Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Zusammenfassung

Zebrafischlarven besitzen bereits wenige Tage nach der Befruchtung ein voll funktionsfähiges Zentralnervensystem (ZNS) mit hoher Regenerationsfähigkeit. Dies macht dieses Tiermodell sehr nützlich für die Untersuchung von Rückenmarksverletzungen und Regeneration. Das Standardprotokoll zur Induktion solcher Läsionen besteht darin, den dorsalen Teil des Rumpfes manuell zu transektieren. Diese Technik erfordert jedoch ein umfangreiches Training und schädigt zusätzliches Gewebe. Es wurde ein Protokoll für laserinduzierte Läsionen entwickelt, um diese Einschränkungen zu umgehen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und Vollständigkeit der Rückenmarkstransektion bei vielen Tieren und zwischen verschiedenen Sitzungen ermöglicht, selbst für einen ungeschulten Bediener. Darüber hinaus sind Gewebeschäden hauptsächlich auf das Rückenmark selbst beschränkt, wodurch verwirrende Effekte durch die Verletzung verschiedener Gewebe, z. B. Haut, Muskeln und ZNS, verringert werden. Darüber hinaus sind Hemi-Läsionen des Rückenmarks möglich. Die verbesserte Erhaltung der Gewebeintegrität nach einer Laserverletzung erleichtert weitere Dissektionen, die für zusätzliche Analysen wie die Elektrophysiologie erforderlich sind. Daher bietet diese Methode eine präzise Kontrolle des Verletzungsausmaßes, die manuell nicht erreichbar ist. Dies ermöglicht neue experimentelle Paradigmen in diesem mächtigen Modell in der Zukunft.

Einleitung

Im Gegensatz zu Säugetieren können Zebrafische (Danio rerio) nach einer Verletzung ihr zentrales Nervensystem (ZNS) ^reparieren1. Die Verwendung von Zebrafischlarven als Modell für die Rückenmarksregeneration ist relativ neu. Es hat sich als wertvoll erwiesen, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Reparatur zugrunde ^liegen2. Dies liegt an der einfachen Manipulation, dem kurzen Experimentierzyklus (jede Woche neue Larven), der optischen Transparenz des Gewebes und der geringen Größe der Larven, die sich ideal für die In-vivo-Fluoreszenzmikroskopie eignet.

Im Falle der Rückenmarksregeneration sind zwei weitere Vorteile der Verwendung von Larven die Geschwindigkeit der Genesung, einige Tage im Vergleich zu einigen Wochen für Erwachsene, und die Leichtigkeit, Verletzungen mit manuellen Techniken zu induzieren. Dies wurde in vielen ^Studien3,4,5, einschließlich neuerer ^{Untersuchungen6,7,} erfolgreich eingesetzt. Insgesamt führt dies zu einer erhöhten aussagekräftigen Datenproduktion, einer hohen Anpassungsfähigkeit experimenteller Protokolle und geringeren experimentellen Kosten. Die Verwendung von Larven, die jünger als 5 Tage nach der Befruchtung sind, reduziert auch den Einsatz von Tieren nach den 3R-Prinzipien in ^{Tierversuchen8}.

Nach einer Rückenmarksverletzung in Zebrafischlarven treten viele biologische Prozesse auf, darunter Entzündungsreaktion, Zellproliferation, Neurogenese, Migration überlebender oder neu erzeugter Zellen, Reformation funktioneller Axone und eine globale Umgestaltung neuronaler Prozessschaltkreise und Wirbelsäulengewebe6,7,9,10 . Um erfolgreich orchestriert zu werden, beinhalten diese Prozesse eine fein regulierte Interaktion zwischen einer Reihe von Zelltypen, extrazellulären Matrixkomponenten und biochemischen ^{Signalen11,12}. Die Entschlüsselung der Details dieser signifikanten Reorganisation eines komplexen Gewebes wie des Rückenmarks erfordert die Verwendung und Entwicklung präziser und kontrollierter experimenteller Ansätze.

Das primäre experimentelle Paradigma, das zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischen verwendet wird, besteht darin, chirurgische Mittel zu verwenden, um Gewebeschäden durch Resektion, Stechen oder Kryoverletzungen zu ^{induzieren3,13.} Diese Ansätze haben den Nachteil, dass sie eine spezifische Ausbildung in mikrochirurgischen Fähigkeiten erfordern, was für jeden neuen Bediener zeitaufwendig ist und ihre Verwendung in kurzfristigen Projekten verhindern kann. Darüber hinaus induzieren sie in der Regel Schäden am umgebenden Gewebe, die die Regeneration beeinflussen können.

Ein anderer Ansatz besteht darin, Zellschäden chemisch zu induzieren14 oder durch genetische ^{Manipulationen15.} Letzteres ermöglicht einen sehr gezielten Schaden. Eine solche Technik erfordert jedoch lange Vorarbeiten, um neue transgene Fische zu erzeugen, bevor ein Experiment durchgeführt wird, das jedes Mal erneuert wird, wenn ein einzigartiger Zelltyp ins Visier genommen wird.

Es besteht daher die Notwendigkeit einer Methode, die gezielte, aber vielseitige Läsionen ermöglicht, die für eine Vielzahl von Studien zur Regeneration geeignet sind. Eine Lösung besteht darin, einen Laser zu verwenden, um lokalisierte Schäden im interessierenden Gewebe zu induzieren16,17,18,19,20. Tatsächlich stellt die Verwendung von laserinduzierten Gewebeschäden einen robusten Ansatz zur Erzeugung von Rückenmarksläsionen mit vielen Vorteilen dar. Die mit solchen Lasermanipulationsmodulen ausgestatteten Mikroskope ermöglichen die Angabe eines kundenspezifisch geformten Bereichs, in dem die Zellablation stattfinden wird, mit dem zusätzlichen Vorteil der zeitlichen Kontrolle. Die Größe und Position der Läsion kann so angepasst werden, um eventuelle Fragen zu beantworten.

Das fehlende Merkmal der meisten Laserläsionssysteme ist die Möglichkeit, Verletzungen auf hochgradig reproduzierbare Weise für eine Reihe von Larven zu induzieren. Hier wird ein Originalprotokoll unter Verwendung eines UV-Lasers beschrieben, um halbautomatische, präzise und kontrollierte Läsionen in Zebrafischlarven zu induzieren, die auf einer mikrofluidischen Plattform basieren, die für die automatisierte Larvenhandhabung entwickelt ^wurde21. Darüber hinaus werden in dem hier vorgestellten System Larven in eine Glaskapillare eingeführt, die eine freie Rotation des Tieres um seine rostrocaudale Achse ermöglicht. Der Benutzer kann wählen, welche Seite der Larve dem Laser präsentiert werden soll, während die Fluoreszenzbildgebung den Laserstrahl präzise anvisieren und den Schaden nach der Läsion beurteilen kann.

Das hier beschriebene Protokoll wird mit einem halbautomatischen Zebrafischlarven-Bildgebungssystem in Kombination mit einer sich drehenden Scheibe verwendet, die mit einem UV-Laser ausgestattet ist (im Folgenden als VAST-System bezeichnet). Die Hauptpunkte des Protokolls und die meisten Ansprüche der Technik gelten jedoch für jedes System, das mit einem Laser ausgestattet ist, der zur Zellablation fähig ist, einschließlich Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopen, Spinnscheibenmikroskopen, die mit einem UV-Laser (FRAP-Modul) ausgestattet sind, oder Videomikroskope mit einem Lasermodul zur Fotomanipulation. Einer der Hauptunterschiede zwischen dem VAST-System und der konventionellen Probenhandhabung besteht darin, dass für letzteres die Montage von Larven in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt auf Glasabdeckungen / Petrischalen mit Glasboden erforderlich ist, anstatt sie in eine 96-Well-Platte zu laden.

Die Vorteile, die diese Methode bietet, eröffnen Möglichkeiten für innovative Forschungen zu den zellulären und molekularen Mechanismen während des Regenerationsprozesses. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Datenqualität quantitative Untersuchungen in einem multidisziplinären Kontext.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des britischen Innenministeriums und gemäß seinen Vorschriften unter der Projektlizenz PP8160052 durchgeführt. Das Projekt wurde vom University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Für experimentelle Analysen wurden Zebrafischlarven, die bis zu 5 Tage alt sind, beiderlei Geschlechts der folgenden verfügbaren transgenen Linien verwendet: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) und Tg(mnx1:gfp) (siehe Zusatzdatei 1 zur Erzeugung der transgenen Zebrafischlinien). Ein Schema des Protokolls unter Verwendung der automatisierten Zebrafischlarven-Handling-Plattform ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle benutzerdefinierten Software, Skripte und detaillierten experimentellen Protokolle, die in dieser Arbeit verwendet werden, sind unter https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ verfügbar.

1. Probenvorbereitung

1. Um 5 Uhr nach der Befruchtung die Embryonen nach dem richtigen Entwicklungsstadium ^sortieren21. Verwerfen Sie tote Eier und schlecht entwickelte und überentwickelte Embryonen.
2. 3 Tage nach der Befruchtung (dpf) werden die Larven betäubt, indem Sie 2 ml 0,4% Aminobenzoesäure-ethylmethylester zu 50 ml Fischpflanzenwasser in einer 90 mm Petrischale hinzufügen. Verwenden Sie Tiere, die mit Phenylthioharnstoff (PTU) (siehe Materialtabelle) aufgezogen wurden, um Hautpigmentierung zu verhindern, wenn es sich um ein Problem handelt, was bei Rückenmarksverletzungen bei 3 DPF-Larven, die in diesem Protokoll beschrieben sind, nicht der Fall ist.
   HINWEIS: Diese relativ hohe Anästhesiekonzentration wird verwendet, um Bewegungen der Larven nach dem Lasereinschlag zu verhindern.
3. Untersuchen Sie die Embryonen auf fluoreszierende Reporterexpression (Zusatzdatei 1).
   HINWEIS: Ein fluoreszierender Reporter für das Rückenmark (oder eine andere interessante Struktur) ist oft erforderlich, um die Effizienz der Verletzung zu beurteilen. Die Verwendung von tg (Xla.Tubb: DsRed) hilft, das Rückenmark zu identifizieren.
4. Übertragen Sie die ausgewählten Larven in eine 96-Well-Platte für den Einsatz im VAST-System (siehe Materialtabelle) mit 300 μL Fischanlagenwasser pro Bohrloch. Verwenden Sie das Medium, das das Anästhetikum enthält, direkt aus der 90-mm-Petrischale. Stellen Sie sicher, dass Sie nur eine Larve pro Brunnen haben. Bereiten Sie eine zusätzliche leere 96-Well-Platte vor, um die läsionierten Larven zu sammeln.
   HINWEIS: Wenn Sie ein anderes Laserläsionssystem verwenden, montieren Sie die Larven in 1% Low-Melting Point (LMP) Agarosegel in einer geeigneten Beobachtungskammer.

2. Vorbereitung des Mikroskops

1. Schalten Sie alle Systemkomponenten (VAST, Mikroskop, Laser, PC) ein, einschließlich des Lasers für die Ablation.
2. Sobald die Hardware vollständig initialisiert ist, starten Sie die Mikroskopsoftware ImageJ / Fiji, eine integrierte Python-Entwicklungsumgebung (IDE) und die automatisierte Zebrafisch-Bildgebungssoftware (VAST-System), wenn Sie diese Plattform verwenden (siehe Materialtabelle).
3. Richten Sie die VAST-Software mit den folgenden Schritten ein.
   1. Wenn die VAST-Software gestartet wird, wählen Sie im ersten Fenster Platte und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig (Abbildung 2A). Ein weiteres kleines Fenster wird auftauchen und fragen, ob die Kapillare leer und sauber ist. Überprüfen Sie, indem Sie sich das Bild der Kapillare ansehen, ob sich darin Luftblasen befinden. Wenn nicht, klicken Sie auf Ja. Wenn Blasen vorhanden sind, klicken Sie auf Nein und folgen Sie den Schritten 2.3.2-2.3.3 (Abbildung 2B).
   2. Klicken Sie im Fenster Large Particle (LP) Sampler auf Prime , um Luftblasen zu entfernen (Abbildung 2C).
   3. Gehen Sie zum Hauptfenster der Software (mit dem Kapillarbild) und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild. Wählen Sie im Popupmenü die Option "Leeres Kapillarbild aufzeichnen " (Abbildung 2B).
   4. Gehen Sie im LP Sampler-Fenster zum Menü Datei und wählen Sie die Option Skript öffnen . Wählen Sie eine Datei aus, die das Skript enthält, das dem auszuführenden Experiment entspricht.
   5. Gehen Sie im Hauptfenster der VAST-Software zu Datei und wählen Sie Open Experiment. Wählen Sie die Experimentdatei aus, die dem geplanten Experiment entspricht.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kontrollkästchen Automatische Entladung und Massenausgabe an Abfall NICHT aktiviert sind.
4. Richten Sie die Mikroskopsoftware für die Bildgebung ein.
   1. Starten Sie die Mikroskop-Imaging-Software (siehe Materialtabelle), um die Hardware zu initialisieren. Dies kann je nach System einige Minuten dauern.
   2. Gehen Sie zu den Erfassungseinstellungen und richten Sie das Mikroskop für die Abbildung des in den Larven exprimierten Fluorophors ein. Verwenden Sie ein 10x NA 0,5 Wassertauchobjektiv, um sicherzustellen, dass das Fokusvolumen entlang der optischen Achse ausreichend verlängert ist, um die gesamte Tiefe des Rückenmarks oder des Zielgewebes zu läsionieren.
5. Richten Sie ImageJ/Fiji für Laser-Läsionen ein.
   1. Gehen Sie zum Menü Datei und wählen Sie Neu/Skript , um das Skriptfenster zu öffnen.
   2. Gehen Sie im Fenster Neu zum Menü Datei und wählen Sie Öffnen , um das Laserläsionsskript (Manual_MP_Operation.ijm) zu laden.
6. Richten Sie die Python-IDE ein.
   1. Starten Sie die Python-IDE.
   2. Gehen Sie zum Menü Datei und wählen Sie Datei öffnen , um das Skript zur Verwaltung des Lasers zu laden (Watch_for_ROIs_py3.py).
   3. Wechseln Sie zum Menü Ausführen , und wählen Sie Ohne Debuggen ausführen aus, um das Skript auszuführen. Stellen Sie sicher, dass eine Abfolge von Meldungen im Bedienfeld "TERMINAL" zusammen mit etwas Rauschen angezeigt wird, während das Laserdämpfungsglied initialisiert wird (Abbildung 2D).

3. Laserläsionen auf dem VAST-System durchführen

1. Zentrieren Sie die Kapillare relativ zum Mikroskopobjektiv, indem Sie die Bühne bewegen, indem Sie auf die Pfeiltasten im Hauptfenster der VAST-Software klicken (Abbildung 2B).
2. Konzentrieren Sie sich auf die Oberseite der Kapillare, indem Sie durch die Okulare schauen und das Durchlicht des Mikroskops verwenden.
   VORSICHT: Die Kapillare ist sehr zerbrechlich und kann brechen, wenn sie vom Ziel berührt wird. Bewegen Sie den Mikroskopknopf langsam, wenn Sie ein- und ausfokussieren.
3. Legen Sie die 96-Well-Platten auf den Plattenhalter des LP Samplers des VAST-Systems. Legen Sie die Platte mit Larven auf den linken Halter und die Platte zur Sammlung auf die rechte. Stellen Sie sicher, dass die Platten richtig ausgerichtet sind: Der A1-Brunnen muss sich in der vorderen linken Ecke der Halterung befinden.
4. Klicken Sie in der VAST-Software im LP Sampler-Fenster auf die Schaltfläche Plate Template und wählen Sie alle Wells aus, die Larven enthalten. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um das Fenster zu validieren und zu schließen (Abbildung 2C).
5. Klicken Sie im LP Sampler-Fenster auf die Schaltfläche Run Plate , um das Laden einer Larve zu starten.
   HINWEIS: Nach einiger Zeit sollte die Larve in der Kapillare an der Position sichtbar sein (vordefiniert in der Experimentdefinitionsdatei), so dass das Rückenmark verletzt werden kann. Das VAST-Tablettlicht schaltet sich nach einigen Umdrehungen aus, um die Larve mit der seitlichen Seite zum Mikroskopobjektiv zu bringen.
6. Gehen Sie zur Mikroskopsoftware und klicken Sie auf die Schaltfläche Live, um die Larve abzubilden.
7. Drehen Sie den Fokusknopf des Mikroskops, bis der zentrale Kanal des Rückenmarks sichtbar ist.
   HINWEIS: Es kann einfacher sein, zuerst mit Durchlicht zu fokussieren und dann mit Fluoreszenz zu verfeinern.
8. Machen Sie einen Schnappschuss in Fluoreszenz und speichern Sie das Bild in einem dedizierten Ordner.
9. Öffnen Sie das Bild in ImageJ und passen Sie den Kontrast bei Bedarf an (über das Menü Bild/Anpassen/Helligkeit/Kontrast... in ImageJ).
10. Klicken Sie auf das ROI-Linienwerkzeug (Region of Interest) und zeichnen Sie eine kurze Linie (20 μm), die auf dem Rückenmark zentriert ist (Abbildung 3A).
11. Schalten Sie das Mikroskop auf die 100% reflektierende Spiegelposition.
12. Laden Sie das ImageJ-Skript und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen . Verwenden Sie die folgenden Parameter: Wiederholung - 2; Beispiel - 1; Breite - 40 Mikron; Dämpfung - 89 (Volle Laserleistung) (Abbildung 3C).
13. Wenn die Laserschusssequenz beendet ist, wechseln Sie in der Bildgebungssoftware zur Fluoreszenzbildgebung und passen Sie den Fokus bei Bedarf an.
    HINWEIS: Eine Verschiebung des Fokus wird häufig aufgrund einer Schweifverschiebung während der Laserbelichtung beobachtet.
14. Machen Sie einen neuen Schnappschuss und speichern Sie ihn.
15. Öffnen Sie dieses neue Bild in ImageJ und zeichnen Sie eine neue Linie, die größer als das Rückenmark selbst sein sollte (~ 80 μm), beginnend unter der ventralen Seite des Rückenmarks im oberen Teil des Notochords und in Richtung der dorsalen Seite, um im Raum zwischen dem Rückenmark und der Haut zu enden (Abbildung 3B).
16. Schalten Sie das Mikroskop auf die 100% reflektierende Spiegelposition.
17. Gehen Sie zum ImageJ-Skriptfenster und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen . Verwenden Sie die folgenden Parameter: Wiederholung - 2; Beispiel - 1; Breite - 40 Mikrometer; Dämpfung - 89 (Volle Laserleistung).
18. Nachdem die (längere) Laserschusssequenz abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Transsektionsqualität, indem Sie Fluoreszenz und Fokussierung abbilden. Stellen Sie sicher, dass keine Zellen oder Axone in der Läsionsstelle intakt bleiben, die als dunkler oder als schwacher und homogener fluoreszierender Bereich erscheinen sollte (Abbildung 3D, unteres Feld).
19. Sammeln Sie die läsionierten Larven in die leere 96-Well-Platte (mit den gleichen Well-Koordinaten wie die des ursprünglichen Wells), indem Sie zum VAST-Hauptsoftwarefenster gehen und auf die Schaltfläche Collect klicken.
20. Schalten Sie die VAST-Systemleuchte wieder ein, indem Sie auf das Kontrollkästchen Tray Light unten links im Fenster klicken.
21. Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.17 für jede neue Larve, die verletzt werden soll.

4. Handhabung nach der Läsion und zusätzliche Experimente

1. Nehmen Sie die Larven so schnell wie möglich von der 96-Well-Platte und geben Sie sie in eine saubere Petrischale mit frischem Fischanlagenwasser, damit sich die Larven nach der Läsion erholen können. Die Petrischale bei 28 °C in einen Inkubator stellen.
   HINWEIS: Der Schaden breitet sich oft in der ersten Stunde nach der Läsion weiter aus. Das tatsächliche Ausmaß der Läsion sollte daher nach einer Verzögerung von ca. 1 h mittels Fluoreszenzbildgebung beurteilt werden.

5. Fehlerbehebung

1. Wenn Luftblasen in den Röhrchen und Kapillaren des VAST-Systems vorhanden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Prime im LP Sampler-Fenster, um sie zu entfernen.
2. Betrachten Sie die erfolglosen Läsionen (beurteilt anhand der verbleibenden Fluoreszenz in der Läsionsstelle, abgesehen von dem erwarteten Rest- und homogenen Hintergrund), die auf mehrere unten genannte Gründe zurückzuführen sein können.
   1. Geringe Laserleistung: Versuchen Sie es in diesem Fall mit einem höheren Wert.
      HINWEIS: Das VAST-System ist mit einem Farbstofflaser ausgestattet. Dies bedeutet, dass sich die Konzentration der Farbstofflösung, die für die Laserlichterzeugung verwendet wird, mit der Zeit ändern kann, was zu einer Abnahme der Laserleistung führt. Der Ersatz durch eine neue Lösung löst in der Regel das ^Problem22.
   2. Schlechte Kalibrierung: Überprüfen Sie in diesem Fall die Kalibrierung und Leistung des Lasersystems gemäß Schritt 5.2.2.1-5.2.2.4. Wenn der Laser nicht richtig kalibriert ist, wird er nicht an die gewünschte Stelle gerichtet, was zu erfolglosen Läsionen oder unerwünschten Schäden in benachbarten Geweben führt.
      1. Legen Sie einen Spiegelträger auf die Kapillarkammer. Konzentrieren Sie sich auf die beschichtete Seite (sie sollte dem Ziel zugewandt sein). Verwenden Sie eine vorherige Standardeinstellung in der Folie, um die Fokussierung zu vereinfachen.
      2. Wenden Sie ein Muster der Laserablation mit einem Kalibrierskript an.
      3. Beurteilen Sie die Qualität des Musters. Die Flecken oder Linien sollten scharf und nicht verschwommen erscheinen.
      4. Verwenden Sie eine Rampe mit steigender Leistung, um zu bewerten, ob sich die Laserleistung im Vergleich zu den vorherigen Sitzungen geändert hat.
   3. Larvenbewegung während Läsionen: Larven reagieren unterschiedlich auf Anästhesie; So kann die Laserläsion während des Prozesses Bewegungen des Schwanzes auslösen und so eine erfolgreiche Durchtrennung verhindern. Wenn dies geschieht, nehmen Sie eine zusätzliche Iteration der Laserläsionsschritte vor, um es abzuschließen und gleichzeitig Schäden am umgebenden Gewebe zu vermeiden.
   4. Schlechter Fokus: Wenn dies geschieht, konzentrieren Sie sich auf die Mitte des zentralen Kanals, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
   5. ROI-Zeichnung, Position und Größe: Die Position und Größe des ROI sind entscheidend für erfolgreiche Durchschnitte. Der ROI sollte größer als das Rückenmark sein und auf der Mitte des Rückenmarks zentriert sein. Um dies zu lösen, beginnen Sie, den ROI von der ventralen Seite des Rückenmarks zu ziehen und gehen Sie auf die dorsale Seite, um eine erfolgreiche Transsektion zu erhalten. Dies ist wahrscheinlich auf Schwanzbewegungen zurückzuführen, die durch die Abfolge von Laserschüssen während des Ablationsverfahrens ausgelöst werden.

Ergebnisse

Validierung der Rückenmarkstransektion
Es wurden strukturelle und funktionelle Untersuchungen durchgeführt, um zu beurteilen, ob das Protokoll eine vollständige Rückenmarkstransektion zulässt.

Erstens, um zu überprüfen, ob der Verlust der Fluoreszenz an der Läsionsstelle auf neuronale Gewebeschäden und nicht auf Fluoreszenz-Photobleichen durch die Laserbeleuchtung zurückzuführen war, wurde eine Immunfärbung mit einem Antikörper gegen acetyliertes Tubulin (siehe...

Diskussion

Es besteht ein dringender Bedarf an einem tieferen Verständnis der Prozesse, die während der Regeneration in Zebrafischen ablaufen. Dieses Tiermodell bietet viele Vorteile für die biomedizinische Forschung, insbesondere für Rückenmarksverletzungen1^. Die meisten Studien beinhalten manuelle Läsionen, die einen gut ausgebildeten Bediener erfordern und Multigewebeschäden verursachen. Hier wird ein Laserläsionsprotokoll vorgestellt, das die Kontrolle über die Läsionseigenschaften und die Verr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0	Carl Zeiss
ImageJ/FIJI	Open-Source
Visual Studio Code	Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope	Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens	Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras	Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880	Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1	Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1	Carl Zeiss
UV laser	Micropoint
VAST BioImager	Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish	Thermo-Fisher	101R20
96-well plate	Corning	3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040
phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488	Jackson	703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3	Jackson	715-165-150
Mouse anti-GFP	Abcam	AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody	Sigma	T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)		N/A	First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)		N/A	First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)		N/A	Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh