Usando a optogenética para reverter a neuroplasticidade e inibir a busca de cocaína em ratos

Resumo

Os métodos aqui descritos descrevem um procedimento usado para reverter optogeneticamente a plasticidade induzida pela cocaína em um circuito comportamentalmente relevante em ratos. A estimulação óptica sustentada de baixa frequência das sinapses tálamo-amígdala induz depressão a longo prazo (LTD). A LTD induzida optogeneticamente in vivo em ratos com experiência em cocaína resultou na subsequente atenuação da procura de droga motivada por pistas.

Resumo

Este protocolo demonstra os passos necessários para o uso de ferramentas optogenéticas para reverter a plasticidade induzida pela cocaína nos circuitos tálamo-amígdala para reduzir os comportamentos subsequentes de busca de cocaína no rato. Em nossa pesquisa, descobrimos que, quando os ratos autoadministram cocaína intravenosa emparelhada com uma sugestão audiovisual, as sinapses formadas nas entradas do núcleo geniculado medial do tálamo (MGN) nos neurônios principais da amígdala lateral (LA) tornam-se mais fortes à medida que a associação cue-cocaína é aprendida. Levantamos a hipótese de que a reversão da plasticidade induzida pela cocaína nessas sinapses reduziria o comportamento de busca de cocaína motivado por pistas. Para realizar esse tipo de neuromodulação in vivo, queríamos induzir depressão sináptica de longo prazo (LTD), que diminui a força das sinapses MGN-LA. Para tanto, utilizou-se a optogenética, que permite a neuromodulação dos circuitos cerebrais utilizando a luz. A opsina excitatória oChiEF foi expressa em terminais MGN pré-sinápticos no AL por infusão de um AAV contendo oChiEF no MGN. Fibras ópticas foram então implantadas no AL e a luz laser de 473 nm foi pulsada na frequência de 1 Hz por 15 minutos para induzir LTD e reverter a plasticidade induzida pela cocaína. Essa manipulação produz uma redução duradoura na capacidade das pistas associadas à cocaína de induzir ações de busca de drogas.

Introdução

O abuso de substâncias é um problema de saúde pública muito sério nos EUA e no mundo. Apesar de décadas de intensa pesquisa, existem pouquíssimas opções terapêuticas efetivas ^1,2. Um grande revés para o tratamento é o fato de que o uso crônico de drogas gera memórias associativas de longo prazo entre pistas ambientais e a própria droga. A reexposição a pistas relacionadas a drogas impulsiona respostas fisiológicas e comportamentais que motivam o uso contínuo de drogas e a recaída³. Uma nova estratégia terapêutica é promulgar tratamentos baseados na memória que visam manipular os circuitos envolvidos na regulação das associações medicamentosas. Recentemente, observou-se que as sinapses da amígdala lateral (AE), especificamente aquelas decorrentes do núcleo geniculado medial (MGN) do tálamo, são fortalecidas pela autoadministração repetida de cocaína associada a pistas, e que essa potencialização pode apoiar o comportamento de busca de cocaína ^4,5. Portanto, foi proposto que a reintegração induzida por pistas poderia ser atenuada pela reversão da plasticidade nas sinapses MGN-LA.

A capacidade de atingir com precisão a plasticidade sináptica de um circuito cerebral específico tem sido um grande desafio para o campo. As ferramentas farmacológicas tradicionais têm tido algum sucesso na diminuição dos comportamentos de recaída, mas são limitadas pela incapacidade de manipular sinapses individuais. No entanto, o recente desenvolvimento da optogenética in vivo forneceu as ferramentas necessárias para superar essas limitações e controlar as vias neurais com precisão temporal e espacial ^6,7,8. Ao expressar opsinas sensíveis à luz em um circuito cerebral específico, a luz laser pode então ser usada para ativar ou inibir o circuito. A estimulação óptica dependente de frequência pode ser utilizada para manipular especificamente a plasticidade sináptica do circuito em um animal que se comporta.

Este manuscrito descreve o procedimento adotado para manipular o circuito MGN-LA comportamentalmente relevante usando optogenética in vivo. Primeiramente, a opsina excitatória oChIEF foi expressa no MGN e as fibras ópticas foram implantadas bilateralmente no AE. Os animais foram então treinados para auto-administrar cocaína de forma dependente de pista, o que potencializa a via MGN-LA. Em seguida, a estimulação sustentada de baixa frequência com luz laser de 473 nm foi usada para produzir LTD específica do circuito. A reversão da plasticidade induzida pelo uso de cocaína gerou uma redução duradoura na capacidade das pistas de desencadear ações associadas ao comportamento de busca de drogas.

Protocolo

Os experimentos descritos neste protocolo foram consistentes com as diretrizes estabelecidas pelo National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Todos os procedimentos foram realizados com ratos Sprague-Dawley adultos e ingênuos que pesavam 275-325 g na chegada.

1. Construção de implantes de fibra óptica e cabos de remendo

1. Preparar implantes de fibra óptica seguindo protocolos previamente publicados⁹. Os experimentos descritos neste protocolo utilizaram uma ferrule cerâmica de núcleo de 200 μm (0,5 NA) e uma ferrule cerâmica Ø1,25 mm Multimodo LC/PC, tamanho do furo de Ø230 μm.
   1. Use uma ferramenta de Dremel para pontuar o terço inferior de uma ferrule (mais próxima da extremidade plana da ferrule). Pontuar as ferrules ajuda-os a permanecer apegados ao cimento dental, aumentando a probabilidade de que permaneçam seguros durante toda a extensão da experimentação.
   2. Use cortadores de arame para cortar ~ 35 mm de fibra. Use a ferramenta de decapagem de fibra para retirar ~ 25 mm de fibra, deixando 10 mm não expostos.
   3. Prepare o epóxi curável pelo calor de acordo com as instruções do fabricante. Dissolver 1 g de resina em pó em 100 mg de composto endurecedor. Ligue uma agulha embotada de calibre 25 a uma seringa de 1 ml. Encha a seringa com epóxi e prenda uma ponta de agulha embotada de calibre 25.
   4. Use um vice ou grampo para segurar com segurança a ponteira com o lado plano voltado para cima e o lado convexo voltado para baixo. Com a seringa cheia de epóxi, adicione uma gota de epóxi ao lado plano da ferrule, tomando cuidado para limpar o excesso de epóxi dos lados da ferrule.
   5. Insira a porção despojada de fibra através da ponteira permitindo um extra de 5 mm de fibra despojada exposta. No caso de implantes de AL, a fibra será implantada de 7,9 mm ventral a bregma, de modo que o comprimento exposto da fibra não despojada deve ser de ~ 13 mm.
   6. Cure o epóxi com uma pistola de calor por cerca de 30-40 s até que ele fique preto / âmbar na cor.
   7. Marque a fibra diretamente na interface da extremidade convexa da ferrule com faca de diamante e use um dedo para tocar suavemente a fibra.
   8. Polir a extremidade convexa da ferrule segurando com um hemostático, certificando-se de aplicar pressão uniforme e fazendo 20 rotações circulares cada uma em uma série de papel de polimento (de alto grau a baixo grau; 5, 3, 1, 0,3 μm).
   9. Prenda a fibra não despojada à mesa usando fita adesiva e marque a fibra despojada, deixando 2 mm extras além da coordenada ventral (para implantes LA, o comprimento final da fibra é de ~10 mm). Use um hemostático para puxar a ferrule e quebrar uniformemente a fibra onde ela foi marcada. Tenha cuidado para não cortar a fibra completamente ao marcar, ou então o núcleo da fibra será danificado.
2. Construa cabos de patch compatíveis com implantes de fibra óptica. Cabos de patch personalizados foram comprados (Consulte Tabela de Materiais). Alternativamente, os cabos de patch podem ser construídos seguindo protocolos publicados anteriormente⁹.
   NOTA: O diâmetro e o NA da fibra da ponteira e da fibra do cabo de remendo devem corresponder na junção de acoplamento para evitar o excesso de perda de luz, o que pode resultar em uma falha em estimular suficientemente a atividade neural.
3. Meça a saída de luz através do cabo de remendo e implantes de fibra óptica conectando o cabo de patch/fibra óptica a uma fonte de luz laser apropriada (saída de 473 nm, 1 mW) e medindo a saída com um sensor de luz. Uma fibra construída com sucesso emitirá um círculo concêntrico de luz e não terá mais de 30% de perda de luz.

2. Cateterismo Intravenoso de Roedores, Entrega de Vírus e Implantação de Fibra Óptica

1. Prepare o animal para a cirurgia.
   1. Anestesiar totalmente ratos com anestésico de escolha com base em diretrizes institucionais. Uma opção é o cloridrato de cetamina (87,5-100 mg/kg, i.m.) e o cloridrato de xilazina (5 mg/kg, i.m.). Certifique-se de que o rato esteja totalmente anestesiado, verificando a falta de um reflexo de beliscar o dedo do pé.
      CUIDADO: A cetamina é uma substância controlada que deve ser manuseada de acordo com as diretrizes institucionais.
      NOTA: A injeção intramuscular de anestésicos é utilizada neste estudo, pois produziu uma indução anestésica mais rápida e confiável do que a injeção intraperitoneal. Monitore continuamente a respiração e a capacidade de resposta do rato e forneça suporte térmico durante toda a cirurgia.
   2. Raspe uma grande área das costas do rato (parte superior das costas logo acima das omoplatas até o meio das costas), bem como a área do pescoço abaixo do membro anterior direito e do couro cabeludo.
   3. Coloque o rato na área cirúrgica e aplique puralube (lágrimas artificiais) nos olhos. Injete um volume de peso corporal de carprofeno (analgésico) por via subcutânea (s.c.) através da pele da parte superior das costas e, em seguida, injete 5 mL de solução de Lactated Ringer s.c. através da pele da parte inferior das costas.
   4. Higienize todos os locais cirúrgicos molhando um pedaço de gaze estéril com betadine e limpando-o pela área cirúrgica raspada usando um movimento circular. Em seguida, repita o processo com etanol a 70%. Repita este ciclo alternado três vezes.
2. Realizar o implante de cateter intravenoso de acordo com protocolos previamente publicados ^4,10.
   NOTA: Uma cortina cirúrgica não é usada durante esta cirurgia para evitar irritação durante o implante do cateter. Esterilize todos os instrumentos e equipamentos antes de usar. Use luvas estéreis e troque as luvas se qualquer superfície não estéril for contatada.
3. Imediatamente após as implantações do cateter, prenda o rato em uma estrutura estereotáxica para realizar injeções de AAV.
   1. Administrar uma injeção subcutânea (s.c) de lidocaína a 2% (0,2-0,3 mL) no couro cabeludo como anestésico local.
      NOTA: O anestésico local não é utilizado durante o implante do cateter intravenoso para evitar alterações nos resultados cirúrgicos.
   2. Conecte uma cânula de injeção de aço inoxidável de calibre 26 a uma seringa Hamilton cheia com 1 μL de solução concentrada de AAV: AAV5-hSyn-tdTomato ou AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      NOTA: oChIEF é uma variante da canalrodopsina opsina sensível à luz azul (ChR2), que pode responder a uma ampla gama de frequências ^8,11 e, portanto, tem utilidade para os experimentos LTD de baixa frequência discutidos neste protocolo, mas também para experimentos LTP de alta frequência (não discutidos aqui). A construção do oChIEF foi doada pelo Dr. Roger Tsien e processada para embalagem e purificação pelo Duke Viral Vector Core. Pelo menos 3-4 semanas são necessárias entre o dia da injeção e o dia da indução de LTD para permitir a expressão ideal do vírus nos terminais axônicos MGN.
      CUIDADO: Geralmente, o AAV é considerado um organismo de nível 1 de biossegurança (BSL-1), com baixo risco de autoinfecção, a menos que um vírus auxiliar seja usado em sua produção. Seu uso requer a aprovação da IACUC e os EPIs adequados devem ser usados em todos os momentos, de acordo com as diretrizes institucionais, para limitar a exposição desnecessária.
   3. Usando um bisturi, faça uma incisão de 0,5 mm da frente para a parte traseira do crânio e remova o tecido sobrejacente para expor a superfície do crânio.
   4. Nivelar a cabeça do rato no eixo anterior/posterior e zero coordenadas estereotáxicas para o bregma.
   5. Faça três pequenos furos através do crânio usando uma ferramenta Dremel equipada com uma pequena broca. Use chave de fenda para montar firmemente parafusos de aço inoxidável (M2x4 965-A2) no lugar.
      NOTA: Os parafusos são necessários para a ligação adequada do cimento dentário e a criação de tampas de cabeça resistentes e duradouras. A posição dos parafusos deve ser espalhada pelo eixo anteroposterior do crânio e longe do local de injeção de AAV.
   6. Fazer furos bilaterais para injeção de AAV com base nas coordenadas do Atlas do Cérebro de Rato (Watson e Paxinos)¹² para a porção medial do núcleo geniculado medial (MGN); em mm do bregma, AP: -5,4; ML: ±3,0; DV: -6.6. Reduzir lentamente as cânulas de injeção (4 mm/min) até ficar posicionado no MGN. Injetar solução concentrada de AAV a uma taxa de 0,1 μL/min.
   7. Deixe a cânula de injeção no lugar por 5 minutos após as infusões estarem completas para permitir a difusão para longe da cânula e, em seguida, retire lentamente a cânula do cérebro.
4. Imediatamente após as injeções de vírus, continue a implantar fibras ópticas ^4,9 visando os terminais MGN-LA.
   1. Use uma ferramenta Dremel para perfurar furos bilaterais para implantes de fibra óptica visando a amígdala lateral (em mm de bregma, AP: -3,0; ML ±5.1).
   2. Use fórceps para pegar a ponteira do implante de fibra óptica e fixá-la aos adaptadores estereotáxicos para que eles sejam mantidos firmemente no lugar.
   3. Abaixe lentamente as fibras a uma taxa de 2 mm/min, até que a ponta da fibra fique na porção dorsal do AE (DV: -7,9 mm).
   4. Prenda as esferrules ao crânio usando primeiro uma fina camada de adesivo instantâneo Loctite seguida de cimento dental e marrulas de cobertura com mangas de ferrule de 1,25 mm de diâmetro e capas de poeira.
      NOTA: A escolha do adesivo para fixar as esferrules ao crânio deve ser aprovada pelo comitê local ou institucional de cuidados e uso de animais. A loctita é usada para este estudo para fixar de forma confiável as ferragens ao crânio após tentativa e erro com múltiplos adesivos; no entanto, alternativas disponíveis podem ser consideradas.
5. Após os procedimentos cirúrgicos, abrigar ratos individualmente e fornecer acesso gratuito a alimentos e água. Prestar cuidados pós-operatórios consistentes com as diretrizes institucionais. Lavar cateteres diariamente com solução salina contendo gentamicina (5 mg/mL) e heparina (30 USP/mL) para manter a permeabilidade. Pelo menos 5 dias após a cirurgia e 24 horas antes do início dos experimentos comportamentais, a comida restringe os ratos a ~ 90% de seu peso de alimentação livre.

3. Autoadministração de cocaína de roedores e extinção de alavancas instrumentais

NOTA: Todos os procedimentos comportamentais são conduzidos em câmaras de condicionamento operante padrão, equipadas com duas alavancas retráteis em uma parede, uma luz de estímulo acima de cada alavanca, um gerador de tons, uma luz de casa e uma bomba de infusão.

1. Submeter ratos a sessões diárias de treinamento de autoadministração de cocaína de 1 h (2 mg/mL) sob um esquema de reforço FR1.
   1. Coloque os ratos na câmara operante todos os dias e permita que os ratos lever pressionem. Uma pressão na designada "alavanca ativa" (contrabalançada entre as alavancas esquerda e direita) resulta em uma infusão de cocaína (1,0 mg/kg/infusão) e uma apresentação de 10 s de uma sugestão composta de luz e tom. Uma pressão na designada "alavanca inativa" não tem efeitos programados.
   2. Continue os experimentos de autoadministração por pelo menos 10 d e até que os ratos ganhem com sucesso pelo menos 8 infusões/dia durante 3 dias consecutivos. O não cumprimento dos critérios de aquisição até o dia 20 resulta na exclusão do estudo.
2. Após o cumprimento bem-sucedido dos critérios de aquisição, os ratos são submetidos a sessões de extinção instrumental de 1 h por 6-10 d.
   1. Coloque os ratos em câmaras operantes e permita que os ratos lever livremente pressionem. No entanto, as respostas nas alavancas ativas e inativas não têm consequências programadas.
   2. Fazer com que os ratos continuem a extinção instrumental diariamente até que ocorra uma média de < 25 pressões de alavanca durante dois dias consecutivos.

4. Indução Optogenética In vivo de LTD

NOTA: Experimentos de inibição optogenética ocorrem 24 h após o último dia de extinção instrumental.

1. Conecte os cabos de remendo a um diodo laser azul de 473 nm através de uma junta rotativa suspensa acima de uma gaiola de alojamento de roedores limpa e padrão com a tampa removida. Essa configuração permite que os roedores se movam livremente pela gaiola durante a estimulação optogenética.
2. Ligue o diodo laser de acordo com as instruções de operação e conecte-se a um gerador de pulsos. Ajuste as configurações, de modo que, quando ligado, o rato receba 900 pulsos de luz de 2 ms a 1 Hz.
   CUIDADO: A proteção ocular adequada deve ser usada em todos os momentos durante a operação do laser.
3. Meça a intensidade da luz através do patch cord usando um sensor de luz. Ajuste a intensidade do laser para que a saída de luz através do cabo de remendo seja de ~ 5-7 mW.
4. Coloque os ratos em uma gaiola de alojamento limpa. Remova as tampas de poeira e as mangas de ferrule, expondo as ferrules. Conecte os cabos de remendo bilateralmente aos implantes de fibra óptica. Permita que os ratos explorem o ambiente por 3 minutos antes da indução do LTD.
5. Ligue o gerador de pulsos para iniciar a estimulação optogenética.
   NOTA: Embora improvável, se o rato apresentar quaisquer reações adversas à estimulação, o experimento é imediatamente encerrado e os ratos são devidamente sacrificados com base em diretrizes institucionais.
6. Após a indução de LTD, mantenha os ratos na gaiola por 3 minutos e, em seguida, coloque de volta em suas gaiolas domésticas.
7. Para experimentos de controle, use o mesmo procedimento de estimulação em ratos que expressam o vírus de controle AAV5-tdTomato. Para experimentos simulados, prenda um cordão de remendo à fibra óptica de ratos que expressam o vírus AAV5-oChIEF, mas nenhuma estimulação é entregue durante uma sessão de 15 minutos.

5. Teste o efeito da estimulação optogenética na busca de cocaína induzida por pistas

1. 24 h após as estimulações optogenéticas in vivo, coloque os ratos de volta em câmaras de condicionamento operantes. Os ratos são submetidos a uma sessão de reintegração induzida por sinalização padrão de 1 hora para avaliar o comportamento de busca de cocaína.
   NOTA: Durante a reintegração induzida por sinalização, uma resposta na alavanca ativa produz uma apresentação de 10 s da sugestão associada à cocaína, mas nenhuma infusão de cocaína.
2. Dê um segundo teste de reintegração pelo menos 1 semana após o primeiro teste para determinar se a indução optogenética de LTD resulta em uma supressão a longo prazo da busca de cocaína

6. Coloração, Fluorescência e Imagem para Verificação Histológica da Expressão Viral e Colocação de Fibra Óptica

1. Faça 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 4% de paraformaldeído (PFA). Armazene ambas as soluções no gelo. O volume total dependerá do número de ratos no estudo (~100 mL de PBS e 200 mL de PFA serão usados por rato).
   CUIDADO: O PFA é um produto químico tóxico e carcinógeno conhecido. Tome os devidos cuidados para evitar a inalação, bem como o contato com a pele. Seu uso e descarte devem estar de acordo com as diretrizes institucionais, incluindo o uso de EPIs adequados e um exaustor de fluxo químico.
2. Configure a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 20 mL/min. Tubo de enchimento da bomba com 1x PBS. Fixe uma agulha embotada de calibre 20 na extremidade da tubulação.
3. Anestesiar profundamente ratos com pentobarbital sódico (100 mg/kg, i.p.). Confirme a profundidade da anestesia por falta de resposta à pinça do dedo do pé antes de prosseguir.
   NOTA: O pentobarbital sódico é usado, uma vez que a perfusão é um procedimento terminal.
4. Use uma tesoura cirúrgica para abrir a cavidade abdominal do rato abaixo do diafragma. Corte a caixa torácica rostralmente ao longo das bordas laterais para expor o coração do rato. Use hemostat para prender a porção rostral da caixa torácica longe do coração. Corte qualquer tecido adiposo sobrejacente que envolva o coração.
5. Insira a agulha embotada através do ventrículo esquerdo e até a aorta. Corte um pequeno orifício no átrio direito para drenar a solução à medida que ela retorna ao coração.
6. Perfundir cada rato com 1x PBS por 5 min seguido de 4% de PFA, pH 7,4 por 10 min.
7. Decapitar o rato, extrair o cérebro e pós-fixá-lo em 4% de PFA por 24 h. Em seguida, transfira o cérebro para a solução de sacarose a 30% para 2-3 d.
8. Cérebros de seção a 50 μm usando um criostato.
9. Monte todas as fatias que contenham o LA ou MGN em lâminas de vidro e tampa.
10. Fatias de imagem utilizando microscópio epifluorescente para verificar a expressão de AAV-oChIEF-tdTomate no MGN e suas projeções para o LA, bem como a colocação da fibra óptica acima do LA.

7. Perfusão e Preparação de Fatias Cerebrais Agudas para Experimentos de Eletrofisiologia

NOTA: Experimentos eletrofisiológicos são realizados em um subconjunto de animais para validar o sucesso do LTD in vivo.

1. Preparar soluções eletrofisiológicas utilizando os reagentes listados nas Tabelas 1-3 ^4,13. Ajustar o pH de todas as soluções para 7,4 com HCl e ajustar a osmolaridade para 300-310 mOsm/kg H₂O. Tornar as soluções frescas antes das experiências e conservar a 4 °C até 1 semana. Sature todas as soluções com carbogênio (95% O 2/5% CO₂) em todos os momentos durante o uso.
2. Usando isoflurano de acordo com as diretrizes locais ou institucionais de cuidados com animais e uso, anestesiar profundamente o rato em uma câmara de eutanásia fechada.  Confirme se o animal está totalmente anestesiado através do reflexo da beliscão do dedo do pé.
3. Encha um copo pequeno com 50 mL de solução de corte a frio. Encher a tubulação da bomba peristáltica com solução e ajustar a vazão para 20 mL/min. Fixe uma agulha embotada de calibre 20 na extremidade da tubulação.
4. Abra a cavidade abdominal (ver passos 6.4 e 6.5) e perfunda brevemente o rato com solução de corte (máximo de 1-2 min).
5. Após a perfusão, decapitar imediatamente o rato. Remova o cérebro e coloque-o em um pequeno copo cheio de solução de corte de 4 °C por 30 s-1 min.
6. Transfira cérebros com uma espátula e fixe-os rapidamente na câmara de um vibratome. Remova a pia, usando pinça fina. Encher a câmara com uma solução de corte a 4 °C e preparar fatias coronais agudas (250 μm de espessura) da amígdala a uma velocidade de 0,37 mm/seg e uma frequência de 70 Hz.
7. À medida que as fatias são obtidas, colocar cada uma delas numa câmara de retenção cheia de solução de corte e incubar a 37 °C durante 10-12 min. Cerca de 5-7 fatias contendo o LA podem ser obtidas por animal.
8. Transfira as fatias para um copo de solução de retenção à temperatura ambiente (RT) e deixe recuperar por >30 minutos antes da experimentação.
   NOTA: As fatias geralmente permanecem saudáveis enquanto mantidas em solução de retenção por 4-6 h. Devido à natureza fluorescente do AAV, as fatias são mantidas em condições de pouca luz.

8. Gravações Eletrofisiológicas Ex vivo

1. Preparar soluções intracelulares utilizando os reagentes listados nas Tabelas 4-5.
   NOTA: As soluções intracelulares devem ser feitas antes dos experimentos e podem ser armazenadas a longo prazo (3-12 meses) a -80 °C ou a curto prazo (1-2 meses) a -20 °C. As soluções são ajustadas ao pH para 7,3 (com CsOH para solução intracelular à base de Cs e com KOH para solução intracelular à base de K). Ajustar para uma osmolaridade final de 290-300 mOsm/kg H₂O.
2. Preparar solução de reserva de picrotoxina 500 mM dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO).
   NOTA: As existências de picrotoxinas são alicotadas e armazenadas a -20 °C. No dia de utilização, as alíquotas são descongeladas e adicionadas à solução de registo até uma concentração final de 100 μM.
   CUIDADO: Picrotoxina é um antagonista não competitivo dos receptores GABA_A , de modo que a infusão de picrotoxina tem um efeito estimulante. É severamente tóxico por ingestão oral ou absorção da pele. O EPI adequado deve ser usado em todos os momentos ao trabalhar com picrotoxina.
3. Transfira fatias para um microscópio vertical projetado para experimentos de eletrofisiologia.
4. Durante os experimentos, o banho perfunde continuamente fatias com solução de gravação que é aquecida a 31-33 °C.
5. Amplie o LA usando um objetivo de 4x. Identifique os neurônios principais por morfologia com uma lente de imersão em água 40x.
6. Use uma pipeta de vidro (3-5 MΩ) preenchida com uma solução intracelular baseada em Cs (para experimentos de pinça de tensão) ou uma solução intracelular baseada em K (para experimentos de pinça de corrente) para obter registros de grampo de célula inteira.
7. Identifique projeções axonais MGN infectadas por AAV sob fluorescência (usando um filtro RFP). Estimule projeções usando um laser DPSS de luz azul (473 nm) conectado a um gerador de pulsos.
   CUIDADO: Para limitar a exposição ao laser, a luz laser colimada é acoplada a uma porta fluorescente no microscópio e focada na fatia através da objetiva.
   NOTA: No modo de pinça de tensão, as correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSCs) são evocadas opticamente a 0,1 Hz. Os neurônios que recebem entradas de neurônios MGN infectados por AAV exibirão EPSCs confiáveis.
8. Para induzir LTD ex vivo , no modo de fixação atual, registre uma linha de base estável de potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSPs) por pelo menos 10 min. Em seguida, forneça 900 pulsos de 2 ms de luz de 473 nm a uma frequência de 1 Hz (tempo total = 15 min). Em seguida, grave continuamente EPSPs a 0,1 Hz por ≥60 min.

Resultados

Uma linha do tempo descrevendo a ordem dos experimentos é mostrada na Figura 1. Ao longo de experimentos comportamentais, o número de infusões de cocaína, bem como o número de respostas feitas na alavanca ativa, servem como uma medida da intensidade do comportamento de busca de cocaína. Durante os primeiros dias de autoadministração de cocaína, o número de respostas ativas deve aumentar gradualmente em cada dia de aquisição, antes de se estabilizar durante a segunda semana. Por o...

Discussão

Como descrito acima, existem várias etapas críticas que são importantes para alcançar os resultados experimentais adequados. O protocolo provavelmente só será eficaz em animais que adquirem adequadamente a autoadministração de cocaína e, até o momento, ele só foi testado usando os parâmetros descritos acima. É possível que a dose de cocaína, o esquema de reforço e os parâmetros de sinalização possam ser modificados com provavelmente pouco efeito sobre os resultados comportamentais, com a exceção de q...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP Magnesium Salt	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calcium chloride	Fisher Scientific	C1016
Cesium chloride	Fisher Scientific	289329
Cesium hydroxide	Fisher Scientific	516988
Cesium methanesulfonate	Fisher Scientific	C1426
Cocaine HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemistry Stockroom	200C5000
Ferrule Dust Caps	Thor Labs	CAPL	White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic	Thor Labs	FP200URT	200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint	Prizmatix	(Ordered from Amazon)	18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodium Salt	Fisher Scientific	G8877
Hamilton syringe	Hamilton	80085	10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
Ketamine HCl	Henry Schein	55853	Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s	Henry Schein	9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione	Fisher Scientific	G4251
Lidocaine	Butler Schein	14583
Light Sensor	Thor Labs	PM100D	Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive	Grainger	5E207
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump	Harvard Apparatus	70-4501	Dual syringe
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microscope for electrophysiology
Microscope	Olympus	BX61VS	Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet dental cement, liquid	Lang Dental	1504BLK	black
Orthojet dental cement, powder	Lang Dental	1530BLK	Contemporary powder, black
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch Cables	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polishing Disc	Thor Labs	D50FC
Polishing Pad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polishing Paper	Thor Labs	LFG5P	5 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG3P	3 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG1P	1 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm grit
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	P5958
Potassium methanesulfonate	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1064980500
Sodium L-Ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Sodium Pentobarbital	Henry Schein	24352
Sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphocreatine	Fisher Scientific	P7936
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Stainless steel machine screws	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Tissue Adhesive	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198