الإصابات شبه الآلية التي يسببها الليزر لدراسة تجديد الحبل الشوكي في يرقات أسماك الزرد

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة للحث على إصابات خاصة بالأنسجة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة في يرقات أسماك الزرد باستخدام نظام آفة ليزر مقترن بمنصة ميكروفلويديك آلية للتعامل مع اليرقات.

Abstract

تمتلك يرقات الزرد جهازا عصبيا مركزيا يعمل بكامل طاقته (CNS) مع قدرة تجديدية عالية بعد أيام قليلة فقط من الإخصاب. هذا يجعل هذا النموذج الحيواني مفيدا جدا لدراسة إصابة الحبل الشوكي وتجديده. البروتوكول القياسي لتحفيز مثل هذه الآفات هو عبور الجزء الظهري من الجذع يدويا. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية تدريبا مكثفا وتلحق الضرر بأنسجة إضافية. تم تطوير بروتوكول للآفات الناجمة عن الليزر للتحايل على هذه القيود ، مما يسمح بقابلية عالية للتكاثر واكتمال انتقال الحبل الشوكي على العديد من الحيوانات وبين الجلسات المختلفة ، حتى بالنسبة لمشغل غير مدرب. علاوة على ذلك ، يقتصر تلف الأنسجة بشكل أساسي على الحبل الشوكي نفسه ، مما يقلل من الآثار المربكة الناجمة عن إصابة الأنسجة المختلفة ، على سبيل المثال ، الجلد والعضلات والجهاز العصبي المركزي. علاوة على ذلك ، من الممكن حدوث آفات نصف في الحبل الشوكي. إن تحسين الحفاظ على سلامة الأنسجة بعد إصابة الليزر يسهل إجراء المزيد من التشريحات اللازمة لإجراء تحليلات إضافية، مثل الفيزيولوجيا الكهربية. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة تحكما دقيقا في مدى الإصابة الذي لا يمكن تحقيقه يدويا. وهذا يسمح بنماذج تجريبية جديدة في هذا النموذج القوي في المستقبل.

Introduction

على النقيض من الثدييات، يمكن لسمك الزرد (دانيو ريريو) إصلاح الجهاز العصبي المركزي (CNS) بعد ^{الإصابة1}. استخدام يرقات الزرد كنموذج لتجديد الحبل الشوكي حديث نسبيا. وقد ثبت أنه من المفيد التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء ^{الإصلاح2}. ويرجع ذلك إلى سهولة التلاعب ، والدورة التجريبية القصيرة (يرقات جديدة كل أسبوع) ، والشفافية البصرية للأنسجة ، وصغر حجم اليرقات ، وهي مناسبة بشكل مثالي للفحص المجهري الفلوري في الجسم الحي .

في حالة تجديد الحبل الشوكي ، هناك ميزتان إضافيتان لاستخدام اليرقات هما سرعة الشفاء ، بضعة أيام مقارنة ببضعة أسابيع للبالغين ، وسهولة إحداث إصابات باستخدام التقنيات اليدوية. وقد استخدم هذا بنجاح في العديد من الدراسات3،⁴،⁵، بما في ذلك التحقيقات ^{الأخيرة6،7}. بشكل عام ، يؤدي هذا إلى زيادة إنتاج البيانات ذات المغزى ، والقدرة العالية على التكيف مع البروتوكولات التجريبية ، وانخفاض التكاليف التجريبية. كما أن استخدام اليرقات التي يقل عمرها عن 5 أيام بعد الإخصاب يقلل أيضا من استخدام الحيوانات التي تتبع مبادئ 3R في البحوث على ^{الحيوانات8}.

بعد إصابة الحبل الشوكي في يرقات الزرد ، تحدث العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك الاستجابة الالتهابية ، وانتشار الخلايا ، وتكوين الخلايا العصبية ، وهجرة الخلايا الباقية أو المتولدة حديثا ، وإصلاح المحاور الوظيفية ، وإعادة تشكيل عالمي لدوائر العمليات العصبية وأنسجة العمود ^{الفقري6}،^7،9،10 . ولكي يتم تنسيق هذه العمليات بنجاح، فإنها تنطوي على تفاعل منظم بدقة بين مجموعة من أنواع الخلايا، ومكونات المصفوفة خارج الخلية، والإشارات الكيميائية ^{الحيوية11،12}. إن الكشف عن تفاصيل إعادة التنظيم الكبيرة هذه لنسيج معقد مثل الحبل الشوكي يتطلب استخدام وتطوير مناهج تجريبية دقيقة وخاضعة للرقابة.

النموذج التجريبي الأساسي المستخدم لدراسة تجديد الحبل الشوكي في أسماك الزرد هو استخدام الوسائل الجراحية للحث على تلف الأنسجة عن طريق الاستئصال أو الطعن أو الإصابة بالتبريد3,13. ومن عيوب هذه النهج أنها تتطلب تدريبا محددا على مهارات الجراحة المجهرية، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا لأي مشغل جديد وقد يمنع استخدامها في مشاريع قصيرة الأجل. علاوة على ذلك ، فإنها عادة ما تحفز تلف الأنسجة المحيطة ، مما قد يؤثر على التجديد.

وهناك نهج آخر يتمثل في الحث على تلف الخلايا كيميائيا14 أو عن طريق التلاعب ^{الجيني15}. هذا الأخير يسمح بأضرار مستهدفة للغاية. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية عملا تحضيريا طويلا لتوليد أسماك معدلة وراثيا جديدة قبل إجراء أي تجربة ، يتم تجديدها في كل مرة يتم فيها استهداف نوع خلية فريد.

وبالتالي ، هناك حاجة إلى طريقة تسمح بالآفات المستهدفة ولكن متعددة الاستخدامات المناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات في التجديد. الحل هو استخدام الليزر للحث على تلف موضعي في الأنسجة ذات ^{الاهتمام16}،^{17،18،19،20}. في الواقع ، يمثل استخدام تلف الأنسجة الناجم عن الليزر نهجا قويا لتوليد آفات الحبل الشوكي مع العديد من المزايا. تسمح المجاهر المجهزة بوحدات معالجة الليزر هذه بتحديد منطقة مخصصة الشكل حيث سيحدث استئصال الخلايا ، مع فائدة إضافية تتمثل في التحكم الزمني. وبالتالي يمكن تكييف حجم وموضع الآفة لمعالجة أي أسئلة.

السمة المفقودة لمعظم أنظمة آفات الليزر هي إمكانية إحداث إصابات بطريقة قابلة للتكرار بشكل كبير لسلسلة من اليرقات. هنا يتم وصف بروتوكول أصلي باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية للحث على آفات دقيقة ومضبوطة شبه آلية في يرقات أسماك الزرد استنادا إلى منصة ميكروفلويديك مصممة للتعامل الآلي مع ^{اليرقات21}. علاوة على ذلك ، في النظام المعروض هنا ، يتم إدخال اليرقات في الشعيرات الدموية الزجاجية ، مما يسمح بالدوران الحر للحيوان حول محوره الوردي. يمكن للمستخدم اختيار أي جانب من اليرقة لتقديمه إلى الليزر مع السماح للتصوير الفلوري باستهداف شعاع الليزر بدقة وتقييم الضرر بعد الآفة.

يستخدم البروتوكول الموصوف هنا مع نظام تصوير يرقات الزرد شبه الآلي جنبا إلى جنب مع قرص دوار مجهز بليزر الأشعة فوق البنفسجية (المسمى فيما يلي باسم نظام VAST ). ومع ذلك ، فإن النقاط الرئيسية للبروتوكول ومعظم ادعاءات هذه التقنية صالحة لأي نظام مجهز بالليزر قادر على استئصال الخلايا ، بما في ذلك المجاهر الضوئية بالليزر ثنائي الفوتون ، أو المجاهر ذات القرص الدوار المزودة بليزر الأشعة فوق البنفسجية (وحدة FRAP) ، أو مجاهر الفيديو مع وحدة ليزر لمعالجة الصور. سيكون أحد الاختلافات الرئيسية بين نظام VAST ومعالجة العينات التقليدية هو أنه بالنسبة لهذا الأخير ، ستكون هناك حاجة إلى تركيب يرقات في أغاروز منخفض درجة الانصهار على أغطية زجاجية / أطباق بتري ذات قاع زجاجي بدلا من تحميلها في طبق من 96 بئرا.

الفوائد التي توفرها هذه الطريقة تفتح فرصا للبحث المبتكر حول الآليات الخلوية والجزيئية أثناء عملية التجديد. علاوة على ذلك ، تسمح جودة البيانات العالية بإجراء تحقيقات كمية في سياق متعدد التخصصات.

Protocol

تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات بموافقة من وزارة الداخلية البريطانية ووفقا لوائحها ، بموجب ترخيص المشروع PP8160052. تمت الموافقة على المشروع من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة إدنبرة. ولأغراض التحليل التجريبي، استخدمت يرقات أسماك الزرد التي يصل عمرها إلى 5 أيام من أي من الجنسين من الخطوط المعدلة وراثيا المتاحة التالية: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)، Tg(Xla.Tubb:DsRed)، Tg(betaactin:utrophin-mCherry)، Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)، وTg(mnx1:gfp) (انظر الملف التكميلي 1 فيما يتعلق بتوليد خطوط الزرد المعدلة وراثيا). ويبين الشكل 1 مخططا للبروتوكول باستخدام المنصة الآلية لمناولة يرقات أسماك الزرد. تتوفر جميع البرامج المخصصة والبرامج النصية والبروتوكولات التجريبية التفصيلية المستخدمة في هذا العمل على https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. إعداد العينات

1. في الساعة 5 بعد الإخصاب ، قم بفرز الأجنة لمرحلة النمو الصحيحة ²¹. تخلص من البيض الميت والأجنة ضعيفة النمو ومفرطة النمو.
2. في 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، قم بتخدير اليرقات عن طريق إضافة 2 مل من 0.4٪ من ميثيل ميثيل إستر حمض أمينوبنزويك - إيثيل - استر إلى 50 مل من مياه منشأة الأسماك في طبق بتري 90 ملم. استخدم الحيوانات التي تربى مع الفينيل ثيوريا (PTU) (انظر جدول المواد) لمنع تصبغ الجلد إذا كانت مشكلة ، وهذا ليس هو الحال بالنسبة لإصابات الحبل الشوكي على يرقات 3 dpf الموصوفة في هذا البروتوكول.
   ملاحظة: يستخدم هذا التركيز المخدر العالي نسبيا لمنع حركات اليرقات بعد تأثير الليزر.
3. فحص الأجنة بحثا عن تعبير مراسل الفلورسنت (الملف التكميلي 1).
   ملاحظة: غالبا ما يطلب من مراسل الفلورسنت للحبل الشوكي (أو أي هيكل آخر ذي أهمية) تقييم كفاءة الإصابة. يساعد استخدام tg(Xla.Tubb:DsRed) على تحديد الحبل الشوكي.
4. انقل اليرقات المختارة إلى صفيحة من 96 بئرا لاستخدامها في نظام VAST (انظر جدول المواد) مع 300 ميكرولتر من مياه منشأة الأسماك لكل بئر. استخدم الوسط الذي يحتوي على مخدر من طبق بتري 90 مم مباشرة. تأكد من وجود يرقة واحدة فقط لكل بئر. قم بإعداد طبق واحد فارغ إضافي من 96 بئرا لجمع اليرقات المصابة.
   ملاحظة: في حالة استخدام نظام آفة ليزر آخر ، قم بتركيب اليرقات في هلام الأغاروز منخفض الانصهار (LMP) بنسبة 1٪ في غرفة مراقبة مناسبة.

2. إعداد المجهر

1. قم بتشغيل جميع مكونات النظام (VAST ، المجهر ، الليزر ، الكمبيوتر الشخصي) ، بما في ذلك الليزر للاستئصال.
2. بمجرد تهيئة الأجهزة بالكامل ، قم بتشغيل برنامج المجهر ، ImageJ / Fiji ، وبيئة تطوير متكاملة (IDE) ، وبرنامج تصوير الزرد الآلي (VAST system) إذا كنت تستخدم هذه المنصة (انظر جدول المواد).
3. قم بإعداد برنامج VAST باتباع الخطوات أدناه.
   1. عند تشغيل برنامج VAST ، اختر Plate في النافذة الأولى وانقر فوق الزر تم (الشكل 2A). ستظهر نافذة صغيرة أخرى تسأل عما إذا كانت الشعيرات الدموية فارغة ونظيفة. تحقق من خلال النظر إلى صورة الشعيرات الدموية إذا كان هناك أي فقاعات هواء في الداخل. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فانقر فوق نعم. إذا كانت هناك أي فقاعات ، فانقر فوق لا واتبع الخطوة 2.3.2-2.3.3 (الشكل 2B).
   2. في نافذة أخذ عينات الجسيمات الكبيرة (LP) ، انقر فوق Prime لإزالة فقاعات الهواء (الشكل 2C).
   3. انتقل إلى نافذة البرنامج الرئيسية (مع الصورة الشعرية) وانقر بزر الماوس الأيمن على الصورة. حدد تسجيل صورة شعرية فارغة في القائمة المنبثقة (الشكل 2B).
   4. في نافذة LP Sampler ، انتقل إلى القائمة ملف وحدد الخيار فتح البرنامج النصي . اختر ملفا يحتوي على البرنامج النصي المقابل للتجربة المراد تنفيذها.
   5. في نافذة برنامج VAST الرئيسية، انتقل إلى ملف واختر فتح تجربة. اختر ملف التجربة المقابل للتجربة المخطط لها.
      ملاحظة: تأكد من عدم تحديد مربعات التفريغ التلقائي والإخراج المجمع للنفايات.
4. قم بإعداد برنامج المجهر للتصوير.
   1. قم بتشغيل برنامج التصوير المجهري (انظر جدول المواد) لتهيئة الأجهزة. قد يستغرق ذلك بضع دقائق ، اعتمادا على النظام.
   2. انتقل إلى إعدادات الاستحواذ وقم بإعداد المجهر لتصوير الفلوروفور المعبر عنه في اليرقات. استخدم هدف غمس الماء 10x NA 0.5 لضمان استطالة الحجم البؤري بما فيه الكفاية على طول المحور البصري لآفة عمق الحبل الشوكي بالكامل أو الأنسجة المستهدفة.
5. قم بإعداد ImageJ / Fiji لآفات الليزر.
   1. انتقل إلى القائمة ملف ، واختر جديد/برنامج نصي لفتح نافذة البرنامج النصي.
   2. في النافذة جديد ، انتقل إلى القائمة ملف واختر فتح لتحميل البرنامج النصي لآفة الليزر (Manual_MP_Operation.ijm).
6. قم بإعداد Python IDE.
   1. قم بتشغيل Python IDE.
   2. انتقل إلى القائمة ملف واختر فتح ملف لتحميل البرنامج النصي لإدارة الليزر (Watch_for_ROIs_py3.py).
   3. انتقل إلى القائمة تشغيل واختر تشغيل بدون تصحيح الأخطاء لتشغيل البرنامج النصي. تحقق للتأكد من ظهور سلسلة من الرسائل في لوحة TERMINAL مع بعض الضوضاء أثناء تهيئة مخفف الليزر (الشكل 2D).

3. أداء آفات الليزر على نظام VAST

1. قم بتوسيط الشعيرات الدموية بالنسبة لهدف المجهر عن طريق تحريك المرحلة بالنقر فوق أزرار الأسهم في النافذة الرئيسية لبرنامج VAST (الشكل 2B).
2. ركز على الجزء العلوي من الشعيرات الدموية من خلال النظر من خلال النظارات واستخدام الضوء المنقول من المجهر.
   تحذير: الشعيرات الدموية هشة للغاية وقد تنكسر إذا لمسها الهدف. حرك مقبض المجهر ببطء عند التركيز للداخل والخارج.
3. ضع لوحات 96 بئرا على حامل لوحة جهاز أخذ العينات LP لنظام VAST . ضع اللوحة التي تحتوي على يرقات على الحامل الأيسر واللوحة للجمع على اليمين. تأكد من توجيه الألواح بشكل صحيح: يجب أن يكون البئر A1 في الزاوية الأمامية اليسرى من الحامل.
4. في برنامج VAST ، في نافذة LP Sampler ، انقر فوق الزر Plate Template وحدد جميع الآبار التي تحتوي على يرقات. انقر فوق الزر موافق ( OK ) للتحقق من صحة النافذة وإغلاقها (الشكل 2C).
5. في نافذة LP Sampler ، انقر فوق الزر " تشغيل لوحة" لبدء تحميل يرقة.
   ملاحظة: بعد مرور بعض الوقت ، يجب أن تكون اليرقة مرئية في الشعيرات الدموية في موضعها (محددة مسبقا في ملف تعريف التجربة) ، مما يسمح بإصابة الحبل الشوكي. سيتم إيقاف تشغيل ضوء صينية VAST بعد بضع دورات لضبط اليرقة مع الجانب الجانبي الذي يواجه هدف المجهر.
6. انتقل إلى برنامج المجهر وانقر على زر Live لتصوير اليرقات.
7. أدر مقبض تركيز المجهر حتى تصبح القناة المركزية للحبل الشوكي مرئية.
   ملاحظة: قد يكون من الأسهل التركيز باستخدام الضوء المنقول أولا ، ثم تحسينه باستخدام التألق.
8. التقط لقطة في التألق واحفظ الصورة في مجلد مخصص.
9. افتح الصورة في ImageJ واضبط التباين إذا لزم الأمر (باستخدام قائمة Image/Adjust/Brightness/contrast... في ImageJ).
10. انقر على أداة خط منطقة الاهتمام (ROI ) وارسم خطا قصيرا (20 ميكرومتر) يتمحور حول الحبل الشوكي (الشكل 3A).
11. قم بتبديل المجهر إلى موضع المرآة العاكسة بنسبة 100٪.
12. قم بتحميل البرنامج النصي ImageJ وانقر فوق الزر تشغيل . استخدم المعلمات التالية: التكرار - 2 ؛ عينة - 1 ؛ العرض - 40 ميكرون ؛ التوهين - 89 (طاقة الليزر الكاملة) (الشكل 3C).
13. عند الانتهاء من تسلسل لقطات الليزر، قم بالتبديل إلى التصوير الفلوري على برنامج التصوير واضبط التركيز البؤري إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: غالبا ما يلاحظ تحول في التركيز بسبب إزاحة الذيل أثناء التعرض لليزر.
14. التقط لقطة جديدة واحفظها.
15. افتح هذه الصورة الجديدة في ImageJ وارسم خطا جديدا يجب أن يكون أكبر من الحبل الشوكي نفسه (~ 80 ميكرومتر) ، بدءا من أسفل الجانب البطني للحبل الشوكي في الجزء العلوي من notochord ويتجه نحو الجانب الظهري لينتهي في الفراغ بين الحبل الشوكي والجلد (الشكل 3B).
16. قم بتبديل المجهر إلى موضع المرآة العاكسة بنسبة 100٪.
17. انتقل إلى نافذة البرنامج النصي ImageJ وانقر فوق الزر تشغيل . استخدم المعلمات التالية: التكرار - 2 ؛ عينة - 1 ؛ العرض - 40 ميكرون ؛ التوهين - 89 (طاقة الليزر الكاملة).
18. بعد الانتهاء من تسلسل لقطات الليزر (الأطول)، تحقق من جودة النقل عن طريق التصوير الفلوري والتركيز. تأكد من عدم بقاء أي خلية أو محاور سليمة في موقع الآفة ، والتي يجب أن تظهر كمنطقة مظلمة أو كمنطقة فلورسنت باهتة ومتجانسة (الشكل 3D ، اللوحة السفلية).
19. اجمع اليرقات المصابة في صفيحة 96 بئرا فارغة (بنفس إحداثيات البئر مثل إحداثيات البئر الأصلية) عن طريق الانتقال إلى نافذة برنامج VAST الرئيسية والنقر على زر جمع .
20. أعد تشغيل مصباح نظام VAST بالنقر فوق خانة الاختيار Tray Light في أسفل يسار النافذة.
21. كرر الخطوة 3.3-3.17 لكل يرقة جديدة ستصاب.

4. التعامل مع ما بعد الآفة والتجارب الإضافية

1. أخرج اليرقات من طبق البئر 96 في أقرب وقت ممكن وانقلها إلى طبق بتري نظيف مع مياه منشأة الأسماك العذبة لليرقات للتعافي بعد الآفة. ضع طبق بتري في حاضنة عند 28 درجة مئوية.
   ملاحظة: غالبا ما يستمر الضرر في الانتشار في الساعة الأولى بعد الآفة. وبالتالي ينبغي تقييم المدى الفعلي للآفة عن طريق التصوير الفلوري بعد تأخير يبلغ حوالي 1 ساعة.

5. استكشاف الأخطاء وإصلاحها

1. إذا كانت فقاعات الهواء موجودة في الأنابيب والشعيرات الدموية لنظام VAST ، فانقر فوق الزر Prime في نافذة LP Sampler لإزالتها.
2. النظر في الآفات غير الناجحة (كما تم تقييمها من التألق المتبقي في موقع الآفة ، بصرف النظر عن الخلفية المتبقية والمتجانسة المتوقعة) ، والتي يمكن أن تكون بسبب عدة أسباب مذكورة أدناه.
   1. طاقة ليزر منخفضة: عندما يحدث هذا ، حاول الحصول على قيمة أعلى.
      ملاحظة: تم تجهيز نظام VAST بليزر صبغة. هذا يعني أن تركيز محلول الصبغة المستخدم لتوليد ضوء الليزر يمكن أن يتغير مع مرور الوقت ، مما يؤدي إلى انخفاض في طاقة الليزر. عادة ما يؤدي الاستبدال بحل جديد إلى حل ^{المشكلة22}.
   2. ضعف المعايرة: عند حدوث ذلك، تحقق من معايرة وقوة نظام الليزر وفقا للخطوة 5.2.2.1-5.2.2.4. إذا لم تتم معايرته بشكل صحيح ، فلن يتم توجيه الليزر إلى الموقع المطلوب ، مما يؤدي إلى آفات غير ناجحة أو تلف غير مرغوب فيه في الأنسجة المجاورة.
      1. ضع شريحة مرآة أعلى الغرفة الشعرية. ركز على الجانب المطلي (يجب أن يواجه الهدف). استخدم الإعداد الافتراضي السابق في الشريحة للتركيز بسهولة أكبر.
      2. تطبيق نمط من الاستئصال بالليزر باستخدام برنامج نصي للمعايرة.
      3. تقييم جودة النمط. يجب أن تظهر البقع أو الخطوط حادة وغير ضبابية.
      4. استخدم منحدرا ذا طاقة متزايدة لتقييم ما إذا كانت طاقة الليزر قد تغيرت مقارنة بالجلسات السابقة.
   3. حركة اليرقات أثناء الآفات: تستجيب اليرقات بشكل مختلف للتخدير. وبالتالي ، قد تؤدي آفة الليزر إلى حركات الذيل أثناء العملية ، وبالتالي منع التحويل الناجح. عندما يحدث هذا ، خذ تكرارا إضافيا لخطوات آفة الليزر لإكمالها مع تجنب تلف الأنسجة المحيطة.
   4. التركيز السيئ: عندما يحدث هذا ، ركز على منتصف القناة المركزية للحصول على أفضل النتائج.
   5. رسم عائد الاستثمار وموضعه وحجمه: يعد موضع وحجم عائد الاستثمار أمرا بالغ الأهمية لعمليات النقل الناجحة. يجب أن يكون عائد الاستثمار أكبر من الحبل الشوكي ويتمركز في مركز الحبل الشوكي. لحل هذه المشكلة ، ابدأ في سحب عائد الاستثمار من الجانب البطني للحبل الشوكي والصعود نحو الجانب الظهري للحصول على نقل ناجح. من المحتمل أن يكون هذا بسبب حركات الذيل الناتجة عن تسلسل لقطات الليزر أثناء إجراء الاستئصال.

النتائج

التحقق من صحة نقل الحبل الشوكي
تم إجراء فحوصات هيكلية ووظيفية لتقييم ما إذا كان البروتوكول يسمح بنقل الحبل الشوكي بالكامل.

أولا ، للتحقق من أن الخسارة في التألق في موقع الآفة كانت بسبب تلف الأنسجة العصبية وليس التبييض الضوئي الفلوري من إضاءة الليزر ، تم إجراء تلط...

Discussion

هناك حاجة ملحة لفهم أعمق للعمليات التي تلعب دورا أثناء التجديد في أسماك الزرد. يقدم هذا النموذج الحيواني العديد من الفوائد للبحوث الطبية الحيوية، وخاصة لإصابات الحبل ^{الشوكي1}. تتضمن معظم الدراسات آفات يدوية تتطلب مشغلا مدربا تدريبا جيدا وتحفز على تلف الأنسجة المتعددة. يتم تقد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0	Carl Zeiss
ImageJ/FIJI	Open-Source
Visual Studio Code	Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope	Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens	Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras	Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880	Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1	Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1	Carl Zeiss
UV laser	Micropoint
VAST BioImager	Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish	Thermo-Fisher	101R20
96-well plate	Corning	3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040
phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488	Jackson	703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3	Jackson	715-165-150
Mouse anti-GFP	Abcam	AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody	Sigma	T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)		N/A	First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)		N/A	First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)		N/A	Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh