ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

要約

本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。

要約

ゼブラフィッシュの幼虫は、受精後わずか数日後に高い再生能力を有する完全に機能する中枢神経系(CNS)を有する。これにより、この動物モデルは脊髄損傷および再生の研究に非常に有用である。このような病変を誘導するための標準的なプロトコルは、体幹の背部を手動で通過させることである。しかしながら、この技術は広範な訓練を必要とし、追加の組織に損傷を与える。レーザー誘発病変がこれらの制限を回避するためのプロトコルが開発され、訓練を受けていないオペレータであっても、多くの動物上および異なるセッション間での脊髄切除の高い再現性と完全性を可能にした。さらに、組織損傷は、主に脊髄自体に限定され、異なる組織、例えば皮膚、筋肉、およびCNSを損傷することによる交絡効果を減少させる。さらに、脊髄の半血病変が可能である。レーザー損傷後の組織の完全性の保存を改善することで、電気生理学などの追加の分析に必要なさらなる解剖が容易になります。したがって、この方法は、手動では達成できない傷害程度の正確な制御を提供する。これにより、将来、この強力なモデルで新しい実験パラダイムが可能になります。

概要

哺乳類とは対照的に、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は怪我をした後、中枢神経系(CNS)を修復することができます¹。脊髄再生のモデルとしてのゼブラフィッシュ幼虫の使用は比較的最近のことである。修復の根底にある細胞および分子のメカニズムを調査することは有益であることが証明されています²。これは、操作の容易さ、短い実験サイクル(毎週新しい幼虫)、組織の光透過性、および幼虫のサイズが小さく、 in vivo 蛍光顕微鏡に理想的であるためである。

脊髄再生の場合、幼虫を使用する2つの追加の利点は、回復の速度、成人の数週間と比較して数日、および手動技術を使用して傷害を誘発することの容易さである。これは、最近の調査を含む多くの研究^3,4,5で首尾よく使用されています^6,7。全体として、これは有意義なデータ生成の増加、実験プロトコルの高い適応性、および実験コストの削減につながります。受精後5日未満の幼虫の使用はまた、動物研究における3Rの原則に従う動物の使用を減少させ^る8。

ゼブラフィッシュの幼虫の脊髄損傷後、炎症反応、細胞増殖、神経新生、生存または新たに生成された細胞の移動、機能軸索の再構築、神経プロセス回路および脊椎組織のグローバルリモデリングなど、多くの生物学的プロセスが起こる^6,7,9,10.うまくオーケストレーションされるために、これらのプロセスは、様々な細胞型、細胞外マトリックス成分、および生化学的シグナル^11、12の間の細かく調節された相互作用を伴う。脊髄のような複雑な組織のこの重要な再編成の詳細を解明するには、正確で制御された実験的アプローチの使用と開発が必要です。

ゼブラフィッシュの脊髄再生を研究するために使用される主要な実験パラダイムは、切除、刺し傷、または凍結傷害によって組織損傷を誘発するために外科的手段を使用することです^3,13。これらのアプローチには、マイクロサージャリースキルの特定のトレーニングを必要とするという欠点があり、これは新しいオペレータにとって時間がかかり、短期プロジェクトでの使用を妨げる可能性があります。さらに、それらは通常、周囲の組織に損傷を誘発し、再生に影響を与える可能性がある。

別のアプローチは、化学的に、または遺伝子操作によって細胞損傷^を 誘発することです¹⁵。後者は、高度に標的を絞ったダメージを与えます。しかしながら、このような技術は、実験を行う前に新しいトランスジェニック魚を生成するために長い準備作業を必要とし、ユニークな細胞型が標的とされるたびに更新される。

したがって、再生における様々な研究に適した標的化が多目的な病変を可能にする方法の必要性がある。解決策は、レーザーを使用して、関心のある組織に局所的な損傷を誘発することである¹⁶、^17、18、^19、20。実際、レーザー誘発組織損傷の使用は、多くの利点を有する脊髄病変を生成するための堅牢なアプローチを提示する。このようなレーザー操作モジュールを搭載した顕微鏡は、細胞アブレーションが発生するカスタマイズされた形状領域を指定することができ、時間的制御のさらなる利点があります。したがって、病変の大きさおよび位置は、あらゆる質問に対処するために適合させることができる。

ほとんどのレーザー病変系に欠けている特徴は、一連の幼虫に対して再現性の高い方法で傷害を誘発する可能性である。ここでは、自動化された幼虫処理のために設計されたマイクロ流体プラットフォームに基づいて、ゼブラフィッシュ幼虫に半自動化された正確で制御された病変を誘導するために、UVレーザーを使用してオリジナルのプロトコルが説明されています²¹。さらに、ここで提示されたシステムでは、幼虫はガラス毛細血管に挿入され、これはその吻側尾軸の周りに動物の自由回転を可能にする。ユーザーは、幼虫のどちらの側をレーザーに提示するかを選択しながら、蛍光イメージングがレーザービームを正確に標的にし、病変後の損傷を評価することを可能にすることができる。

ここで説明するプロトコルは、半自動ゼブラフィッシュ幼虫イメージングシステムと、UVレーザーを搭載したスピニングディスク(以下、VASTシステムと呼ぶ)と組み合わせて使用されます。しかしながら、プロトコルの要点および技術の主張の大部分は、2光子レーザー走査顕微鏡、UVレーザーを備えたスピニングディスク顕微鏡(FRAPモジュール)、または光操作のためのレーザーモジュールを備えたビデオ顕微鏡を含む、細胞アブレーションが可能なレーザーを搭載したあらゆるシステムに対して有効である。VASTシステムと従来のサンプル処理の主な違いの1つは、後者の場合、96ウェルプレートに積み込む代わりに、ガラスカバースリップ/ガラス底ペトリ皿に低融点アガロースに幼虫を取り付ける必要があることです。

この方法によって提供される利点は、再生プロセス中の細胞および分子メカニズムに関する革新的な研究の機会を開く。さらに、高いデータ品質により、学際的な文脈での定量的調査が可能になります。

プロトコル

すべての動物実験は、英国内務省の承認を得て、その規制に従って、プロジェクトライセンスPP8160052の下で実施されました。このプロジェクトは、エジンバラ大学機関動物管理および使用委員会によって承認されました。実験的解析のために、両性の生後5日までのゼブラフィッシュ幼虫は、以下の利用可能なトランスジェニック系統のうち、以下のトランスジェニック系統について使用した:Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)、Tg(Xla.Tubb:DsRed)、Tg(betaactin:utrophin-mCherry)、Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)、およびTg(mnx1:gfp)(トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の生成に関する 補足ファイル1 を参照)。自動ゼブラフィッシュ幼虫処理プラットフォームを用いたプロトコルの概略を 図1に示す。この作業で使用されたすべてのカスタムソフトウェア、スクリプト、および詳細な実験プロトコルは、https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ で入手できます。

1. サンプル調製

1. 受精後5時間で、正しい発生段階の胚を分類^する21。死んだ卵や、発達が遅れている胚や発達しすぎの胚を捨てる。
2. 受精後3日目(dpf)に、90mmのシャーレに50mLの魚類施設水に2mLの0.4%アミノ安息香酸-エチルメチルエステルを加えて幼虫を麻酔する。フェニルチオ尿素(PTU)で飼育された動物( 材料表を参照)を使用して、皮膚色素沈着が問題である場合、このプロトコルに記載されている3dpf幼虫の脊髄損傷には当てはまりません。
   注:この比較的高い麻酔濃度は、レーザー衝撃後の幼虫の動きを防止するために使用される。
3. 蛍光レポーター発現について胚をスクリーニングする(補足ファイル1)。
   注:脊髄(または他の目的の構造)の蛍光レポーターは、傷害の効率を評価するためにしばしば必要とされる。tg(Xla.Tubb:DsRed)の使用は、脊髄を識別するのに役立ちます。
4. 選択した幼虫を96ウェルプレートに移し、VASTシステム( 材料表を参照)で使用するために、ウェルあたり300μLの魚施設水を使用します。90mmペトリ皿の麻酔薬を含む培地を直接使用する。1つの井戸につき1匹の幼虫しか持たないようにしてください。病変した幼虫を収集するために、余分な空の96ウェルプレートを1枚準備する。
   注:別のレーザー病変システムを使用する場合は、適切な観察チャンバー内の1%低融点(LMP)アガロースゲルに幼虫をマウントします。

2. 顕微鏡の準備

1. アブレーション用のレーザーを含むすべてのシステムコンポーネント(VAST、顕微鏡、レーザー、PC)の電源を入れます。
2. ハードウェアが完全に初期化されたら、顕微鏡ソフトウェア、ImageJ/Fiji、Python統合開発環境(IDE)、およびこのプラットフォームを使用している場合は自動ゼブラフィッシュイメージング(VASTシステム)ソフトウェアを起動します( 資料表を参照)。
3. 以下の手順に従って VAST ソフトウェアをセットアップします。
   1. VAST ソフトウェアが起動したら、最初のウィンドウで [ プレート ] を選択し、[ 完了 ] ボタンをクリックします (図 2A)。別の小さな窓がポップアップし、毛細血管が空で清潔かどうかを尋ねます。キャピラリーの画像を見て、内部に気泡がないか確認します。そうでない場合は、[ はい]をクリックします。バブルがある場合は、[ いいえ ]をクリックし、手順2.3.2-2.3.3に従います(図2B)。
   2. [ラージパーティクル(LP)サンプラー]ウィンドウで、[ プライム ]をクリックして気泡を除去します(図2C)。
   3. メインのソフトウェアウィンドウ(キャピラリー画像を含む)に移動し、画像を右クリックします。ポップアップメニュー の[空の毛細血管画像を記録 ]を選択します(図2B)。
   4. LP サンプラー ウィンドウで、[ファイル] メニューに移動し、[スクリプトを開く] オプションを選択します。実行する実験に対応するスクリプトを含むファイルを選択します。
   5. VAST ソフトウェアのメイン ウィンドウで、[ ファイル ] に移動し、[ 実験を開く] を選択します。計画した実験に対応する実験ファイルを選択します。
      メモ: [自動アンロード] ボックスと [廃棄バルク出力] ボックスがチェックされていないことを確認します。
4. イメージング用の顕微鏡ソフトウェアを設定します。
   1. 顕微鏡イメージングソフトウェア( 材料表を参照)を起動して、ハードウェアを初期化します。システムによっては、この処理に数分かかる場合があります。
   2. 取得設定に移動し、幼虫に発現する蛍光色素分子をイメージングするための顕微鏡をセットアップします。10x NA 0.5水浸漬対物レンズを使用して、焦点体積が光軸に沿って十分に細長く、脊髄または標的組織の全深さを病変させるようにする。
5. レーザー病変用にImageJ/Fijiを設定します。
   1. [ファイル] メニューに移動し、[新規/スクリプト] を選択してスクリプト ウィンドウを開きます。
   2. 新規ウィンドウで、[ファイル] メニューに移動し、[開く] を選択してレーザー病変スクリプト (Manual_MP_Operation.ijm) を読み込みます。
6. Python IDE をセットアップします。
   1. Python IDE を起動します。
   2. [ファイル]メニューに移動し、[ファイルを開く]を選択して、レーザー(Watch_for_ROIs_py3.py)を管理するスクリプトをロードします。
   3. [実行] メニューに移動し、[デバッグなしで実行] を選択してスクリプトを実行します。レーザアッテネータの初期化中に、TERMINALパネルに一連のメッセージがノイズとともに表示されることを確認します(図2D)。

3. VASTシステムでのレーザー病変の検査

1. VASTソフトウェアのメインウィンドウの矢印ボタンをクリックしてステージを移動して、顕微鏡対物レンズに対してキャピラリーを中央に配置します(図2B)。
2. 接眼レンズを透視し、顕微鏡の透過光を使用して毛細血管の上部に焦点を合わせます。
   警告: 毛細血管は非常に壊れやすく、目標に触れると破損する恐れがあります。顕微鏡のつまみをゆっくりと動かして、ピントを合わせたり外したりします。
3. 96ウェルプレートをVASTシステムのLPサンプラーのプレートホルダーに置きます。幼虫を含むプレートを左側のホルダーに置き、収集用のプレートを右側に配置します。プレートの向きが正しいことを確認します。A1 ウェルはホルダーの左前隅にある必要があります。
4. VAST ソフトウェアの LP サンプラー ウィンドウで、[ プレート テンプレート] ボタンをクリックし、幼虫を含むすべてのウェルを選択します。[ OK] ボタンをクリックして検証し、ウィンドウを閉じます(図2C)。
5. LPサンプラーウィンドウで、 ランプレート ボタンをクリックして幼虫のロードを開始します。
   注:しばらくすると、幼虫は毛細血管の位置(実験定義ファイルで事前定義)に見えるようになり、脊髄を傷つけることができます。VASTトレイライトは、数回回転すると消灯し、横側が顕微鏡の対物レンズに面した幼虫を設定します。
6. 顕微鏡ソフトウェアに移動し、 ライブ ボタンをクリックして幼虫を画像化します。
7. 脊髄中央管が見えるまで顕微鏡のフォーカスノブを回します。
   注:最初に透過光を使用して焦点を合わせ、次に蛍光で精製する方が簡単です。
8. 蛍光のスナップショットを撮り、画像を専用のフォルダに保存します。
9. ImageJ で画像を開き、必要に応じてコントラストを調整します ( ImageJ の [画像/調整/明るさ/コントラスト...] メニューを使用)。
10. 関心領域(ROI)線ツールをクリックし、脊髄を中心とする短い線(20μm)を描きます(図3A)。
11. 顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。
12. ImageJスクリプトをロードし、[ 実行 ]ボタンをクリックします。次のパラメーターを使用します: 繰り返し - 2;サンプル - 1;幅 - 40ミクロン。減衰 - 89(フルレーザー出力)(図3C)。
13. レーザーショットシーケンスが終了したら、イメージングソフトウェアで蛍光イメージングに切り替え、必要に応じてフォーカスを調整します。
    注:レーザー露光中の尾部のずれにより、焦点のずれがしばしば観察されます。
14. 新しいスナップショットを作成して保存します。
15. この新しい画像をImageJで開き、脊髄自体よりも大きく(約80μm)、脊索の上部にある脊髄の腹側の下から始まり、背側に向かって脊髄と皮膚の間の空間で終わる新しい線を描きます(図3B)。
16. 顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。
17. ImageJスクリプトウィンドウに移動し、[ 実行 ]ボタンをクリックします。次のパラメーターを使用します: 繰り返し - 2;サンプル - 1;幅 - 40ミクロン。減衰 - 89(フルレーザー出力)。
18. (より長い)レーザーショットシーケンスが終了したら、蛍光をイメージングして焦点を合わせることによって、切断品質を検証します。病変部位に細胞または軸索が無傷で残っていないことを確認します(病変部位は暗く、かすかで均質な蛍光領域として表示されます(図3D、下部パネル)。
19. 病変した幼虫を空の96ウェルプレート(元のウェルと同じウェル座標)に集めるには、メインのVASTソフトウェアウィンドウに移動して [収集] ボタンをクリックします。
20. ウィンドウの左下にある [トレイ ライト] チェック ボックスをクリックして、VAST システム ライト を再びオンにします。
21. 負傷する新しい幼虫ごとにステップ3.3-3.17を繰り返します。

4. 病変後の取り扱いと追加実験

1. できるだけ早く96ウェルプレートから幼虫を取り出し、幼虫が病変後を回復するための新鮮な魚施設の水を入れたきれいなペトリ皿に移す。ペトリ皿を28°Cのインキュベーターに入れる。
   注:損傷は、しばしば病変後最初の1時間で伝播し続ける。したがって、病変の実際の程度は、約1時間の遅延後に蛍光イメージングによって評価されるべきである。

5. トラブルシューティング

1. VASTシステムのチューブやキャピラリーに気泡がある場合は、LPサンプラーウィンドウの プライム ボタンをクリックして取り除きます。
2. 失敗した病変(予想される残留および均質なバックグラウンドとは別に、病変部位の残りの蛍光から評価される)を考慮すると、これは以下に述べるいくつかの理由に起因する可能性がある。
   1. 低レーザー出力: このような場合は、より高い値で試してください。
      注: VAST システムには色素レーザーが装備されています。これは、レーザー光生成に使用される色素溶液の濃度が時間とともに変化し、レーザー出力の低下につながる可能性があることを意味します。通常、新しいソリューションに置き換えると、問題が解決されます²²。
   2. 不十分なキャリブレーション:このような場合は、ステップ5.2.2.1-5.2.2.4に従ってレーザーシステムのキャリブレーションとパワーを確認します。正しく較正されない場合、レーザーは所望の位置に向けられず、したがって、隣接する組織において病変が失敗または望ましくない損傷をもたらす。
      1. キャピラリーチャンバーの上にミラースライドを置きます。コーティングされた側に焦点を合わせます(目標に面している必要があります)。スライドの前の既定値を使用して、フォーカスをより簡単にします。
      2. キャリブレーションスクリプトを使用してレーザーアブレーションのパターンを適用します。
      3. パターンの品質を評価します。斑点や線は鮮明に見え、ぼやけてはいけません。
      4. 出力が増大したランプを使用して、レーザー出力が前のセッションと比較して変化したかどうかを評価します。
   3. 病変中の幼虫の動き:幼虫は麻酔に対して異なる反応を示す。したがって、レーザー病変は、プロセス中に尾の動きを誘発し、したがって、正常な切断を妨げる可能性がある。これが起こったら、周囲の組織への損傷を避けながら、レーザー病変ステップをさらに繰り返して完了させます。
   4. 焦点が悪い: これが発生した場合は、最良の結果を得るために中央運河の中央に焦点を合わせます。
   5. ROIの描画、位置、サイズ: ROIの位置とサイズは、トランセクションを成功させるために重要です。ROIは脊髄よりも大きく、脊髄の中心を中心とすべきである。これを解決するには、脊髄の腹側からROIを引き出し始め、背側に向かって上昇して解剖を成功させます。これは、アブレーション処置中のレーザーショットのシーケンスによって引き起こされる尾の動きによる可能性が高い。

結果

脊髄切除の検証
プロトコールが完全な脊髄切除を可能にするかどうかを評価するために、構造的および機能的調査が実施された。

まず、病変部位における蛍光の消失がレーザー照射による蛍光ではなく神経組織損傷によるものであることを確認するために、アセチル化チューブリンに対する抗体を用いた免疫染色( 材料表 及び 補足資料...

ディスカッション

ゼブラフィッシュの再生中に作用するプロセスのより深い理解が緊急に必要とされています。この動物モデルは、生物医学研究、特に脊髄損傷に多くの利点をもたらします¹。ほとんどの研究は、十分に訓練されたオペレータを必要とし、多組織損傷を誘発する手動病変を含む。レーザー病変プロトコルがここに提示され、病変特性を制御し、周囲の組織への損傷を低減する...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0	Carl Zeiss
ImageJ/FIJI	Open-Source
Visual Studio Code	Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope	Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens	Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras	Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880	Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1	Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1	Carl Zeiss
UV laser	Micropoint
VAST BioImager	Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish	Thermo-Fisher	101R20
96-well plate	Corning	3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040
phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488	Jackson	703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3	Jackson	715-165-150
Mouse anti-GFP	Abcam	AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody	Sigma	T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)		N/A	First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)		N/A	First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)		N/A	Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh