Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish

Resumo

O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.

Resumo

As larvas de zebrafish possuem um sistema nervoso central totalmente funcional (SNC) com alta capacidade regenerativa apenas alguns dias após a fertilização. Isso torna este modelo animal muito útil para estudar lesão medular e regeneração. O protocolo padrão para induzir tais lesões é transectar a parte dorsal do tronco manualmente. No entanto, essa técnica requer treinamento extensivo e danifica tecidos adicionais. Um protocolo foi desenvolvido para lesões induzidas por laser para contornar essas limitações, permitindo alta reprodutibilidade e completude da transeção da medula espinhal sobre muitos animais e entre diferentes sessões, mesmo para um operador não treinado. Além disso, os danos teciduais são limitados principalmente à medula espinhal em si, reduzindo os efeitos de confusão de ferir diferentes tecidos, por exemplo, pele, músculo e CNS. Além disso, são possíveis lesões hemi-lesões da medula espinhal. A melhoria da preservação da integridade tecidual após lesão a laser facilita novas dissecções necessárias para análises adicionais, como a eletrofisiologia. Assim, este método oferece um controle preciso da extensão da lesão que é inalcançável manualmente. Isso permite novos paradigmas experimentais neste modelo poderoso no futuro.

Introdução

Em contraste com os mamíferos, o zebrafish (Danio rerio) pode reparar seu sistema nervoso central (SNC) após ^lesões1. O uso de larvas de zebrafish como modelo de regeneração da medula espinhal é relativamente recente. Provou-se valioso para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao ^reparo2. Isso se deve à facilidade de manipulação, ao curto ciclo experimental (novas larvas a cada semana), à transparência óptica dos tecidos e ao pequeno tamanho das larvas, idealmente adequada para microscopia de fluorescência in vivo .

No caso da regeneração da medula espinhal, duas vantagens adicionais do uso de larvas são a velocidade de recuperação, alguns dias em comparação com algumas semanas para adultos, e a facilidade de induzir lesões usando técnicas manuais. Isso tem sido usado com sucesso em muitos estudos3,4,5, incluindo investigações ^recentes6,7. No geral, isso leva ao aumento da produção significativa de dados, alta adaptabilidade dos protocolos experimentais e diminuição dos custos experimentais. O uso de larvas com menos de 5 dias após a fertilização também reduz o uso de animais seguindo os princípios 3R em pesquisas ^animais8.

Após uma lesão medular em larvas de zebrafish, muitos processos biológicos ocorrem, incluindo resposta inflamatória, proliferação celular, neurogênese, migração de células sobreviventes ou recém-geradas, reforma de axônios funcionais e uma remodelagem global de circuitos de processos neurais e tecidos da coluna vertebral6,7,9,10 . Para serem orquestrados com sucesso, esses processos envolvem uma interação finamente regulada entre uma gama de tipos de células, componentes de matriz extracelular e sinais bioquímicos11,12. Desvendar os detalhes dessa reorganização significativa de um tecido complexo como a medula espinhal requer o uso e o desenvolvimento de abordagens experimentais precisas e controladas.

O paradigma experimental primário usado para estudar a regeneração da medula espinhal em zebrafish é usar meios cirúrgicos para induzir danos teciduais por ressecção, esfaqueamento ou crio ^lesão3,13. Essas abordagens têm a desvantagem de exigir treinamento específico em habilidades de microcirurgia, que é demorado para qualquer novo operador e pode impedir seu uso em projetos de curto prazo. Além disso, eles geralmente induzem danos aos tecidos circundantes, o que pode influenciar a regeneração.

Outra abordagem é induzir danos celulares ^{quimicamente14} ou por manipulações ^genéticas15. Este último permite danos altamente direcionados. No entanto, tal técnica requer um longo trabalho preparatório para gerar novos peixes transgênicos antes de fazer qualquer experimento, renovado cada vez que um tipo de célula única é alvo.

Há, portanto, a necessidade de um método que permita lesões direcionadas, mas versáteis, adequadas a uma variedade de estudos em regeneração. Uma solução é usar um laser para induzir danos localizados no tecido de interesse16,17,18,19,20. De fato, o uso de danos teciduais induzidos por laser apresenta uma abordagem robusta para gerar lesões medular com muitas vantagens. Os microscópios equipados com tais módulos de manipulação a laser permitem especificar uma área em forma personalizada onde ocorrerá a ablação celular, com o benefício extra do controle temporal. O tamanho e a posição da lesão podem ser assim adaptados para responder a quaisquer questões.

A característica que falta na maioria dos sistemas de lesão a laser é a possibilidade de induzir lesões de forma altamente reprodutível para uma série de larvas. Aqui, um protocolo original é descrito usando um laser UV para induzir lesões precisas e controladas semi-automatizadas em larvas de zebrafish baseadas em uma plataforma microfluidica projetada para manuseio automatizado de ^larvas21. Além disso, no sistema aqui apresentado, as larvas são inseridas em um capilar de vidro, o que permite a livre rotação do animal em torno de seu eixo rostrocaudal. O usuário pode escolher qual lado da larva apresentar ao laser, permitindo que a imagem de fluorescência direja precisamente o raio laser e avalie o dano após a lesão.

O protocolo descrito aqui é usado com um sistema semi-automatizado de imagens de larvas de zebrafish combinado com um disco giratório equipado com um laser UV (designado a partir de agora como o sistema VAST). No entanto, os principais pontos do protocolo e a maioria das alegações da técnica são válidos para qualquer sistema equipado com um laser capaz de ablação celular, incluindo microscópios de varredura a laser de dois fótons, microscópios de disco giratório fornecidos com um laser UV (módulo FRAP), ou microscópios de vídeo com um módulo laser para manipulação de fotos. Uma das principais diferenças entre o sistema VAST e o manuseio convencional da amostra será que, para este último, serão necessárias larvas de montagem em pontos de baixa fusão em tampas de vidro/placas de petri de fundo de vidro no lugar de carregá-las em uma placa de 96 poços.

Os benefícios oferecidos por este método abrem oportunidades para pesquisas inovadoras sobre os mecanismos celulares e moleculares durante o processo de regeneração. Além disso, a alta qualidade dos dados permite investigações quantitativas em um contexto multidisciplinar.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram realizados com aprovação do Ministério do Interior do Reino Unido e de acordo com suas regulamentações, sob licença de projeto PP8160052. O projeto foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Edimburgo. Para análises experimentais, larvas de zebrafish até 5 dias de idade de ambos os sexos foram utilizadas das seguintes linhas transgênicas disponíveis: Tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg (Xla.Tubb:DsRed), Tg (betaactin:utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) e Tg(mnx1:gfp) (ver Arquivo Suplementar 1 sobre a geração das linhas de zebrafish transgênicos). Um esquema do protocolo usando a plataforma automatizada de manipulação de larvas de zebrafish é mostrado na Figura 1. Todos os softwares personalizados, scripts e protocolos experimentais detalhados usados neste trabalho estão disponíveis em https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. Preparação da amostra

1. Em 5h pós-fertilização, classifique os embriões para o estágio correto de ^{desenvolvimento21}. Descarte ovos mortos e embriões mal desenvolvidos e superdesenvolvidos.
2. Aos 3 dias pós-fertilização (dpf), anestesiam larvas adicionando 2 mL de 0,4% aminobenzoico-ácido-etil-éster a 50 mL de água de instalações de peixe em uma placa de Petri de 90 mm. Use animais criados com fenilhiourea (PTU) (ver Tabela de Material) para prevenir a pigmentação da pele se for um problema, o que não é o caso de lesões na medula espinhal em 3 larvas dpf descritas neste protocolo.
   NOTA: Esta concentração anestésico relativamente alta é usada para evitar movimentos das larvas após o impacto do laser.
3. Tela os embriões para expressão de repórter fluorescente (Arquivo Suplementar 1).
   NOTA: Um repórter fluorescente para a medula espinhal (ou outra estrutura de interesse) é frequentemente necessário para avaliar a eficiência da lesão. O uso de tg (Xla.Tubb:DsRed) ajuda a identificar a medula espinhal.
4. Transfira as larvas selecionadas para uma placa de 96 poços para uso no sistema VAST (ver Tabela de Materiais) com 300 μL de água de instalações de peixe por poço. Use diretamente o meio contendo o anestésico da placa de Petri de 90 mm. Certifique-se de ter apenas uma larva por poço. Prepare uma placa extra vazia de 96 poços para coletar as larvas lesionadas.
   NOTA: Se usar outro sistema de lesão a laser, monte as larvas em gel de agarose de ponto de fusão baixa (LMP) em uma câmara de observação apropriada.

2. Preparação do microscópio

1. Ligue todos os componentes do sistema (VAST, microscópio, laser, PC), incluindo o laser para ablação.
2. Uma vez que o hardware esteja totalmente inicializado, inicie o software de microscópio, ImageJ/Fiji, um ambiente de desenvolvimento integrado python (IDE) e o software automatizado de imagem de zebrafish (SISTEMA VAST) se usar essa plataforma (ver Tabela de Materiais).
3. Configure o software VAST seguindo as etapas abaixo.
   1. Quando o software VAST for lançado, escolha Placa na primeira janela e clique no botão Feito (Figura 2A). Outra pequena janela aparecerá perguntando se o capilar está vazio e limpo. Verifique olhando para a imagem do capilar se há alguma bolha de ar dentro. Se não, clique em Sim. Se houver alguma bolha, clique em Não e siga o passo 2.3.2-2.3.3 (Figura 2B).
   2. Na janela Sampler de partículas grandes (LP), clique em Prime para remover bolhas de ar (Figura 2C).
   3. Vá para a janela principal do software (com a imagem capilar) e clique com o botão direito do mouse na imagem. Selecione Gravar imagens capilares vazias no menu pop-up (Figura 2B).
   4. Na janela LP Sampler , vá para o menu Arquivo e selecione a opção Abrir script . Escolha um arquivo contendo o script correspondente ao experimento a ser realizado.
   5. Na janela principal do software VAST, vá para Arquivo e escolha Open Experiment. Escolha o arquivo de experimento correspondente ao experimento planejado.
      NOTA: Certifique-se de que as caixas descarregam automaticamente e a saída em massa para resíduos NÃO sejam verificadas.
4. Configure o software de microscópio para imagens.
   1. Inicie o software de imagem do microscópio (ver Tabela de Materiais) para inicializar o hardware. Isso pode levar alguns minutos, dependendo do sistema.
   2. Vá para as configurações de aquisição e configure o microscópio para imagem do fluoróforo expresso nas larvas. Use um objetivo de mergulho de água 10x NA 0.5 para garantir que o volume focal seja alongado o suficiente ao longo do eixo óptico para lesionar toda a profundidade da medula espinhal ou do tecido alvo.
5. Configure ImageJ/Fiji para lesões a laser.
   1. Vá para o menu Arquivo , escolha Novo/Script para abrir a janela do script.
   2. Na janela Novo , vá para o menu Arquivo e escolha Abrir para carregar o script de lesão a laser (Manual_MP_Operation.ijm).
6. Configure o Python IDE.
   1. Inicie o Python IDE.
   2. Vá para o menu Arquivo e escolha Arquivo Aberto para carregar o script para gerenciar o laser (Watch_for_ROIs_py3.py).
   3. Vá para o menu Executar e escolha Executar sem depuração para executar o script. Verifique se uma sequência de mensagens no painel TERMINAL aparece junto com algum ruído enquanto o atenuante a laser inicializa (Figura 2D).

3. Realizar lesões a laser no sistema VAST

1. Centralizar o capilar em relação ao objetivo do microscópio movendo o palco clicando nos botões de seta na janela principal do software VAST (Figura 2B).
2. Concentre-se na parte superior do capilar olhando através das oculares e usando a luz transmitida do microscópio.
   ATENÇÃO: O capilar é muito frágil e pode quebrar se tocado pelo objetivo. Mova o botão do microscópio lentamente ao se concentrar dentro e fora.
3. Coloque as placas de 96 poços no porta-placas do Sampler LP do sistema VAST. Coloque a placa contendo larvas no suporte esquerdo e a placa para coleta à direita. Certifique-se de que as placas estão corretamente orientadas: o poço A1 deve estar no canto frontal-esquerdo do suporte.
4. No software VAST, na janela Sampler LP, clique no botão Modelo de placa e selecione todos os poços que contêm larvas. Clique no botão OK para validar e fechar a janela (Figura 2C).
5. Na janela LP Sampler, clique no botão Executar placa para começar a carregar uma larva.
   NOTA: Após algum tempo, a larva deve ser visível no capilar na posição (predefinido no arquivo de definição do experimento), permitindo ferir a medula espinhal. A luz da bandeja VAST se desligará após algumas rotações para definir a larva com o lado lateral voltado para o objetivo do microscópio.
6. Vá para o software do microscópio e clique no botão Viver para imagem da larva.
7. Gire o botão de foco do microscópio até que o canal central da medula espinhal esteja visível.
   NOTA: Pode ser mais fácil focar usando a luz transmitida primeiro e, em seguida, refinar com fluorescência.
8. Tire uma foto em fluorescência e salve a imagem em uma pasta dedicada.
9. Abra a imagem no ImageJ e ajuste o contraste se necessário (usando o menu Imagem/Ajuste/Brilho/contraste... no ImageJ).
10. Clique na ferramenta de linha Região de Interesse (ROI) e desenhe uma linha curta (20 μm) centrada na medula espinhal (Figura 3A).
11. Mude o microscópio para a posição do espelho 100% reflexivo.
12. Carregue o script ImageJ e clique no botão Executar . Use os seguintes parâmetros: Repetição - 2; Amostra - 1; Largura - 40 mícron; Atenuação - 89 (Potência laser total) (Figura 3C).
13. Quando a sequência de tiro laser estiver terminada, mude para imagens de fluorescência no software de imagem e ajuste o foco, se necessário.
    NOTA: Uma mudança de foco é frequentemente observada devido ao deslocamento da cauda durante a exposição ao laser.
14. Tire uma nova foto e salve-a.
15. Abra esta nova imagem no ImageJ e desenhe uma nova linha que deve ser maior que a medula espinhal em si (~80 μm), começando abaixo do lado ventral da medula espinhal na parte superior do notochord e indo em direção ao lado dorsal para terminar no espaço entre a medula espinhal e a pele (Figura 3B).
16. Mude o microscópio para a posição do espelho 100% reflexivo.
17. Vá para a janela do script ImageJ e clique no botão Executar . Use os seguintes parâmetros: Repetição - 2; Amostra - 1; Largura - 40 mícrons; Atenuação - 89 (Potência máxima do laser).
18. Após o (mais longo) sequência de tiro laser ser concluída, verifique a qualidade da transeção por fluorescência de imagem e foco. Certifique-se de que nenhuma célula ou axônios permaneçam intactos no local da lesão, que deve aparecer como uma área fluorescente escura ou homogênea (Figura 3D, painel inferior).
19. Colete as larvas lesionadas na placa vazia de 96 poços (com as mesmas coordenadas do poço do poço original) indo para a janela principal do software VAST e clicando no botão Coletar .
20. Ligue de volta a luz do sistema VAST clicando na caixa de seleção Tray Light no canto inferior esquerdo da janela.
21. Repita o passo 3.3-3.17 para cada nova larva ser ferida.

4. Manuseio pós-lesão e experimentos adicionais

1. Retire as larvas da placa de 96 poços o mais rápido possível e transfira-as para uma placa de Petri limpa com água fresca para que as larvas recuperem a pós-lesão. Coloque a placa de Petri em uma incubadora a 28 °C.
   NOTA: O dano muitas vezes continua a se propagar na primeira hora após a lesão. A extensão real da lesão deve, portanto, ser avaliada por imagens de fluorescência após um atraso de aproximadamente 1 h.

5. Solução de problemas

1. Se as bolhas de ar estiverem presentes nos tubos e capilares do sistema VAST, clique no botão Prime na janela LP Sampler para removê-las.
2. Considere as lesões mal sucedidas (avaliadas a partir da fluorescência remanescente no local da lesão, além do histórico residual e homogêneo esperado), que podem ser devido a várias razões mencionadas abaixo.
   1. Baixa potência laser: Quando isso acontecer, tente com um valor mais alto.
      NOTA: O sistema VAST é equipado com um laser de corante. Isso implica que a concentração da solução de corante usada para a geração de luz a laser pode mudar com o tempo, levando a uma diminuição da potência laser. Substituir por uma solução nova geralmente resolve o ^problema22.
   2. Má calibração: Quando isso acontecer, verifique a calibração e a potência do sistema laser conforme a etapa 5.2.2.1-5.2.2.4. Se não estiver calibrado corretamente, o laser não será direcionado para o local desejado, levando a lesões mal sucedidas ou danos indesejados em tecidos adjacentes.
      1. Coloque um deslizamento de espelho em cima da câmara capilar. Concentre-se no lado revestido (deve enfrentar o objetivo). Use um padrão anterior no slide para se concentrar mais facilmente.
      2. Aplique um padrão de ablação a laser usando um script de calibração.
      3. Avalie a qualidade do padrão. As manchas ou linhas devem parecer nítidas e não embaçadas.
      4. Use uma rampa com potência crescente para avaliar se a potência do laser mudou em comparação com as sessões anteriores.
   3. Movimento larval durante lesões: Larvas respondem de forma diferente à anestesia; assim, a lesão a laser pode desencadear movimentos da cauda durante o processo, impedindo assim uma transeção bem sucedida. Quando isso acontecer, tome uma iteração extra das etapas da lesão laser para completá-la, evitando danos aos tecidos circundantes.
   4. Foco ruim: Quando isso ocorrer, concentre-se no meio do canal central para obter os melhores resultados.
   5. Desenho, posição e tamanho do ROI: A posição e o tamanho do ROI são fundamentais para transeções bem sucedidas. O ROI deve ser maior que a medula espinhal e centrado no centro da medula espinhal. Para resolver isso, comece a retirar o ROI do lado ventral da medula espinhal e suba em direção ao lado dorsal para obter uma transeção bem sucedida. Isso é provavelmente devido aos movimentos da cauda desencadeados pela sequência de tiros a laser durante o procedimento de ablação.

Resultados

Validação da transeção da medula espinhal
Foram realizadas investigações estruturais e funcionais para avaliar se o protocolo permite uma transeção completa da medula espinhal.

Primeiro, verificar se a perda de fluorescência no local da lesão foi devido a danos no tecido neuronal e não à fotoblemação da fluorescência da iluminação laser, foi realizada a imunostenção utilizando um anticorpo contra tubulina acetilada (ver Tabela de Materiais

Discussão

Há uma necessidade urgente de uma compreensão mais profunda dos processos em jogo durante a regeneração em zebrafish. Este modelo animal oferece muitos benefícios para a pesquisa biomédica, em especial para lesões ^medular1. A maioria dos estudos envolve lesões manuais que requerem um operador bem treinado e induzem danos multi tecidos. Aqui é apresentado um protocolo de lesão a laser, permitindo o controle sobre as características da lesão e danos reduzidos aos tecidos circundantes. Al...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0	Carl Zeiss
ImageJ/FIJI	Open-Source
Visual Studio Code	Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope	Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens	Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras	Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880	Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1	Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1	Carl Zeiss
UV laser	Micropoint
VAST BioImager	Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish	Thermo-Fisher	101R20
96-well plate	Corning	3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040
phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488	Jackson	703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3	Jackson	715-165-150
Mouse anti-GFP	Abcam	AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody	Sigma	T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)		N/A	First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)		N/A	First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)		N/A	Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh