Использование оптогенетики для обращения вспять нейропластичности и ингибирования поиска кокаина у крыс

Резюме

Методы, описанные здесь, описывают процедуру, используемую для оптогенетического обращения вспять пластичности, вызванной кокаином, в поведенчески значимой цепи у крыс. Устойчивая низкочастотная оптическая стимуляция таламо-миндалиновых синапсов вызывает длительную депрессию (ЛТД). In vivo оптогенетически индуцированная ЛТД у крыс, испытывающих кокаин, приводила к последующему ослаблению поиска наркотиков, мотивированных сигналами.

Аннотация

Этот протокол демонстрирует шаги, необходимые для использования оптогенетических инструментов для обращения вспять пластичности, вызванной кокаином, в таламо-миндалиновых цепях, чтобы уменьшить последующее поведение крысы в поисках кокаина. В нашем исследовании мы обнаружили, что, когда крысы самостоятельно вводят внутривенный кокаин в сочетании с аудиовизуальным сигналом, синапсы, образующиеся на входах из медиального геникулярного ядра таламуса (MGN) на основные нейроны боковой миндалины (LA), становятся сильнее по мере изучения ассоциации сигнал-кокаин. Мы предположили, что изменение пластичности, вызванной кокаином, в этих синапсах уменьшит поведение, мотивированное кокаином. Чтобы выполнить этот тип нейромодуляции in vivo, мы хотели вызвать синаптическую долгосрочную депрессию (LTD), которая снижает силу синапсов MGN-LA. С этой целью мы использовали оптогенетику, которая позволяет нейромодуляцию мозговых цепей с помощью света. Возбуждающий опсин oChiEF экспрессировался на пресинаптических терминалях MGN в LA путем введения AAV, содержащего oChiEF, в MGN. Затем оптические волокна были имплантированы в ЛОС-Анджелес, и лазерный свет 473 нм был импульсным с частотой 1 Гц в течение 15 минут, чтобы индуцировать LTD и обратную пластичность, вызванную кокаином. Эта манипуляция приводит к длительному снижению способности сигналов, связанных с кокаином, побуждать к действиям по поиску наркотиков.

Введение

Злоупотребление психоактивными веществами является очень серьезной проблемой общественного здравоохранения в США и во всем мире. Несмотря на десятилетия интенсивных исследований, существует очень мало эффективных терапевтических вариантов ^1,2. Основным препятствием для лечения является тот факт, что хроническое употребление наркотиков порождает долгосрочные ассоциативные воспоминания между сигналами окружающей среды и самим препаратом. Повторное воздействие сигналов, связанных с наркотиками, приводит к физиологическим и поведенческим реакциям, которые мотивируют продолжение употребления наркотиков и рецидив³. Новая терапевтическая стратегия заключается в принятии методов лечения, основанных на памяти, которые направлены на манипулирование схемами, участвующими в регулировании ассоциаций между наркотиками и сигналами. Недавно было замечено, что синапсы в боковой миндалине (LA), особенно те, которые возникают из медиального геникулярного ядра (MGN) таламуса, усиливаются повторным самоприменением кокаина, связанным с сигналом, и что это потенцирование может поддерживать поведение, ищущее кокаин ^4,5. Поэтому было высказано предположение о том, что вызванное сигналом восстановление может быть ослаблено путем обращения вспять пластичности в синапсах MGN-LA.

Способность точно нацеливаться на синаптическую пластичность конкретной мозговой цепи была серьезной проблемой для этой области. Традиционные фармакологические инструменты имели некоторый успех в снижении рецидивирующего поведения, но ограничены неспособностью манипулировать отдельными синапсами. Тем не менее, недавнее развитие оптогенетики in vivo предоставило инструменты, необходимые для преодоления этих ограничений и управления нейронными путями с временной и пространственной точностью ^6,7,8. Экспрессируя светочувствительные опсины в определенной мозговой цепи, лазерный свет затем может быть использован для активации или ингибирования цепи. Частотно-зависимая оптическая стимуляция может быть использована для специального манипулирования синаптической пластичностью цепи у ведущего себя животного.

В этой рукописи описывается процедура, предпринятая для манипулирования поведенчески значимой схемой MGN-LA с использованием оптогенетики in vivo . Во-первых, возбуждающий опсин oChIEF экспрессировался в MGN, а оптические волокна были двусторонне имплантированы в LA. Затем животных обучали самостоятельному введению кокаина в зависимости от сигнала, что потенцирует путь MGN-LA. Затем устойчивая низкочастотная стимуляция лазерным светом 473 нм была использована для получения специфической схемы LTD. Обращение вспять пластичности, вызванной употреблением кокаина, привело к длительному снижению способности сигналов вызывать действия, связанные с поведением в поисках наркотиков.

протокол

Эксперименты, описанные в этом протоколе, соответствовали руководящим принципам, изложенным в Руководстве Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных , и были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Питтсбурга. Все процедуры проводились с использованием взрослых, наивных крыс Sprague-Dawley, которые весили 275-325 г по прибытии.

1. Конструкция оптических волоконных имплантатов и патч-кабелей

1. Подготовьте имплантаты из оптического волокна в соответствии с ранее опубликованными протоколами⁹. В экспериментах, описанных в этом протоколе, использовались 200 мкм сердечника волокна (0,5 NA) и Ø1,25 мм Многомодовый керамический наконечник LC/PC, размер отверстия Ø230 мкм.
   1. Используйте инструмент Dremel, чтобы забить нижнюю треть наконечника (ближайшую к плоскому концу наконечника). Оценка наконечников помогает им оставаться прикрепленными к зубному цементу, увеличивая вероятность того, что они останутся в безопасности на протяжении всей степени экспериментов.
   2. Используйте проволочные резаки, чтобы разрезать ~ 35 мм волокна. Используйте инструмент для зачистки волокон, чтобы удалить ~ 25 мм волокна, оставив 10 мм неэкспонированными.
   3. Приготовьте термоотверждаемую эпоксидную смолу в соответствии с инструкциями производителя. Растворить 1 г порошка смолы в 100 мг отвердителя. Прикрепите затупленную иглу 25-го калибра к шприцу объемом 1 мл. Наполните шприц эпоксидной смолой и прикрепите затупленный наконечник иглы 25-го калибра.
   4. Используйте тиски или зажимы, чтобы надежно удерживать наконечник плоской стороной вверх и выпуклой стороной вниз. С помощью шприца, заполненного эпоксидной смолой, добавьте одну каплю эпоксидной смолы на плоскую сторону наконечника, используя осторожность, чтобы протереть избыток эпоксидной смолы со стороны наконечника.
   5. Вставьте очищенную часть волокна через наконечник, что позволит обнажить дополнительные 5 мм очищенного волокна. В случае имплантатов LA волокно будет имплантировано 7,9 мм вентральной брегмы, поэтому открытая длина неперерезанного волокна должна составлять ~13 мм.
   6. Отвержьте эпоксидную смолу тепловой пушкой около 30-40 с, пока она не станет черной/янтарной по цвету.
   7. Оцените волокно непосредственно на границе выпуклого конца наконечника алмазным ножом и используйте палец, чтобы осторожно отстукнуть от волокна.
   8. Отполируйте выпуклый конец наконечника, держа гемостатом, обязательно применяя равномерное давление, и делая по 20 круговых вращений каждый на серии полировальной бумаги (от высокосортной до низкосортной; 5, 3, 1, 0,3 мкм).
   9. Закрепите нерастрепанное волокно к столу с помощью ленты и забивайте очищенное волокно, оставляя дополнительные 2 мм за пределами вентральной координаты (для имплантатов LA конечная длина волокна составляет ~ 10 мм). Используйте гемостат, чтобы потянуть за наконечник и равномерно разорвать волокно, где оно было забито. Будьте осторожны, чтобы не разрезать волокно полностью при забивании, иначе ядро волокна будет повреждено.
2. Создавайте патч-кабели, совместимые с оптическими волоконно-оптическими имплантатами. Были приобретены патч-кабели специально разработанного образца (см. Таблицу материалов). Альтернативно, патч-кабели могут быть построены в соответствии с ранее опубликованными протоколами⁹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр и NA феррумового волокна и волокна патч-кабеля должны совпадать на соединительном соединении, чтобы предотвратить избыточную потерю света, что может привести к неспособности в достаточной степени стимулировать нейронную активность.
3. Измерьте светоотдачу через патч-кабель и имплантаты оптического волокна, прикрепив патч-кабель / оптическое волокно к соответствующему лазерному источнику света (473 нм, выход 1 мВт) и измерив выход с помощью датчика освещенности. Успешно построенное волокно будет излучать концентрический круг света и иметь потери света не более 30%.

2. Внутривенная катетеризация грызунов, доставка вирусов и имплантация оптического волокна

1. Подготовьте животное к операции.
   1. Полностью обезболивать крыс анестетиком по выбору на основе институциональных руководящих принципов. Одним из вариантов является кетамина гидрохлорид (87,5-100 мг/кг, т.е.) и ксилазина гидрохлорид (5 мг/кг, т.е.). Убедитесь, что крыса полностью обезболена, проверив отсутствие рефлекса защемления пальца ноги.
      ВНИМАНИЕ: Кетамин является контролируемым веществом, которое должно обрабатываться в соответствии с институциональными руководящими принципами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании используется внутримышечная инъекция анестетиков, поскольку она производит более быструю и надежную индукцию анестезии, чем внутрибрюшинная инъекция. Постоянно контролируйте дыхание и реакцию крысы и обеспечивайте тепловую поддержку на протяжении всей операции.
   2. Побрейте большую область спины крысы (верхняя часть спины чуть выше лопаток до середины спины), а также область шеи под правой передней конечностью и кожу головы.
   3. Поместите крысу в хирургическую область и нанесите пуралубе (искусственные слезы) на глаза. Вводят объем карпрофена (анальгетика) с массой тела подкожно (s.c.) через кожу верхней части спины, затем вводят 5 мл раствора Лактированного Рингера s.c. через кожу нижней части спины.
   4. Продезинфицируйте все хирургические участки, смачивая кусок стерильной марли бетадином и протирая его по бритой хирургической области круговыми движениями. Затем повторите процесс с 70% этанолом. Повторите этот чередующийся цикл три раза.
2. Выполняют внутривенную имплантацию катетера по ранее опубликованным протоколам ^4,10.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическая драпировка не используется во время этой операции, чтобы избежать раздражения во время имплантации катетера. Стерилизуйте все инструменты и оборудование перед использованием. Используйте стерильные перчатки и меняйте перчатки при контакте с какой-либо нестерильной поверхностью.
3. Сразу после имплантации катетера закрепите крысу в стереотаксическом каркасе для выполнения инъекций AAV.
   1. Доставьте подкожную (s.c) инъекцию 2% лидокаина (0,2-0,3 мл) в кожу головы в качестве местного анестетика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Местный анестетик не используется во время внутривенной имплантации катетера, чтобы избежать изменений в результатах операции.
   2. Подключите инжекционную канюлю из нержавеющей стали 26-го калибра к шприцу Гамильтона, заполненному 1 мкл концентрированного раствора AAV: либо AAV5-hSyn-tdTomato, либо AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      ПРИМЕЧАНИЕ: oChIEF является вариантом чувствительного к синему свету опсинового канала родопсина (ChR2), который может реагировать на широкий диапазон частот ^8,11 и, следовательно, имеет полезность для низкочастотных экспериментов LTD, обсуждаемых в этом протоколе, а также для высокочастотных экспериментов LTP (не обсуждается здесь). Конструкция oChIEF была подарена доктором Роджером Циеном и обработана для упаковки и очистки Вирусным Векторным Ядром Дьюка. Между днем инъекции и днем индукции ЛТД необходимо не менее 3-4 недель, чтобы обеспечить оптимальную экспрессию вируса в терминалах аксонов MGN.
      ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Как правило, AAV рассматривается как организм уровня биобезопасности 1 (BSL-1) с низким риском самоинфекции, если в его производстве не используется вспомогательный вирус. Его использование требует одобрения IACUC, и надлежащие СИЗ должны использоваться в любое время в соответствии с институциональными руководящими принципами для ограничения ненужного воздействия.
   3. Используя скальпель, сделайте разрез 0,5 мм от передней до задней части черепа и удалите вышележащую ткань, чтобы обнажить поверхность черепа.
   4. Выровняйте голову крысы по передней/задней оси и ноль стереотаксических координат до брегмы.
   5. Просверлите три небольших отверстия через череп с помощью инструмента Dremel, оснащенного небольшим сверлом. Используйте отвертку для прочного крепления винтов из нержавеющей стали (M2x4 965-A2) на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Винты необходимы для правильного связывания зубного цемента и создания прочных, долговечных головных колпачков. Положение винтов должно быть распределено по передне-задней оси черепа и подальше от места инъекции ААВ.
   6. Просверлить двусторонние отверстия для инъекции AAV на основе координат из Атласа мозга крыс (Watson and Paxinos)¹² для медиальной части медиального геникулярного ядра (MGN); в мм от брегмы, АП: -5,4; ML: ±3.0; ДВ: -6.6. Медленно опускайте канюли для инъекций (4 мм/мин) до тех пор, пока они не будут помещены в MGN. Вводить концентрированный раствор AAV со скоростью 0,1 мкл/мин.
   7. Оставьте инъекционную канюлю на месте в течение 5 минут после того, как инфузии будут завершены, чтобы обеспечить диффузию от канюли, а затем медленно вывести канюлю из мозга.
4. Сразу после инъекций вируса продолжают имплантировать оптические волокна ^4,9, нацеленные на терминалы MGN-LA.
   1. Используйте инструмент Dremel для сверления двусторонних отверстий для имплантатов оптического волокна, нацеленных на боковую миндалину (в мм от брегмы, AP: -3,0; ML ±5.1).
   2. Используйте щипцы, чтобы захватить наконечник имплантата оптического волокна и закрепить его на стереотаксических адаптерах, чтобы они надежно удерживались на месте.
   3. Медленно опускайте волокна со скоростью 2 мм/мин, пока кончик волокна не сядет в дорсальную часть LA (DV: -7,9 мм).
   4. Сначала прикрепите наконечники к черепу с помощью тонкого слоя мгновенного клея Loctite, а затем зубного цемента и покрывайте наконечники с рукавами наконечников диаметром 1,25 мм и пылезащитными крышками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор клея для крепления наконечников к черепу должен быть одобрен местным или институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Локтит используется для этого исследования, чтобы надежно закрепить наконечники к черепу после проб и ошибок с помощью нескольких клеев; однако можно рассмотреть имеющиеся альтернативы.
5. После хирургических процедур разводят крыс индивидуально и обеспечивают свободный доступ к пище и воде. Обеспечить послеоперационный уход в соответствии с институциональными руководящими принципами. Ежедневно промывайте катетеры физиологическим раствором, содержащим гентамицин (5 мг/мл) и гепарин (30 USP/мл) для поддержания проходимости. По крайней мере, за 5 дней после операции и за 24 часа до начала поведенческих экспериментов пища ограничивает крыс до ~ 90% от их веса при свободном кормлении.

3. Самостоятельное использование кокаина грызунами и инструментальное вымирание рычагов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все поведенческие процедуры проводятся в стандартных камерах оперантного кондиционирования, оснащенных двумя выдвижными рычагами на одной стенке, стимулирующим светом над каждым рычагом, тон-генератором, домашним светом и инфузионным насосом.

1. Подвергайте крыс ежедневным 1-часовым тренировкам по самостоятельному введению кокаина (2 мг/мл) в соответствии с графиком подкрепления FR1.
   1. Помещайте крыс в оперантную камеру каждый день и позволяйте крысам нажимать рычагом. Нажатие на обозначенный «активный рычаг» (уравновешиваемый через левый и правый рычаги) приводит к инфузии кокаина (1,0 мг / кг / инфузия) и 10-секундному представлению сложного светового и тонального сигнала. Нажатие на обозначенный «неактивный рычаг» не имеет запрограммированных эффектов.
   2. Продолжайте эксперименты по самостоятельному введению в течение не менее 10 дней и до тех пор, пока крысы успешно не заработают не менее 8 инфузий в день в течение 3 последовательных дней. Неспособность достичь критериев приобретения к 20-му дню приводит к исключению из исследования.
2. После того, как критерии приобретения успешно выполнены, подвергают крыс 1 ч инструментальным сеансам вымирания в течение 6-10 сут.
   1. Поместите крыс в оперантные камеры и позвольте крысам свободно нажимать рычагом. Однако реакция как на активном, так и на неактивном рычагах не имеет запрограммированных последствий.
   2. Пусть крысы продолжают инструментальное вымирание ежедневно, пока в среднем не произойдет < 25 рычажных нажатий в течение двух последовательных дней.

4. In vivo Оптогенетическая индукция ООО

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты по оптогенетическому ингибированию проводятся через 24 часа после последнего дня инструментального вымирания.

1. Подключите патч-корды к 473-нм синему лазерному диоду через поворотный шарнир, подвешенный над чистой стандартной клеткой для грызунов со снятой крышкой. Такая установка позволяет грызунам свободно передвигаться по клетке во время оптогенетической стимуляции.
2. Включите лазерный диод в соответствии с инструкциями по эксплуатации и подключите к генератору импульсов. Отрегулируйте настройки, чтобы при включении крыса получала 900 2-мс импульсов света на частоте 1 Гц.
   ВНИМАНИЕ: Надлежащая защита глаз должна использоваться в любое время при работе с лазером.
3. Измерьте интенсивность света через патч-корд с помощью датчика освещенности. Отрегулируйте интенсивность лазера так, чтобы светоотдача через патч-кабель составляла ~5-7 мВт.
4. Поместите крыс в чистую клетку. Снимите пылезащитные крышки и рукава наконечников, обнажив наконечники. Подключите патч-корды двусторонне к имплантатам из оптического волокна. Позвольте крысам исследовать окружающую среду в течение 3 минут до индукции LTD.
5. Включите генератор импульсов, чтобы инициировать оптогенетическую стимуляцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это маловероятно, если крыса испытывает какие-либо побочные реакции на стимуляцию, эксперимент немедленно прекращается, и крысы должным образом усыпляются на основе институциональных руководящих принципов.
6. После индукции LTD держите крыс в клетке в течение 3 минут, а затем поместите обратно в их домашние клетки.
7. Для контрольных экспериментов используйте ту же процедуру стимуляции на крысах, которые экспрессируют контрольный вирус AAV5-tdTomato. Для фиктивных экспериментов прикрепите патч-корд к оптическому волокну крыс, которые экспрессируют вирус AAV5-oChIEF, но в течение 15-минутного сеанса стимуляция не проводится.

5. Проверьте влияние оптогенетической стимуляции на поиск кокаина, вызванного сигналом

1. Через 24 ч после оптогенетической стимуляции in vivo поместите крыс обратно в камеры оперантного кондиционирования. Крыс подвергают 1-часовому стандартному сеансу восстановления, вызванному сигналом, для оценки поведения в поисках кокаина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время восстановления, вызванного сигналом, реакция на активный рычаг дает 10-секундное представление сигнала, связанного с кокаином, но без вливаний кокаина.
2. Дайте второй тест на восстановление по крайней мере через 1 неделю после первого теста, чтобы определить, приводит ли оптогенетическая индукция LTD к долгосрочному подавлению поиска кокаина.

6. Окрашивание, флуоресценция и визуализация для гистологической верификации вирусной экспрессии и размещения оптических волокон

1. Получите 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и 4% параформальдегида (PFA). Храните оба раствора на льду. Общий объем будет зависеть от количества крыс в исследовании (~ 100 мл PBS и 200 мл PFA будут использоваться на крысу).
   ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным химическим веществом и известным канцерогеном. Соблюдайте надлежащий уход, чтобы избежать вдыхания, а также контакта с кожей. Его использование и удаление должны осуществляться в соответствии с институциональными руководящими принципами, включая использование надлежащих СИЗ и химической вытяжки.
2. Установка перистальтического насоса со скоростью потока 20 мл/мин. Залить трубку насоса 1x PBS. Прикрепите затупленную иглу 20-го калибра к концу трубки.
3. Глубоко обезболивают крыс пентобарбиталом натрия (100 мг/кг, в т..). Подтвердите глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги, прежде чем идти дальше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пентобарбитал натрия используется, так как перфузия является терминальной процедурой.
4. Используйте хирургические ножницы, чтобы разрезать брюшную полость крысы ниже диафрагмы. Прорежьте грудную клетку рострально вдоль боковых краев, чтобы обнажить сердце крысы. Используйте гемостат, чтобы зажать ростральную часть грудной клетки от сердца. Отрежьте любую вышележащую жировую ткань, которая окружает сердце.
5. Введите притупленную иглу через левый желудочек и вверх в аорту. Вырежьте небольшое отверстие в правом предсердии, чтобы слить раствор, когда он вернется к сердцу.
6. Перфузируйте каждую крысу 1x PBS в течение 5 мин, а затем 4% PFA, pH 7,4 в течение 10 мин.
7. Обезглавить крысу, извлечь мозг и постфиксировать ее в 4% PFA в течение 24 ч. Затем переводят мозг на 30% раствор сахарозы в течение 2-3 сут.
8. Разделите мозг на 50 мкм с помощью криостата.
9. Установите все срезы, содержащие LA или MGN, на стеклянные слайды и крышки.
10. Срезы изображения с использованием эпифлуоресцентного микроскопа для проверки экспрессии AAV-oChIEF-tdTomato в MGN и ее проекций на LA, а также размещения оптического волокна над LA.

7. Перфузия и подготовка острого среза мозга к электрофизиологическим экспериментам

ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофизиологические эксперименты проводятся на подмножестве животных для подтверждения успеха in vivo LTD.

1. Готовят электрофизиологические растворы с использованием реагентов, перечисленных в таблицах 1-3 ^4,13. Отрегулируйте рН всех растворов до 7,4 с HCl и отрегулируйте осмолярность до 300-310 мОсм/кг_H2O. Перед экспериментами растворы делают свежими и хранят при 4 °C до 1 недели. Насыщение всех растворов карбогеном (95% O₂/5% CO₂) в любое время во время использования.
2. Используя изофлуран в соответствии с местными или институциональными рекомендациями по уходу за животными и их использованию, глубоко обезболивайте крысу в закрытой камере эвтаназии.  Подтвердите, что животное полностью обезболено с помощью рефлекса защемления пальцев ног.
3. Наполните небольшой стакан 50 мл ледяного режущего раствора. Наполните трубку перистальтического насоса раствором и отрегулируйте расход до 20 мл/мин. Прикрепите затупленную иглу 20-го калибра к концу трубки.
4. Вскройте брюшную полость (см. шаги 6.4 и 6.5) и кратковременно продуйте крысу режущим раствором (максимум 1-2 мин).
5. После перфузии немедленно обезглавить крысу. Выньте мозг и поместите его в небольшой стаканчик, наполненный режущим раствором при 4 °C, на 30 с-1 мин.
6. Перенесите мозги шпателем и быстро закрепите их в камере вибратома. Удалите пиа с помощью тонких щипцов. Заполните камеру режущим раствором при 4 °C и приготовьте острые корональные срезы (толщиной 250 мкм) миндалины со скоростью 0,37 мм/сек и частотой 70 Гц.
7. По мере получения ломтиков поместите каждый из них в камеру выдержки, заполненную режущим раствором, и инкубируйте при 37 °C в течение 10-12 мин. Около 5-7 ломтиков, содержащих LA, могут быть получены на одно животное.
8. Переложите срезы в стакан с раствором для хранения при комнатной температуре (RT) и дайте восстановиться в течение >30 мин до начала эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ломтики обычно остаются здоровыми, оставаясь в удержанном растворе в течение 4-6 ч. Из-за флуоресцентной природы AAV срезы хранятся в условиях низкой освещенности.

8. Электрофизиологические записи ex vivo

1. Готовят внутриклеточные растворы с помощью реагентов, перечисленных в таблицах 4-5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутриклеточные растворы должны быть сделаны до начала экспериментов и могут храниться длительно (3-12 месяцев) при -80 °C или кратковременные (1-2 месяца) при -20 °C. РН растворов скорректирован до 7,3 (с CsOH для внутриклеточного раствора на основе Cs и с KOH для внутриклеточного раствора на основе K). Отрегулируйте до конечной осмолярности 290-300 мОсм/кг H_2O.
2. Готовят 500 мМ раствора пикротоксина, растворенного в диметилсульфоксиде (ДМСО).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы пикротоксинов аликвотизируются и хранятся при -20 °C. В день применения аликвоты размораживают и добавляют в регистрирующий раствор до конечной концентрации 100 мкМ.
   ВНИМАНИЕ: Пикротоксин является неконкурентным антагонистом рецепторов ГАМК_А , поэтому инфузия пикротоксина оказывает стимулирующее действие. Он сильно токсичен при пероральном приеме внутрь или поглощении кожей. Правильные СИЗ должны использоваться в любое время при работе с пикротоксином.
3. Перенесите срезы в вертикальный микроскоп, предназначенный для электрофизиологических экспериментов.
4. Во время экспериментов непрерывно в ванне перфузируют срезы регистрирующим раствором, который нагревают до 31-33 °C.
5. Увеличьте LA с помощью 4-кратной цели. Идентифицируйте основные нейроны по морфологии с помощью 40-кратной линзы погружения в воду.
6. Используйте стеклянную пипетку (3-5 МОм), заполненную либо внутриклеточным раствором на основе Cs (для экспериментов с зажимом напряжения), либо внутриклеточным раствором на основе K (для экспериментов с текущим зажимом), чтобы получить записи зажимов цельноклеточных пластырей.
7. Идентификация AAV-инфицированных аксональных проекций MGN под флуоресценцией (с помощью фильтра RFP). Стимулируйте проекции с помощью синего света (473 нм) DPSS лазера, подключенного к генератору импульсов.
   ВНИМАНИЕ: Чтобы ограничить воздействие лазера, коллимированный лазерный свет соединен с флуоресцентным портом на микроскопе и сфокусирован на срезе через объектив.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В режиме зажима напряжения возбуждающие постсинаптические токи (EPSC) оптически вызваны при 0,1 Гц. Нейроны, принимающие входы от зараженных AAV нейронов MGN, будут демонстрировать надежные EPSC.
8. Чтобы индуцировать ex vivo LTD, в режиме текущего зажима, регистрируйте стабильную базовую линию возбуждающих постсинаптических потенциалов (EPSP) в течение не менее 10 минут. Далее подаем 900 2-мс импульсов 473-нм света на частоте 1 Гц (общее время = 15 мин). Затем непрерывно записывайте EPSP при частоте 0,1 Гц в течение ≥60 мин.

Результаты

Временная шкала, описывающая порядок экспериментов, показана на рисунке 1. Во время поведенческих экспериментов количество вливаний кокаина, а также количество реакций, сделанных на активном рычаге, служит мерой интенсивности поведения в поисках кокаина. В течение пер?...

Обсуждение

Как описано выше, существует несколько критических шагов, которые важны для достижения надлежащих экспериментальных результатов. Протокол, вероятно, будет эффективен только у животных, которые должным образом приобретают самостоятельное введение кокаина, и на сегодняшний день он был...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP Magnesium Salt	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calcium chloride	Fisher Scientific	C1016
Cesium chloride	Fisher Scientific	289329
Cesium hydroxide	Fisher Scientific	516988
Cesium methanesulfonate	Fisher Scientific	C1426
Cocaine HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemistry Stockroom	200C5000
Ferrule Dust Caps	Thor Labs	CAPL	White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic	Thor Labs	FP200URT	200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint	Prizmatix	(Ordered from Amazon)	18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodium Salt	Fisher Scientific	G8877
Hamilton syringe	Hamilton	80085	10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
Ketamine HCl	Henry Schein	55853	Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s	Henry Schein	9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione	Fisher Scientific	G4251
Lidocaine	Butler Schein	14583
Light Sensor	Thor Labs	PM100D	Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive	Grainger	5E207
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump	Harvard Apparatus	70-4501	Dual syringe
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microscope for electrophysiology
Microscope	Olympus	BX61VS	Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet dental cement, liquid	Lang Dental	1504BLK	black
Orthojet dental cement, powder	Lang Dental	1530BLK	Contemporary powder, black
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch Cables	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polishing Disc	Thor Labs	D50FC
Polishing Pad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polishing Paper	Thor Labs	LFG5P	5 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG3P	3 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG1P	1 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm grit
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	P5958
Potassium methanesulfonate	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1064980500
Sodium L-Ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Sodium Pentobarbital	Henry Schein	24352
Sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphocreatine	Fisher Scientific	P7936
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Stainless steel machine screws	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Tissue Adhesive	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198