JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.

Abstract

לזחלי דגי הזברה יש מערכת עצבים מרכזית מתפקדת לחלוטין (CNS) עם יכולת התחדשות גבוהה רק כמה ימים לאחר ההפריה. זה עושה את המודל החייתי הזה מאוד שימושי לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות. הפרוטוקול הסטנדרטי לגרימת נגעים כאלה הוא לחצות את החלק הגבי של תא המטען באופן ידני. עם זאת, טכניקה זו דורשת הכשרה נרחבת ופוגעת ברקמות נוספות. פותח פרוטוקול עבור נגעים הנגרמים בלייזר כדי לעקוף מגבלות אלה, המאפשר רבייה גבוהה ושלמות של העברת חוט השדרה על בעלי חיים רבים ובין מפגשים שונים, אפילו עבור מפעיל לא מאומן. יתר על כן, נזק לרקמות מוגבל בעיקר לחוט השדרה עצמו, מה שמפחית השפעות מבלבלות מפגיעה ברקמות שונות, למשל עור, שרירים ומערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, נגעים חמי של חוט השדרה אפשריים. שימור משופר של שלמות הרקמות לאחר פגיעה בלייזר מקל על ניתוחים נוספים הדרושים לניתוחים נוספים, כגון אלקטרופיזיולוגיה. לפיכך, שיטה זו מציעה שליטה מדויקת על היקף הפגיעה שאינו ניתן להשגה באופן ידני. זה מאפשר פרדיגמות ניסיוניות חדשות במודל רב עוצמה זה בעתיד.

Introduction

בניגוד ליונקים, דגי זברה (דניו ריו) יכולים לתקן את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS) לאחר פציעה1. השימוש בזחלי דגי זברה כמודל להתחדשות חוט השדרה הוא חדש יחסית. זה הוכיח ערך לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבבסיס תיקון2. הסיבה לכך היא קלות המניפולציה, מחזור הניסויים הקצר (זחלים חדשים מדי שבוע), השקיפות האופטית של הרקמות, וגודלו הקטן של הזחלים, המותאם באופן אידיאלי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של vivo .

במקרה של התחדשות חוט השדרה, שני יתרונות נוספים של שימוש בזחלים הם מהירות ההתאוששות, כמה ימים לעומת כמה שבועות למבוגרים, ואת הקלות של גרימת פציעות באמצעות טכניקות ידניות. זה שימש בהצלחה במחקרים רבים3,4,5, כולל חקירות האחרונות6,7. בסך הכל, זה מוביל לייצור נתונים משמעותיים מוגברים, הסתגלות גבוהה של פרוטוקולים ניסיוניים, וירידה בעלויות הניסוי. השימוש בזחלים מתחת ל-5 ימים לאחר ההפריה גם מפחית את השימוש בבעלי חיים בעקבות עקרונות ה-3R במחקר בבעלי חיים8.

לאחר פגיעה בחוט השדרה בזחלי דגי הזברה, מתרחשים תהליכים ביולוגיים רבים, כולל תגובה דלקתית, התפשטות תאים, נוירוגנזה, הגירה של תאים ששרדו או חדשים שנוצרו, רפורמציה של אקסונים פונקציונליים, ושיפוץ גלובלי של מעגלי תהליכים עצביים ורקמות עמוד שדרה6,7,9,10 . כדי להיות מתוזמר בהצלחה, תהליכים אלה כרוכים אינטראקציה מווסתת היטב בין מגוון של סוגי תאים, רכיבי מטריצה חוץ תאית, אותות ביוכימיים1,12. חשיפת הפרטים של ארגון מחדש משמעותי זה של רקמה מורכבת כגון חוט השדרה דורשת שימוש ופיתוח של גישות ניסיוניות מדויקות ומבוקרות.

הפרדיגמה הניסיונית העיקרית המשמשת לחקר התחדשות חוט השדרה בדגי זברה היא להשתמש באמצעים כירורגיים כדי לגרום נזק לרקמות על ידי כריתה, דקירה או קריוג'ורי3,13. לגישות אלה יש את החיסרון של דרישת הכשרה ספציפית במיומנויות מיקרוכירורגיות, אשר גוזל זמן רב עבור כל מפעיל חדש ועשוי למנוע את השימוש בהם בפרויקטים לטווח קצר. יתר על כן, הם בדרך כלל לגרום נזק לרקמות שמסביב, אשר עשוי להשפיע על התחדשות.

גישה נוספת היא לגרום נזק לתאים כימית14 או על ידי מניפולציות גנטיות15. זה האחרון מאפשר נזק ממוקד מאוד. עם זאת, טכניקה כזו דורשת עבודת הכנה ארוכה כדי ליצור דגים מהונדסים חדשים לפני ביצוע כל ניסוי, מחודש בכל פעם סוג תא ייחודי הוא ממוקד.

יש, אם כן, את הצורך בשיטה המאפשרת נגעים ממוקדים אך תכליתיים המתאימים למגוון מחקרים בהתחדשות. הפתרון הוא להשתמש בלייזר כדי לגרום נזק מקומי ברקמת העניין16,17,18,19,20. ואכן, השימוש בנזק לרקמות הנגרמות בלייזר מציג גישה חזקה ליצירת נגעים בחוט השדרה עם יתרונות רבים. המיקרוסקופים המצוידים במודולים כאלה של מניפולציה בלייזר מאפשרים לציין אזור מעוצב מותאם אישית שבו תתרחש אבלציה של תאים, עם היתרון הנוסף של שליטה זמנית. כך ניתן להתאים את גודלו ומיקום הנגע כדי לענות על כל שאלה.

התכונה החסרה של רוב מערכות נגע הלייזר היא האפשרות לגרום לפציעות באופן רב לשחזור עבור סדרה של זחלים. כאן מתואר פרוטוקול מקורי באמצעות לייזר UV כדי לגרום לנגעים מדויקים ומבוקרים חצי אוטומטיים בזחלי דגי זברה המבוססים על פלטפורמה מיקרופלואידית המיועדת לטיפול אוטומטי בזחלים21. יתר על כן, במערכת המוצגת כאן, זחלים מוכנסים נימי זכוכית, המאפשר סיבוב חופשי של החיה סביב ציר rostrocaudal שלה. המשתמש יכול לבחור איזה צד של הזחל להציג ללייזר תוך מתן הדמיה פלואורסצנטית כדי למקד במדויק את קרן הלייזר ולהעריך את הנזק לאחר הנגע.

הפרוטוקול המתואר כאן משמש עם מערכת הדמיה אוטומטית למחצה של זחלי דגי זברה בשילוב עם דיסק מסתובב המצויד בלייזר UV (המיועד להלן כמערכת VAST). עם זאת, הנקודות העיקריות של הפרוטוקול ורוב הטענות של הטכניקה תקפות לכל מערכת המצוידת בלייזר המסוגל לאבלציה של תאים, כולל מיקרוסקופים לסריקת לייזר שני פוטונים, מיקרוסקופים של דיסק מסתובב המסופקים עם לייזר UV (מודול FRAP), או מיקרוסקופי וידאו עם מודול לייזר לייזר למניפולציה בתמונה. אחד ההבדלים העיקריים בין מערכת VAST לבין טיפול מדגם קונבנציונאלי יהיה כי עבור האחרון, הרכבה זחלים בנקודת התכה נמוכה התעוררו על כיסויי זכוכית / צלחות פטרי תחתית זכוכית במקום לטעון אותם בצלחת 96-well- well יהיה צורך.

היתרונות המוצעים בשיטה זו פותחים הזדמנויות למחקר חדשני על המנגנונים התאיים והמולקולריים במהלך תהליך ההתחדשות. יתר על כן, איכות הנתונים הגבוהה מאפשרת חקירות כמותיות בהקשר רב תחומי.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו באישור משרד הפנים הבריטי ועל פי תקנותיו, תחת רישיון הפרויקט PP8160052. הפרויקט אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת אדינבורו. לניתוחים ניסיוניים, זחלי דגי זברה עד גיל 5 ימים משני המינים שימשו לקווים הטרנסגניים הזמינים הבאים: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) ו- Tg(mnx1:gfp) (ראה קובץ משלים 1 לגבי הדור של קווי דגי הזברה הטרנסגניים). תרשים של הפרוטוקול באמצעות פלטפורמת הטיפול האוטומטית בזחלי דגי זברה מוצג באיור 1. כל התוכנות המותאמות אישית, קבצי ה- Script והפרוטוקולים הניסיוניים המפורטים המשמשים בעבודה זו זמינים https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. הכנה לדוגמה

  1. בשעה 5 שעות לאחר ההפריה, מיין את העוברים לשלב ההתפתחותי הנכון21. להשליך ביצים מתות ועוברים מפותחים מפותחים ומתפתחים יתר על המידה.
  2. ב 3 ימים לאחר ההפריה (dpf), מרדים זחלים על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.4% aminobenzoic-חומצה-אתיל מתיל-אסתר ל 50 מ"ל של מי מתקן דגים בצלחת פטרי 90 מ"מ. השתמש בבעלי חיים שגדלו עם phenylthiourea (PTU) (ראה טבלה של חומר) כדי למנוע פיגמנטציה בעור אם זה בעיה, וזה לא המקרה של פציעות חוט השדרה על 3 זחלי dpf המתוארים בפרוטוקול זה.
    הערה: ריכוז הרדמה גבוה יחסית זה משמש למניעת תנועות של הזחלים בעקבות השפעת הלייזר.
  3. סנן את העוברים עבור ביטוי עיתונאי פלואורסצנטי (קובץ משלים 1).
    הערה: כתב פלואורסצנטי לחוט השדרה (או מבנה עניין אחר) נדרש לעתים קרובות כדי להעריך את יעילות הפציעה. השימוש ב- tg (Xla.Tubb:DsRed) מסייע בזיהוי חוט השדרה.
  4. מעבירים את הזחלים הנבחרים לצלחת של 96 בארות לשימוש במערכת VAST (ראו טבלת חומרים) עם 300 μL של מי מתקן דגים לבאר. השתמשו במדיום המכיל את חומר ההרדמה מצלחת הפטרי בקוטר 90 מ"מ ישירות. ודא שיש רק זחל אחד לכל באר. הכן צלחת ריקה נוספת של 96 בארות כדי לאסוף את הזחלים הנגעים.
    הערה: אם אתם משתמשים במערכת אחרת של נגע בלייזר, הר את הזחלים בג'ל אגרוז של נקודת התכה נמוכה (LMP) 1% בתא תצפית מתאים.

2. הכנת מיקרוסקופ

  1. הפעל את כל רכיבי המערכת (VAST, מיקרוסקופ, לייזר, מחשב), כולל לייזר לאבלציה.
  2. לאחר שהחומרה מאותחלת במלואה, הפעל את תוכנת המיקרוסקופ, ImageJ/Fiji, סביבת פיתוח משולבת פיתון (IDE) ואת תוכנת הדמיית דגי הזברה האוטומטית (מערכת VAST) אם אתה משתמש בפלטפורמה זו (ראה טבלת חומרים).
  3. הגדר את תוכנת VAST בעקבות השלבים הבאים.
    1. כשתוכנת VAST מופעלת, בחרו 'לוח' בחלון הראשון ולחצו על הכפתור 'סיום ' (איור 2A). חלון קטן נוסף יצוץ וישאל אם הנימים ריקים ונקיים. ודא על ידי התבוננות בתמונה של הנימים אם יש בועות אוויר בפנים. אם לא, לחץ על כן. אם יש בועות כלשהן, לחץ על לא ובצע את שלב 2.3.2-2.3.3 (איור 2B).
    2. בחלון סמפלר החלקיקים הגדולים (LP), לחץ על Prime כדי להסיר בועות אוויר (איור 2C).
    3. עבור אל חלון התוכנה הראשי (עם התמונה הנימית) ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התמונה. בחרו ' הקלט תמונה נימית ריקה ' בתפריט הנפתח (איור 2B).
    4. בחלון LP Sampler , עבור לתפריט קובץ ובחר באפשרות פתח סקריפט . בחר קובץ המכיל את קובץ ה- Script המתאים לניסוי שיש לבצע.
    5. בחלון התוכנה הראשי VAST, עבור אל קובץ ובחר פתח ניסוי. בחר את קובץ הניסוי המתאים לניסוי המתוכנן.
      הערה: ודא שהתיבות ביטול טעינה אוטומטי ופלט בצובר לבזבוז אינן מסומנות.
  4. הגדר את תוכנת המיקרוסקופ להדמיה.
    1. הפעל את תוכנת הדמיית המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים) כדי לאתחל את החומרה. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות, בהתאם למערכת.
    2. עבור אל הגדרות הרכישה והגדר את המיקרוסקופ להדמיית הפלואורופור המתבטא בזחלים. השתמש במטרה 10x NA 0.5 טבילה במים כדי להבטיח את נפח המוקד מוארך מספיק לאורך הציר האופטי כדי לפגוע בכל עומק חוט השדרה או הרקמה הממוקדת.
  5. הגדר ImageJ / פיג'י עבור נגעים בלייזר.
    1. עבור לתפריט קובץ , בחר חדש/Script כדי לפתוח את חלון קובץ ה- Script.
    2. בחלון חדש , עבור לתפריט קובץ ובחר פתח כדי לטעון את סקריפט נגע הלייזר (Manual_MP_Operation.ijm).
  6. תקים את פייתון IDE.
    1. הפעל את פייתון IDE.
    2. עבור לתפריט קובץ ובחר פתח קובץ כדי לטעון את קובץ ה- Script לניהול הלייזר (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. עבור לתפריט הפעלה ובחר הפעל ללא איתור באגים כדי להפעיל את קובץ ה- Script. ודאו שרצף הודעות בחלונית TERMINAL יופיע יחד עם רעש מסוים בזמן שהמנחת הלייזר מאותחל (איור 2D).

3. ביצוע נגעי לייזר במערכת VAST

  1. מרכז את הנימים ביחס למטרת המיקרוסקופ על ידי הזזת הבמה על ידי לחיצה על כפתורי החצים בחלון הראשי של תוכנת VAST (איור 2B).
  2. התמקד בחלק העליון של הנימים על ידי התבוננות דרך העפעפיים ושימוש באור המועבר של המיקרוסקופ.
    אזהרה: הנימים שבריריים מאוד ועלולים להישבר אם המטרה נוגעת בהם. הזז את ידית המיקרוסקופ באיטיות בעת התמקדות פנימה והחוצה.
  3. מניחים את הצלחות 96-well על מחזיק הצלחת של סמפלר LP של מערכת VAST. מניחים את הצלחת המכילה זחלים על המחזיק השמאלי ואת הצלחת לאיסוף בצד ימין. ודא שהצלחות מכוונות כראוי: באר A1 חייבת להיות בפינה הקדמית-שמאלית של המחזיק.
  4. בתוכנת VAST, בחלון סמפלר LP, לחץ על לחצן תבנית צלחת ובחר את כל הבארות המכילות זחלים. לחצו על כפתור אישור כדי לאמת ולסגור את החלון (איור 2C).
  5. בחלון LP Sampler, לחץ על לחצן לוח הפעלה כדי להתחיל לטעון זחל.
    הערה: לאחר זמן מה, הזחל צריך להיות גלוי בנימי במיקום (מוגדר מראש בקובץ הגדרת הניסוי), המאפשר לפגוע בחוט השדרה. אור מגש VAST יכבה לאחר מספר סיבובים כדי להגדיר את הזחל עם הצד לרוחב מול מטרת המיקרוסקופ.
  6. עבור אל תוכנת המיקרוסקופ ולחץ על לחצן Live כדי לדמיין את הזחל.
  7. סובב את ידית המיקוד של המיקרוסקופ עד שהתעלה המרכזית של חוט השדרה נראית לעין.
    הערה: זה יכול להיות קל יותר להתמקד באמצעות אור מועבר תחילה, ולאחר מכן לחדד עם פלואורסצנטיות.
  8. צלם תמונה בפלואורסצנטיות ושמור את התמונה בתיקיה ייעודית.
  9. פתחו את התמונה ב-ImageJ והתאמו את הניגודיות במידת הצורך (באמצעות התפריט תמונה/כוונון/בהירות/ניגודיות... ב-ImageJ).
  10. לחץ על כלי הקו של אזור העניין (ROI) וצייר קו קצר (20 מיקרומטר) שבמרכזו חוט השדרה (איור 3A).
  11. העבר את המיקרוסקופ למיקום המראה המשקף 100%.
  12. טען את קובץ ה- Script של ImageJ ולחץ על לחצן הפעלה . השתמש בפרמטרים הבאים: חזרה - 2; מדגם - 1; רוחב - 40 מיקרון; הנחתה - 89 (עוצמת לייזר מלאה) (איור 3C).
  13. לאחר סיום רצף צילומי הלייזר, עבור להדמיית פלואורסצנטיות בתוכנת ההדמיה והתאם את המוקד במידת הצורך.
    הערה: שינוי במיקוד נצפה לעתים קרובות עקב תזוזת זנב במהלך חשיפה ללייזר.
  14. קח תמונה חדשה ושמור אותה.
  15. פתחו את התמונה החדשה ב-ImageJ וציירו קו חדש שאמור להיות גדול יותר מחוט השדרה עצמו (כ-80 מיקרומטר), החל מתחת לצד הגחוני של חוט השדרה בחלקו העליון של הנוטוקורד והולך לכיוון הצד הגבי עד הסוף ברווח שבין חוט השדרה לעור (איור 3B).
  16. העבר את המיקרוסקופ למיקום המראה המשקף 100%.
  17. עבור אל חלון סקריפט ImageJ ולחץ על לחצן הפעל . השתמש בפרמטרים הבאים: חזרה - 2; מדגם - 1; רוחב - 40 מיקרון; הנחתה - 89 (כוח לייזר מלא).
  18. לאחר סיום רצף צילומי הלייזר (הארוך יותר), ודא את איכות ההעברה על-ידי הדמיית פלואורסצנטיות ומיקוד. ודאו שאף תא או אקסונים לא יישארו שלמים באתר הנגע, שאמור להיראות כאפל או כאזור פלואורסצנטי קלוש והומוגני (איור תלת-ממד, החלונית התחתונה).
  19. לאסוף את הזחלים נגע לתוך צלחת ריקה 96-well (עם אותם מתאמים היטב כמו זה של הבאר המקורית) על ידי הולך לחלון התוכנה הראשי VAST ולחיצה על כפתור איסוף .
  20. הפעל שוב את נורית המערכת VAST על-ידי לחיצה על תיבת הסימון Tray Light בפינה הימנית התחתונה של החלון.
  21. חזור על שלב 3.3-3.17 עבור כל זחל חדש להיפגע.

4. טיפול לאחר נגע וניסויים נוספים

  1. הוציאו את הזחלים מצלחת 96 הבאר בהקדם האפשרי והעבירו אותם לצלחת פטרי נקייה עם מי מתקן דגים טריים לזחלים כדי להתאושש לאחר הנגע. שים את צלחת פטרי באינקובטור ב 28 °C (50 °F).
    הערה: הנזק לעתים קרובות ממשיך להתפשט בשעה הראשונה לאחר הנגע. לפיכך, יש להעריך את היקף הנגע בפועל על ידי הדמיית פלואורסצנטיות לאחר עיכוב של כ 1 שעות.

5. פתרון בעיות

  1. אם בועות אוויר נמצאות בצינורות ובנימים של מערכת VAST, לחץ על כפתור Prime בחלון LP Sampler כדי להסיר אותם.
  2. שקול את הנגעים הלא מוצלחים (כפי שהוערך מן הפלואורסצנטיות הנותרת באתר הנגע, מלבד הרקע השיורי וההומוגני הצפוי), אשר יכול להיות בשל מספר סיבות שהוזכרו להלן.
    1. עוצמת לייזר נמוכה: כאשר זה קורה, נסה עם ערך גבוה יותר.
      הערה: מערכת VAST מצוידת בלייזר צבע. משמעות הדבר היא כי הריכוז של פתרון הצבע המשמש לייצור אור לייזר יכול להשתנות עם הזמן, מה שמוביל לירידה בכוח הלייזר. החלפה בפתרון חדש בדרך כלל פותרת את הבעיה22.
    2. כיול לקוי: כאשר זה קורה, לאמת את הכיול והעוצמה של מערכת הלייזר לפי שלב 5.2.2.1-5.2.2.4. אם לא מכויל כראוי, הלייזר לא יופנה למיקום הרצוי, ובכך יוביל נגעים לא מוצלחים או נזק בלתי רצוי ברקמות סמוכות.
      1. הנח שקופית מראה על גבי תא הנימים. דגש על הצד המצופה (זה צריך להתמודד עם המטרה). השתמש בברירת מחדל קודמת בשקופית כדי להתמקד ביתר קלות.
      2. החל תבנית של אבלציה לייזר באמצעות סקריפט כיול.
      3. להעריך את איכות התבנית. הכתמים או הקווים צריכים להיראות חדים ולא מטושטשים.
      4. השתמש ברמפה עם כוח הולך וגדל כדי להעריך אם כוח הלייזר השתנה בהשוואה למפגשים הקודמים.
    3. תנועת זחלים במהלך נגעים: זחלים מגיבים באופן שונה להרדמה; לכן, נגע הלייזר עשוי לעורר תנועות של הזנב במהלך התהליך, ובכך למנוע טרנסקציה מוצלחת. כאשר זה קורה, לקחת איטרציה נוספת של צעדי נגע לייזר כדי להשלים אותו תוך הימנעות נזק לרקמות שמסביב.
    4. מיקוד רע: כאשר זה קורה, להתמקד באמצע התעלה המרכזית כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר.
    5. ציור החזר השקעה, מיקום וגודל: המיקום והגודל של ההחזר על ההשקעה הם קריטיים עבור מעברים מוצלחים. החזר ההשקעה צריך להיות גדול יותר מחוט השדרה ומרוכז במרכז חוט השדרה. כדי לפתור זאת, התחל לצייר את ההחזר על ההשקעה מהצד הגחוני של חוט השדרה ולעלות לכיוון הצד הגבי כדי להשיג העברה מוצלחת. זה כנראה בגלל תנועות זנב מופעלות על ידי רצף של יריות לייזר במהלך הליך אבלציה.

תוצאות

אימות של העברת חוט השדרה
חקירות מבניות ותפקודיות בוצעו כדי להעריך אם הפרוטוקול מאפשר העברה מלאה של חוט השדרה.

ראשית, כדי לוודא כי אובדן פלואורסצנטיות באתר הנגע נבע מנזק לרקמות עצביות ולא מהלבנת פלואורסצנטיות מתאורת הלייזר, בוצע אימונוסטנציה באמצעות נוגדן נגד טו...

Discussion

יש צורך דחוף בהבנה עמוקה יותר של התהליכים במשחק במהלך התחדשות בדגי זברה. מודל זה של בעלי חיים מציע יתרונות רבים למחקר ביו-רפואי, במיוחד עבור פגיעות בחוט השדרה1. רוב המחקרים כוללים נגעים ידניים הדורשים מפעיל מאומן היטב ולגרום נזק רב רקמות. פרוטוקול נגע לייזר מוצג כאן, המאפשר שלי...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי BBSRC (BB/S0001778/1). CR ממומן על ידי הנסיכה המלכותית TENOVUS סקוטלנד מחקר רפואי תוכנית מלגות. אנו מודים לדיוויד גרינלד (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) וקייטי ריד (CDBS, אוניברסיטת אדינבורו) על המתנה הנדיבה של דגים מהונדסים (ראה קובץ משלים). אנו מודים לדניאל סונג (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) על הגישה האדיבה לקונפוקל 3i ספינינג-דיסק.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0Carl Zeiss
ImageJ/FIJIOpen-Source
Visual Studio CodeMicrosoft
Microscope and accessories
ApoTome microscopeCarl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lensCarl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD camerasCarl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1Carl Zeiss
UV laserMicropoint
VAST BioImagerUnion Biometrica
Labware
90 mm Petri dishThermo-Fisher101R20
96-well plateCorning3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging KitInvitrogenC10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)Sigma-AldrichA5040
phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488Jackson703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3Jackson715-165-150
Mouse anti-GFPAbcamAB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibodySigmaT6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)N/AEstablished by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)N/AFirst described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)N/AFirst described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)N/AEstablished by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)N/AEstablished by David Greenhald, University of Edinburgh

References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. . National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: https://nc3rs.org.uk (2021)
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. . AndOr Micropoint Manual Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021)
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. . Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Erratum


Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved