש לגלח שטח גדול מגבה של החולדה (גב עליון ממש מעל השכמות ועד אמצע הגב) וכן את אזור הצוואר מתחת לגפה הקדמית הימנית, ואת הקרקפת.
   3. הניחו את החולדה באזור הניתוח ומרחו puralube (דמעות מלאכותיות) על העיניים. יש להזריק נפח משקל גוף של קרפרופן (משכך כאבים) תת עורית (s.c.) דרך עור הגב העליון, ולאחר מכן להזריק 5 מ"ל של תמיסת Lactated Ringer s.c. דרך עור הגב התחתון.
   4. יש לחטא את כל אתרי הניתוח על ידי הרטבת חתיכת גזה סטרילית עם בטדין וניגוב האזור הכירורגי המגולח בתנועה מעגלית. לאחר מכן חזור על התהליך עם אתנול 70%. חזור על מחזור חילופין זה שלוש פעמים.
2. ביצוע השתלת קטטר תוך ורידי על פי פרוטוקולים ^4,10 שפורסמו בעבר.
   הערה: לא נעשה שימוש בוילון כירורגי במהלך ניתוח זה כדי למנוע גירוי במהלך השתלת קטטר. יש לעקר את כל המכשירים והציוד לפני השימוש. השתמשו בכפפות סטריליות והחליפו את הכפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי.
3. מיד לאחר השתלת הצנתר, אבטחו את החולדה במסגרת סטריאוטקסית לביצוע זריקות AAV.
   1. יש לבצע הזרקה תת-עורית (s.c) של 2% לידוקאין (0.2-0.3 מ"ל) לקרקפת כהרדמה מקומית.
      הערה: לא נעשה שימוש בהרדמה מקומית במהלך השתלת הצנתר תוך ורידי כדי למנוע שינויים בתוצאות הניתוח.
   2. חבר צינורית הזרקת נירוסטה 26 מד למזרק המילטון מלא 1 μL של תמיסת AAV מרוכזת: AAV5-hSyn-tdTomato או AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      הערה: oChIEF הוא גרסה של אופסין צ'נלרודופסין הרגיש לאור כחול (ChR2), שיכול להגיב לטווח רחב של תדרים ^8,11, ולכן יש לו תועלת לניסויי LTD בתדר נמוך הנדונים בפרוטוקול זה, אך גם לניסויי LTP בתדר גבוה (שלא נדון כאן). מבנה oChIEF נתרם על ידי ד"ר רוג'ר טסיין ועובד לאריזה וטיהור על ידי ליבת הווקטור הנגיפי של דיוק. נדרשים לפחות 3-4 שבועות בין יום ההזרקה ליום הזירוז על מנת לאפשר ביטוי אופטימלי של הנגיף במסופי אקסון MGN.
      זהירות: באופן כללי, AAV נחשב לאורגניזם ברמת בטיחות ביולוגית 1 (BSL-1), עם סיכון נמוך להדבקה עצמית, אלא אם כן נעשה שימוש בנגיף מסייע בייצורו. השימוש בו דורש אישור IACUC ויש להשתמש בציוד הגנה אישי נאות בכל עת בהתאם להנחיות המוסדיות כדי להגביל חשיפה מיותרת.
   3. בעזרת אזמל, בצע חתך של 0.5 מ"מ מהחלק הקדמי לחלק האחורי של הגולגולת, והסר את הרקמה שמעליו כדי לחשוף את פני הגולגולת.
   4. יישור ראש החולדה בציר הקדמי/אחורי ואפס קואורדינטות סטריאוטקסיות לברגמה.
   5. קדח שלושה חורים קטנים דרך הגולגולת באמצעות כלי Dremel מצויד מקדח קטן. השתמש במברג כדי להרכיב היטב ברגי נירוסטה (M2x4 965-A2) במקומם.
      הערה: ברגים נחוצים לקשירה נכונה של מלט דנטלי וליצירת כיסויי ראש חזקים ועמידים לאורך זמן. מיקום הברגים צריך להיות מפוזר על פני הציר הקדמי-אחורי של הגולגולת, והרחק מאתר הזרקת AAV.
   6. קידוח חורים דו-צדדיים להזרקת AAV בהתבסס על הקואורדינטות מאטלס מוח החולדות (ווטסון ופקסינוס)¹² עבור החלק המדיאלי של גרעין הגניקולאט המדיאלי (MGN); במ"מ מברגמה, AP: -5.4; מ"ל: ±3.0; DV: -6.6. מורידים לאט את צינורית ההזרקה (4 מ"מ/דקה) עד למיקום ב-MGN. הזרקת תמיסת AAV מרוכזת בקצב של 0.1 מיקרוליטר/דקה.
   7. השאירו את צינורית ההזרקה במקומה למשך 5 דקות לאחר השלמת העירויים כדי לאפשר דיפוזיה הרחק מהצינורית ולאחר מכן משכו לאט את הצינורית מהמוח.
4. מיד לאחר הזרקות הנגיף, המשך להשתיל סיבים אופטיים ^4,9 המכוונים למסופי MGN-LA.
   1. השתמש בכלי Dremel כדי לקדוח חורים דו-צדדיים עבור שתלי סיבים אופטיים המכוונים לאמיגדלה הצידית (במ"מ מברגמה, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את המוט של שתל הסיב האופטי ולקבע אותו למתאמים הסטריאוטקסיים כך שהם מוחזקים היטב במקומם.
   3. מורידים לאט את הסיבים בקצב של 2 מ"מ/דקה, עד שקצה הסיב יושב בחלק הגבי של ה-LA (DV: -7.9 מ"מ).
   4. הצמידו את המוט לגולגולת תחילה באמצעות שכבה דקה של דבק אינסטנט Loctite, ולאחר מכן צמנט דנטלי וכסו את הפרולים בשרוולים וכיסויי אבק בקוטר 1.25 מ"מ.
      הערה: בחירת הדבק להבטחת הדבק לגולגולת צריכה להיות מאושרת על ידי הוועדה המקומית או המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. לוקטיט משמש במחקר זה כדי לאבטח באופן אמין את הפרולים לגולגולת לאחר ניסוי וטעייה עם דבקים מרובים; עם זאת, ניתן לשקול חלופות זמינות.
5. לאחר הליכים כירורגיים, חולדות הבית בנפרד, ולספק גישה חופשית למזון ומים. מתן טיפול לאחר הניתוח בהתאם להנחיות המוסדיים. יש לשטוף צנתרים מדי יום במי מלח המכילים גנטמיצין (5 מ"ג/מ"ל) והפרין (30 USP/מ"ל) לשמירה על הפטנטות. לפחות 5 ימים לאחר הניתוח ו-24 שעות לפני תחילת הניסויים ההתנהגותיים, המזון מגביל את החולדות ל~90% ממשקל ההזנה החופשית שלהן.

3. מכרסם קוקאין ניהול עצמי והכחדת מנוף אינסטרומנטלי

הערה: כל ההליכים ההתנהגותיים מתבצעים בתאי מיזוג אופרנטיים סטנדרטיים, המצוידים בשני מנופים נשלפים על קיר אחד, אור גירוי מעל כל מנוף, מחולל צלילים, תאורת בית ומשאבת עירוי.

1. העבירו חולדות לאימונים יומיים של 1-h קוקאין (2 מ"ג/מ"ל) תחת לוח זמנים של חיזוק FR1.
   1. הניחו חולדות בתא ניתוח בכל יום ואפשרו לחולדות ללחוץ. לחיצה על 'המנוף האקטיבי' הייעודי (מאוזן על פני המנוף השמאלי והימני) גורמת לעירוי קוקאין (1.0 מ"ג/ק"ג/עירוי) ולהצגה של 10 שניות של רמז מורכב של אור וטון. ללחיצה על 'המנוף הלא פעיל' הייעודי אין אפקטים מתוכנתים.
   2. המשיכו בניסויים בניהול עצמי במשך 10 ד' לפחות ועד שהחולדות יצליחו לקבל לפחות 8 עירויים ביום במשך 3 ימים רצופים. אי הגעה לקריטריוני רכישה עד היום ה-20 גורמת להרחקה מהמחקר.
2. לאחר עמידה מוצלחת בקריטריוני הרכישה, העבירו החולדות מפגשי הכחדה אינסטרומנטלית של שעה אחת במשך 6-10 ד'.
   1. הניחו חולדות בתאי ניתוח ואפשרו לחולדות ללחוץ בחופשיות. עם זאת, לתגובות הן במנופים הפעילים והן במנופים הלא פעילים אין השלכות מתוכנתות.
   2. האם החולדות ממשיכות בהכחדה אינסטרומנטלית מדי יום עד לממוצע של < 25 לחיצות מנוף במשך יומיים רצופים.

4. אינדוקציה אופטוגנטית In vivo של LTD

הערה: ניסויי עיכוב אופטוגנטי מתקיימים 24 שעות לאחר היום האחרון של ההכחדה האינסטרומנטלית.

1. חבר כבלי תיקון לדיודת לייזר כחולה בגודל 473 ננומטר באמצעות מפרק סיבובי התלוי מעל כלוב בית מכרסמים נקי וסטנדרטי עם הסרת הכיסוי. מערך זה מאפשר למכרסמים לנוע בחופשיות בכלוב במהלך הגירוי האופטוגנטי.
2. הפעל דיודת לייזר בהתאם להוראות ההפעלה והתחבר למחולל פולסים. התאם הגדרות, כך שכאשר מופעל החולדה תקבל 900 פולסים של 2-ms של אור ב 1 הרץ.
   התראה: יש להשתמש בהגנה נאותה על העיניים בכל עת בעת הפעלת לייזר.
3. מדוד את עוצמת האור באמצעות כבל התיקון באמצעות חיישן אור. התאם את עוצמת הלייזר כך שתפוקת האור דרך כבל התיקון תהיה ~ 5-7 mW.
4. הניחו חולדות בכלוב דיור נקי. הסירו את כיסויי האבק ואת שרוולי הפרול, וחשפו את הפרולים. חבר את כבלי התיקון באופן דו-צדדי לשתלי הסיב האופטי. לאפשר לחולדות לחקור את הסביבה במשך 3 דקות לפני השראת LTD.
5. הפעל את מחולל הדופק כדי ליזום גירוי אופטוגנטי.
   הערה: למרות שזה לא סביר, אם חולדות חוות תגובות שליליות כלשהן לגירוי, הניסוי מופסק מיד, וחולדות מורדמות כראוי בהתבסס על הנחיות מוסדיות.
6. לאחר זירוז בע"מ, יש להחזיק חולדות בכלוב למשך 3 דקות, ולאחר מכן להחזיר אותן לכלובים הביתיים שלהן.
7. עבור ניסויי בקרה, השתמש באותו הליך גירוי על חולדות המבטאות את וירוס הבקרה AAV5-tdTomato. עבור ניסויים דמה, חבר כבל תיקון לסיב האופטי של חולדות המבטאות את נגיף AAV5-oChIEF, אך שום גירוי אינו מועבר במהלך פגישה של 15 דקות.

5. בדקו את ההשפעה של גירוי אופטוגנטי על חיפוש קוקאין הנגרם על ידי רמזים

1. 24 שעות לאחר גירוי אופטוגנטי in vivo, החזירו את החולדות לתאי התניה אופרנטיים. חולדות עוברות סשן החזרה סטנדרטי של שעה אחת כדי להעריך התנהגות של חיפוש קוקאין.
   הערה: במהלך החזרה הנגרמת על ידי רמז, תגובה על המנוף הפעיל מניבה הצגה של 10 שניות של הרמז הקשור לקוקאין, אך ללא עירויי קוקאין.
2. תן בדיקת השבה שנייה לפחות שבוע לאחר הבדיקה הראשונה כדי לקבוע אם השראת LTD אופטוגנטית גורמת לדיכוי ארוך טווח של חיפוש קוקאין

6. צביעה, פלואורסצנטיות והדמיה לאימות היסטולוגי של ביטוי נגיפים ומיקום סיבים אופטיים

1. לייצר 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) ו 4% paraformaldehyde (PFA). אחסנו את שני הפתרונות על קרח. הנפח הכולל יהיה תלוי במספר החולדות במחקר (~ 100 מ"ל של PBS ו 200 מ"ל של PFA ישמשו לכל חולדה).
   זהירות: PFA הוא כימיקל רעיל ומסרטן ידוע. יש להקפיד כראוי על מנת למנוע שאיפה, כמו גם מגע עם העור. השימוש בו וסילוקו, צריכים להיות בהתאם להנחיות מוסדיות, לרבות שימוש בציוד הגנה אישי מתאים ובמכסה מנוע לזרימה כימית.
2. התקנת משאבה פריסטלטית בקצב זרימה של 20 מ"ל/דקה. מלא צינורות של משאבה עם 1x PBS. חבר מחט קהה של 20 מד לקצה הצינור.
3. הרדימו חולדות עמוקות עם נתרן פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג, כלומר). ודא את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן לפני שתמשיך הלאה.
   הערה: נתרן pentobarbital משמש מאז זילוח הוא הליך סופני.
4. השתמש מספריים כירורגיים כדי לחתוך את חלל הבטן של החולדה מתחת לסרעפת. חתכו דרך כלוב הצלעות לאורך הקצוות הרוחביים כדי לחשוף את לב החולדה. השתמש hemostat כדי להדק את החלק rostral של כלוב הצלעות הרחק מהלב. חתכו כל רקמת שומן שמקיפה את הלב.
5. הכנס את המחט הקהה דרך החדר השמאלי ומעלה לתוך אבי העורקים. חתכו חור קטן באטריום הימני כדי לנקז את התמיסה כשהיא חוזרת ללב.
6. ערבבו כל חולדה עם PBS אחד למשך 5 דקות ואחריו 4% PFA, pH 7.4 למשך 10 דקות.
7. ערפו את ראשה של החולדה, חלצו את המוח ודחפו אותו ל-4% PFA למשך 24 שעות. לאחר מכן להעביר את המוח לתמיסת סוכרוז 30% עבור 2-3 d.
8. חותך את המוח ב 50 מיקרומטר באמצעות cryostat.
9. הרכיבו את כל הפרוסות המכילות את LA או MGN על מגלשות זכוכית וכיסוי.
10. תמונות פרוסות באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כדי לאמת את ביטוי AAV-oChIEF-tdTomato ב- MGN והקרנות שלו ללוס אנג'לס, כמו גם מיקום הסיב האופטי מעל לוס אנג'לס.

7. זילוח והכנת פרוסת מוח חריפה לניסויים אלקטרופיזיולוגיים

הערה: ניסויים אלקטרופיזיולוגיים מבוצעים על תת-קבוצה של בעלי חיים כדי לאמת את ההצלחה של in vivo LTD.

1. הכינו תמיסות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלאות 1-3 ^4,13. כוונן את רמת החומציות של כל התמיסות ל-7.4 עם HCl וכוונן את האוסמולריות ל-300-310 mOsm/kg H₂O. הפוך את התמיסות לטריות לפני ניסויים ואחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע אחד. יש להרוות את כל התמיסות בקרבוגן (95% O 2/5% CO₂) בכל עת במהלך השימוש.
2. שימוש באיזופלורן בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המקומיים או המוסדיים, מרדימים את החולדה עמוק בתא המתת חסד סגור.  ודא כי בעל החיים מורדם לחלוטין באמצעות רפלקס צביטת הבוהן.
3. מלאו קטנה ב-50 מ"ל של תמיסת חיתוך קרה כקרח. מלא את צינורות המשאבה הפריסטלטית בתמיסה והתאם את קצב הזרימה ל-20 מ"ל/דקה. חבר מחט קהה של 20 מד לקצה הצינור.
4. פתחו את חלל הבטן (ראו שלבים 6.4 ו-6.5) ונקבו לזמן קצר את החולדה בתמיסת חיתוך (מקסימום 1-2 דקות).
5. לאחר הזילוח, ערפו מיד את ראשו של החולדה. מוציאים את המוח ומניחים אותו בכוס קטנה מלאה בתמיסת חיתוך של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 s-1 min.
6. להעביר מוחות עם מרית במהירות לתקן אותם לחדר של ויברטום. מוציאים את הפייה בעזרת מלקחיים עדינים. ממלאים את התא בתמיסת חיתוך בטמפרטורה של 4°C ומכינים פרוסות קורונליות חריפות (בעובי 250 מיקרומטר) של האמיגדלה במהירות של 0.37 מ"מ לשנייה ובתדירות של 70 הרץ.
7. עם קבלת הפרוסות, הניחו כל אחת מהן בתא אחיזה מלא בתמיסת חיתוך ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-12 דקות. ניתן להשיג כ 5-7 פרוסות המכילות את LA לכל חיה.
8. העבירו את הפרוסות לתמיסת החזקה של בטמפרטורת החדר (RT) והניחו להן להתאושש במשך >30 דקות לפני הניסוי.
   הערה: פרוסות בדרך כלל נשארות בריאות בזמן שהן נשמרות בתמיסה למשך 4-6 שעות. בשל האופי הפלואורסצנטי של AAV, פרוסות נשמרות בתנאי תאורה חלשה.

8. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות Ex vivo

1. הכינו תמיסות תוך-תאיות באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלאות 4-5.
   הערה: תמיסות תוך תאיות צריכות להתבצע לפני ניסויים וניתן לאחסן אותן לטווח ארוך (3-12 חודשים) ב -80 ° C או לטווח קצר (1-2 חודשים) ב -20 ° C. הפתרונות מותאמים ל-pH של 7.3 (עם CsOH עבור תמיסה תוך-תאית מבוססת Cs ועם KOH עבור תמיסה תוך-תאית מבוססת K). התאמה לאוסמולריות סופית של 290-300 mOsm/kg H₂O.
2. הכינו 500 mM picrotoxin תמיסת מלאי מומס dimethylsulfoxide (DMSO).
   הערה: מניות Picrotoxin הם aliquoted ומאוחסנים ב -20 °C. ביום השימוש, aliquots מופשרים ומתווספים לתמיסת הקלטה לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
   זהירות: Picrotoxin הוא אנטגוניסט לא תחרותי של קולטני GABA_A , ולכן עירוי של picrotoxin יש השפעה מגרה. זה רעיל מאוד על ידי בליעה דרך הפה או ספיגת העור. יש להשתמש ב- PPE תקין בכל עת בעת עבודה עם picrotoxin.
3. מעבירים פרוסות למיקרוסקופ זקוף המיועד לניסויים אלקטרופיזיולוגיים.
4. במהלך הניסויים, יש לשטוף ברציפות פרוסות עם תמיסת הקלטה המחוממת ל 31-33 מעלות צלזיוס.
5. הגדל את לוס אנג'לס באמצעות מטרה פי 4. זהה נוירונים עיקריים לפי מורפולוגיה עם עדשת טבילה במים 40x.
6. השתמש בפיפטה מזכוכית (3-5 MΩ) מלאה בתמיסה תוך-תאית מבוססת C (לניסויי מהדק מתח) או בתמיסה תוך-תאית מבוססת K (לניסויי מהדק נוכחיים) כדי להשיג הקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים.
7. זהה תחזיות אקסונליות MGN נגועות ב- AAV תחת פלואורסצנטיות (באמצעות מסנן RFP). עורר הקרנות באמצעות לייזר DPSS של אור כחול (473 ננומטר) המחובר למחולל פולסים.
   התראה: כדי להגביל את החשיפה ללייזר, אור לייזר משולב ליציאת פלורסנט במיקרוסקופ וממוקד על הפרוסה דרך המטרה.
   הערה: במצב מהדק מתח, זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSC) מעוררים אופטית ב-0.1 הרץ. תאי עצב שמקבלים קלט מנוירוני MGN נגועים ב-AAV יציגו EPSC אמין.
8. כדי לגרום ל- ex vivo LTD, במצב מהדק נוכחי, רשום קו בסיס יציב של פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSPs) למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, ספק 900 פולסים של 2-ms של אור 473-ננומטר בתדר של 1 הרץ (זמן כולל = 15 דקות). לאחר מכן הקלט ברציפות EPSPs ב 0.1 הרץ במשך ≥60 דקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ציר זמן המתאר את סדר הניסויים מוצג באיור 1. במהלך ניסויים התנהגותיים, מספר עירויי הקוקאין, כמו גם מספר התגובות המבוצעות על המנוף הפעיל, משמשים כמדד לעוצמת ההתנהגות המחפשת קוקאין. במהלך הימים הראשונים של מתן עצמי של קוקאין, מספר התגובות הפעילות אמור לגדול בהדרגה בכל יום רכיש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כפי שתואר לעיל, ישנם מספר שלבים קריטיים החשובים להשגת תוצאות הניסוי הנכונות. סביר להניח שהפרוטוקול יהיה יעיל רק בבעלי חיים שרוכשים כראוי קוקאין בניהול עצמי, ועד כה הוא נבדק רק באמצעות הפרמטרים שפורטו לעיל. ייתכן שניתן לשנות את מינון הקוקאין, לוח הזמנים של החיזוק ופרמטרים של רמזים עם השפעה ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP Magnesium Salt	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calcium chloride	Fisher Scientific	C1016
Cesium chloride	Fisher Scientific	289329
Cesium hydroxide	Fisher Scientific	516988
Cesium methanesulfonate	Fisher Scientific	C1426
Cocaine HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemistry Stockroom	200C5000
Ferrule Dust Caps	Thor Labs	CAPL	White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic	Thor Labs	FP200URT	200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint	Prizmatix	(Ordered from Amazon)	18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodium Salt	Fisher Scientific	G8877
Hamilton syringe	Hamilton	80085	10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
Ketamine HCl	Henry Schein	55853	Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s	Henry Schein	9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione	Fisher Scientific	G4251
Lidocaine	Butler Schein	14583
Light Sensor	Thor Labs	PM100D	Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive	Grainger	5E207
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump	Harvard Apparatus	70-4501	Dual syringe
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microscope for electrophysiology
Microscope	Olympus	BX61VS	Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet dental cement, liquid	Lang Dental	1504BLK	black
Orthojet dental cement, powder	Lang Dental	1530BLK	Contemporary powder, black
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch Cables	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polishing Disc	Thor Labs	D50FC
Polishing Pad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polishing Paper	Thor Labs	LFG5P	5 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG3P	3 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG1P	1 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm grit
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	P5958
Potassium methanesulfonate	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1064980500
Sodium L-Ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Sodium Pentobarbital	Henry Schein	24352
Sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphocreatine	Fisher Scientific	P7936
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Stainless steel machine screws	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Tissue Adhesive	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198