Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Zusammenfassung

Zebrafischlarven besitzen bereits wenige Tage nach der Befruchtung ein voll funktionsfähiges Zentralnervensystem (ZNS) mit hoher Regenerationsfähigkeit. Dies macht dieses Tiermodell sehr nützlich für die Untersuchung von Rückenmarksverletzungen und Regeneration. Das Standardprotokoll zur Induktion solcher Läsionen besteht darin, den dorsalen Teil des Rumpfes manuell zu transektieren. Diese Technik erfordert jedoch ein umfangreiches Training und schädigt zusätzliches Gewebe. Es wurde ein Protokoll für laserinduzierte Läsionen entwickelt, um diese Einschränkungen zu umgehen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und Vollständigkeit der Rückenmarkstransektion bei vielen Tieren und zwischen verschiedenen Sitzungen ermöglicht, selbst für einen ungeschulten Bediener. Darüber hinaus sind Gewebeschäden hauptsächlich auf das Rückenmark selbst beschränkt, wodurch verwirrende Effekte durch die Verletzung verschiedener Gewebe, z. B. Haut, Muskeln und ZNS, verringert werden. Darüber hinaus sind Hemi-Läsionen des Rückenmarks möglich. Die verbesserte Erhaltung der Gewebeintegrität nach einer Laserverletzung erleichtert weitere Dissektionen, die für zusätzliche Analysen wie die Elektrophysiologie erforderlich sind. Daher bietet diese Methode eine präzise Kontrolle des Verletzungsausmaßes, die manuell nicht erreichbar ist. Dies ermöglicht neue experimentelle Paradigmen in diesem mächtigen Modell in der Zukunft.

Einleitung

Im Gegensatz zu Säugetieren können Zebrafische (Danio rerio) nach einer Verletzung ihr zentrales Nervensystem (ZNS) ^reparieren1. Die Verwendung von Zebrafischlarven als Modell für die Rückenmarksregeneration ist relativ neu. Es hat sich als wertvoll erwiesen, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Reparatur zugrunde ^liegen2. Dies liegt an der einfachen Manipulation, dem kurzen Experimentierzyklus (jede Woche neue Larven), der optischen Transparenz des Gewebes und der geringen Größe der Larven, die sich ideal für die In-vivo-Fluoreszenzmikroskopie eignet.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des britischen Innenministeriums und gemäß seinen Vorschriften unter der Projektlizenz PP8160052 durchgeführt. Das Projekt wurde vom University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Für experimentelle Analysen wurden Zebrafischlarven, die bis zu 5 Tage alt sind, beiderlei Geschlechts der folgenden verfügbaren transgenen Linien verwendet: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) und Tg(mnx1:gfp) (siehe Zusatzdatei 1 zur Erzeugung der transgenen Zebrafischlinien). Ein Schema des Protokolls unter Verwendung der automatisier....

Ergebnisse

Validierung der Rückenmarkstransektion
Es wurden strukturelle und funktionelle Untersuchungen durchgeführt, um zu beurteilen, ob das Protokoll eine vollständige Rückenmarkstransektion zulässt.

Erstens, um zu überprüfen, ob der Verlust der Fluoreszenz an der Läsionsstelle auf neuronale Gewebeschäden und nicht auf Fluoreszenz-Photobleichen durch die Laserbeleuchtung zurückzuführen war, wurde eine Immunfärbung mit einem Antikörper gegen acetyliertes Tubulin (siehe.......

Diskussion

Es besteht ein dringender Bedarf an einem tieferen Verständnis der Prozesse, die während der Regeneration in Zebrafischen ablaufen. Dieses Tiermodell bietet viele Vorteile für die biomedizinische Forschung, insbesondere für Rückenmarksverletzungen1^. Die meisten Studien beinhalten manuelle Läsionen, die einen gut ausgebildeten Bediener erfordern und Multigewebeschäden verursachen. Hier wird ein Laserläsionsprotokoll vorgestellt, das die Kontrolle über die Läsionseigenschaften und die Verr.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0	Carl Zeiss
ImageJ/FIJI	Open-Source
Visual Studio Code	Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope	Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens	Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras	Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880	Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1	Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1	Carl Zeiss
UV laser	Micropoint
VAST BioImager	Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish	Thermo-Fisher	101R20
96-well plate	Corning	3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040
phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488	Jackson	703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3	Jackson	715-165-150
Mouse anti-GFP	Abcam	AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody	Sigma	T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)		N/A	First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)		N/A	First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)		N/A	Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh