Usando a optogenética para reverter a neuroplasticidade e inibir a busca de cocaína em ratos

Resumo

Os métodos aqui descritos descrevem um procedimento usado para reverter optogeneticamente a plasticidade induzida pela cocaína em um circuito comportamentalmente relevante em ratos. A estimulação óptica sustentada de baixa frequência das sinapses tálamo-amígdala induz depressão a longo prazo (LTD). A LTD induzida optogeneticamente in vivo em ratos com experiência em cocaína resultou na subsequente atenuação da procura de droga motivada por pistas.

Resumo

Este protocolo demonstra os passos necessários para o uso de ferramentas optogenéticas para reverter a plasticidade induzida pela cocaína nos circuitos tálamo-amígdala para reduzir os comportamentos subsequentes de busca de cocaína no rato. Em nossa pesquisa, descobrimos que, quando os ratos autoadministram cocaína intravenosa emparelhada com uma sugestão audiovisual, as sinapses formadas nas entradas do núcleo geniculado medial do tálamo (MGN) nos neurônios principais da amígdala lateral (LA) tornam-se mais fortes à medida que a associação cue-cocaína é aprendida. Levantamos a hipótese de que a reversão da plasticidade induzida pela cocaína nessas sinapses reduziria o comportamento de busca de cocaína motivado por pistas. Para realizar esse tipo de neuromodulação in vivo, queríamos induzir depressão sináptica de longo prazo (LTD), que diminui a força das sinapses MGN-LA. Para tanto, utilizou-se a optogenética, que permite a neuromodulação dos circuitos cerebrais utilizando a luz. A opsina excitatória oChiEF foi expressa em terminais MGN pré-sinápticos no AL por infusão de um AAV contendo oChiEF no MGN. Fibras ópticas foram então implantadas no AL e a luz laser de 473 nm foi pulsada na frequência de 1 Hz por 15 minutos para induzir LTD e reverter a plasticidade induzida pela cocaína. Essa manipulação produz uma redução duradoura na capacidade das pistas associadas à cocaína de induzir ações de busca de drogas.

Introdução

O abuso de substâncias é um problema de saúde pública muito sério nos EUA e no mundo. Apesar de décadas de intensa pesquisa, existem pouquíssimas opções terapêuticas efetivas ^1,2. Um grande revés para o tratamento é o fato de que o uso crônico de drogas gera memórias associativas de longo prazo entre pistas ambientais e a própria droga. A reexposição a pistas relacionadas a drogas impulsiona respostas fisiológicas e comportamentais que motivam o uso contínuo de drogas e a recaída³. Uma nova estratégia terapêutica é promulgar tratamentos baseados na memória que visam manipular os circuit....

Protocolo

Os experimentos descritos neste protocolo foram consistentes com as diretrizes estabelecidas pelo National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Todos os procedimentos foram realizados com ratos Sprague-Dawley adultos e ingênuos que pesavam 275-325 g na chegada.

1. Construção de implantes de fibra óptica e cabos de remendo

1. Preparar implantes de fibra óptica seguindo protocolos previamente publicados⁹. Os experimentos descritos neste protocolo utili....

Resultados

Uma linha do tempo descrevendo a ordem dos experimentos é mostrada na Figura 1. Ao longo de experimentos comportamentais, o número de infusões de cocaína, bem como o número de respostas feitas na alavanca ativa, servem como uma medida da intensidade do comportamento de busca de cocaína. Durante os primeiros dias de autoadministração de cocaína, o número de respostas ativas deve aumentar gradualmente em cada dia de aquisição, antes de se estabilizar durante a segunda semana. Por o.......

Discussão

Como descrito acima, existem várias etapas críticas que são importantes para alcançar os resultados experimentais adequados. O protocolo provavelmente só será eficaz em animais que adquirem adequadamente a autoadministração de cocaína e, até o momento, ele só foi testado usando os parâmetros descritos acima. É possível que a dose de cocaína, o esquema de reforço e os parâmetros de sinalização possam ser modificados com provavelmente pouco efeito sobre os resultados comportamentais, com a exceção de q.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP Magnesium Salt	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calcium chloride	Fisher Scientific	C1016
Cesium chloride	Fisher Scientific	289329
Cesium hydroxide	Fisher Scientific	516988
Cesium methanesulfonate	Fisher Scientific	C1426
Cocaine HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemistry Stockroom	200C5000
Ferrule Dust Caps	Thor Labs	CAPL	White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic	Thor Labs	FP200URT	200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint	Prizmatix	(Ordered from Amazon)	18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodium Salt	Fisher Scientific	G8877
Hamilton syringe	Hamilton	80085	10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
Ketamine HCl	Henry Schein	55853	Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s	Henry Schein	9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione	Fisher Scientific	G4251
Lidocaine	Butler Schein	14583
Light Sensor	Thor Labs	PM100D	Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive	Grainger	5E207
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump	Harvard Apparatus	70-4501	Dual syringe
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microscope for electrophysiology
Microscope	Olympus	BX61VS	Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet dental cement, liquid	Lang Dental	1504BLK	black
Orthojet dental cement, powder	Lang Dental	1530BLK	Contemporary powder, black
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch Cables	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polishing Disc	Thor Labs	D50FC
Polishing Pad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polishing Paper	Thor Labs	LFG5P	5 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG3P	3 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG1P	1 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm grit
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	P5958
Potassium methanesulfonate	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1064980500
Sodium L-Ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Sodium Pentobarbital	Henry Schein	24352
Sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphocreatine	Fisher Scientific	P7936
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Stainless steel machine screws	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Tissue Adhesive	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198