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摘要

本方案描述了一种使用激光损伤系统结合用于幼体处理的自动微流体平台在斑马鱼幼体中诱导组织特异性和高度可重复损伤的方法。

摘要

斑马鱼幼虫在受精后仅几天就具有功能齐全的中枢神经系统（CNS），具有很高的再生能力。这使得这个动物模型对于研究脊髓损伤和再生非常有用。诱导此类病变的标准方案是手动横切躯干的背侧部分。然而，这种技术需要广泛的训练并损害额外的组织。为激光诱导的病变开发了一种方案，以规避这些限制，允许许多动物和不同会话之间的脊髓切除具有高可重复性和完整性，即使对于未经培训的操作员也是如此。此外，组织损伤主要局限于脊髓本身，减少了损伤不同组织（例如皮肤，肌肉和中枢神经系统）的混杂效应。此外，脊髓的半病变是可能的。改善激光损伤后组织完整性的保留有助于进一步解剖其他分析所需的进一步解剖，例如电生理学。因此，这种方法可以精确控制手动无法实现的伤害程度。这允许将来在这个强大的模型中出现新的实验范式。

引言

与哺乳动物相比，斑马鱼（Danio rerio）可以在受伤后修复中枢神经系统（CNS）1。使用斑马鱼幼虫作为脊髓再生的模型是相对较新的。事实证明，研究修复背后的细胞和分子机制很有价值2。这是由于易于操作，实验周期短（每周有新的幼虫），组织的光学透明度和幼虫的小尺寸，非常适合 体内 荧光显微镜检查。

在脊髓再生的情况下，使用幼虫的另外两个优点是恢复速度，与成人几周相比，几天，以及使用手动技术诱导损伤的容易程度。这已成功用于许多研究3，4，5，包括最近的调查6，7。总体而言，这导致有意义的数据生产增加，实验方案的高适应性以及实验成本的降低。在受精后5天内使用幼虫也减少了动物研究中遵循3R原则的动物的使用8。

斑马鱼幼虫脊髓损伤后，会发生许多生物过程，包括炎症反应、细胞增殖、神经发生、存活或新生成细胞的迁移、功能轴突的重整以及神经过程回路和脊柱组织的全局重塑6，7，9，10.为了成功编排，这些过程涉及一系列细胞类型，细胞外基质成分和生化信号之间的精细调节相互作用11，12。解开脊髓等复杂组织这种重大重组的细节需要使用和开发精确和受控的实验方法。

用于研究斑马鱼脊髓再生的主要实验范例是使用手术手段通过切除，刺伤或冷冻损伤诱导组织损伤3，13。这些方法的缺点是需要对显微外科技能进行特定培训，这对于任何新操作员来说都是耗时的，并且可能会阻止它们在短期项目中使用。此外，它们通常会对周围组织造成损害，这可能会影响再生。

另一种方法是化学诱导细胞损伤14 或通过遗传操作15。后者允许高度针对性的伤害。然而，这种技术需要长时间的准备工作来产生新的转基因鱼，然后再进行任何实验，每次靶向独特的细胞类型时都要更新。

因此，需要一种方法，允许适合各种再生研究中的靶向但多功能的病变。解决方案是使用激光在感兴趣的组织中诱导局部损伤16，17，18，19，20。事实上，使用激光诱导的组织损伤为产生脊髓病变提供了一种具有许多优点的可靠方法。配备这种激光操作模块的显微镜允许指定将发生细胞消融的定制形状区域，并具有时间控制的额外好处。因此，可以调整病变的大小和位置以解决任何问题。

大多数激光病变系统缺少的特征是有可能以高度可重复的方式诱导一系列幼虫的损伤。本文描述了一种原始方案，使用紫外激光，基于专为自动幼虫处理而设计的微流体平台，在斑马鱼幼虫中诱导半自动精确和受控的病变21。此外，在这里介绍的系统中，幼虫入玻璃毛细管中，这允许动物围绕其尾部轴自由旋转。用户可以选择将幼虫的哪一侧呈现给激光，同时允许荧光成像精确地瞄准激光束并评估病变后的损伤。

这里描述的协议与半自动斑马鱼幼体成像系统结合使用，并结合配备UV激光的旋转盘（以下指定为VAST系统）。然而，该协议的要点和该技术的大多数权利要求对于任何配备能够进行细胞烧蚀的激光的系统都是有效的，包括双光子激光扫描显微镜，带有紫外激光的旋转盘显微镜（FRAP模块），或带有激光模块的视频显微镜用于光操作。VAST系统与传统样品处理之间的主要区别之一是，对于后者，需要将幼虫安装在玻璃盖玻片/玻璃底培养皿上的低熔点琼脂糖中，而不是将它们装载在96孔板中。

这种方法提供的好处为再生过程中细胞和分子机制的创新研究提供了机会。此外，高数据质量允许在多学科背景下进行定量调查。

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研究方案

所有动物研究均在英国内政部的批准下进行，并根据其规定，根据项目许可证PP8160052进行。该项目得到了爱丁堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。对于实验分析，使用以下可用的转基因品系，使用5日龄以下的斑马鱼幼虫:Tg（Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP），Tg（Xla.Tubb:DsRed），Tg（betaactin:utrophin-mCherry），Tg（Xla.Tubb:GCaMP6s）和Tg（mnx1:gfp）（参见关于转基因斑马鱼系生成的 补充文件1 ）。使用自动斑马鱼幼虫处理平台的协议示意图如图 1所示。这项工作中使用的所有自定义软件，脚本和详细的实验协议都可以在 https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ 上找到。

1. 样品制备

  1. 在受精后5小时，对胚胎进行分类，以达到正确的发育阶段21。丢弃死卵和发育不良和过度发育的胚胎。
  2. 在受精后3天（dpf），通过在90毫米培养皿中将2mL0.4%氨基苯甲酸乙基甲酯加入50mL鱼类设施水中来麻醉幼虫。使用用苯硫脲（PTU）饲养的动物（见 材料表）以防止皮肤色素沉着，如果这是一个问题，则不是本方案中描述的3 dpf幼虫脊髓损伤的情况。
    注意:这种相对较高的麻醉浓度用于防止幼虫在激光撞击后移动。
  3. 筛选胚胎的荧光报告基因表达（补充文件1）。
    注意:通常需要脊髓（或其他感兴趣的结构）的荧光报告器来评估损伤的效率。使用tg（Xla.Tubb:DsRed）有助于识别脊髓。
  4. 将选定的幼虫转移到96孔板中，用于VAST系统（见 材料表），每孔含300μL鱼类设施水。直接使用含有90毫米培养皿中麻醉剂的培养基。确保每孔只有一个幼虫。准备一个额外的空96孔板来收集病变的幼虫。
    注意:如果使用其他激光病变系统，请将幼虫安装在适当的观察室中，将幼虫安装在1%低熔点（LMP）琼脂糖凝胶中。

2. 显微镜制备

  1. 打开所有系统组件（VAST、显微镜、激光器、PC），包括用于烧蚀的激光器。
  2. 一旦硬件完全初始化，启动显微镜软件，ImageJ / Fiji，python集成开发环境（IDE）和自动斑马鱼成像（VAST系统）软件（如果使用此平台）（参见 材料表）。
  3. 请按照以下步骤设置 VAST 软件。
    1. 当 VAST 软件启动时，在第一个窗口中选择 Plate ，然后单击" 完成 "按钮（图 2A）。将弹出另一个小窗口，询问毛细管是否空且干净。通过查看毛细管的图像来验证内部是否有任何气泡。如果没有，请单击" 是"。如果有任何气泡，请单击" 否 "，然后按照步骤2.3.2-2.3.3（图2B）操作。
    2. 在"大粒子（LP）采样器"窗口中，单击" Prime "以去除气泡（图2C）。
    3. 转到主软件窗口（带有毛细管图像），然后右键单击图像。在弹出菜单上选择" 录制空毛细管图像 "（图2B）。
    4. 在 "LP 采样器 "窗口中，转到" 文件 "菜单，然后选择" 打开脚本" 选项。选择包含与要执行的实验对应的脚本的文件。
    5. 在 VAST 软件主窗口中，转到 文件 ，然后选择 打开实验。选择与计划的实验对应的实验文件。
      注意:确保未选中"自动卸载"和"批量输出到浪费"框。
  4. 设置用于成像的显微镜软件。
    1. 启动显微镜成像软件（见 材料表）以初始化硬件。这可能需要几分钟时间，具体取决于系统。
    2. 转到采集设置并设置显微镜以对幼虫中表达的荧光团进行成像。使用10x NA 0.5浸水物镜，以确保焦点体积沿光轴足够细长，以损伤脊髓或目标组织的整个深度。
  5. 设置 ImageJ/斐济用于激光病变。
    1. 转到" 文件 "菜单，选择" 新建/脚本" 以打开脚本窗口。
    2. 在" 新建 "窗口中，转到" 文件 "菜单，然后选择" 打开" 以加载激光病变脚本 （Manual_MP_Operation.ijm）。
  6. 设置 Python IDE。
    1. 启动 Python IDE。
    2. 转到" 文件 "菜单，然后选择 "打开文件" 以加载脚本以管理激光（Watch_for_ROIs_py3.py）。
    3. 转到" 运行 "菜单，然后选择" 运行而不调试" 以运行脚本。检查以确保在激光衰减器初始化时终端面板中出现一系列消息以及一些噪音（图2D）。

3. 在 VAST 系统上执行激光病变

  1. 通过单击 VAST 软件主窗口上的箭头按钮移动载物台，使毛细管相对于显微镜物镜居中（图 2B）。
  2. 通过目镜观察并使用显微镜的透射光，聚焦在毛细管的顶部。
    注意:毛细血管非常脆弱，如果被物镜触摸，可能会破裂。在进焦和调出时缓慢移动显微镜旋钮。
  3. 将 96 孔板放在 VAST 系统的 LP 采样器的板架上。将装有幼虫的板放在左侧支架上，将用于收集的板放在右侧。确保板的正确方向:A1 孔必须位于支架的左前角。
  4. 在 VAST 软件的 LP 取样器窗口中，单击" 平板模板 "按钮，然后选择所有包含幼虫的孔。单击 OK 按钮验证并关闭窗口（图 2C）。
  5. 在LP采样器窗口中，单击" 运行板 "按钮开始加载幼虫。
    注意:一段时间后，幼虫应该在毛细血管中的位置可见（在实验定义文件中预定义），从而允许损伤脊髓。VAST托盘灯将在旋转几次后关闭，以将幼虫设置为横向朝向显微镜物镜。
  6. 转到显微镜软件，然后单击" 实时 "按钮对幼虫进行成像。
  7. 转动显微镜聚焦旋钮，直到脊髓中央管可见。
    注意:首先使用透射光进行聚焦，然后使用荧光进行优化可以更容易。
  8. 在荧光中拍摄快照并将图像保存到专用文件夹中。
  9. 在 ImageJ 中打开图像并根据需要调整对比度（使用 ImageJ 中的"图像/调整/亮度/对比度..."菜单）。
  10. 单击 感兴趣区域（ROI） 线工具，画一条以脊髓为中心的短线（20μm）（图3A）。
  11. 将显微镜切换到100%反射镜位置。
  12. 加载 ImageJ 脚本，然后单击" 运行 "按钮。使用以下参数:重复 - 2;样品 - 1;宽度 - 40微米;衰减 - 89（全激光功率）（图3C）。
  13. 激光拍摄序列完成后，在成像软件上切换到荧光成像，并根据需要调整焦点。
    注意:由于激光曝光期间的尾部位移，经常观察到焦点偏移。
  14. 拍摄新快照并保存。
  15. 在ImageJ中打开这个新图像，画一条应该大于脊髓本身（~80μm）的新线，从脊髓上部脊髓腹侧下方开始，向背侧延伸，在脊髓和皮肤之间的空间结束（图3B）。
  16. 将显微镜切换到100%反射镜位置。
  17. 转到 ImageJ 脚本窗口，然后单击" 运行 "按钮。使用以下参数:重复 - 2;样品 - 1;宽度 - 40微米;衰减 - 89（全激光功率）。
  18. （较长）激光拍摄序列完成后，通过成像荧光和聚焦来验证横切质量。确保病变部位没有细胞或轴突保持完整，应显示为深色或微弱且均匀的荧光区域（图3D，底图）。
  19. 将病变幼虫收集到空的96孔板中（具有与原始孔相同的孔坐标），方法是转到VAST主软件窗口并单击" 收集 "按钮。
  20. 通过单击窗口左下角的 托盘灯 复选框切换回 VAST 系统指示灯。
  21. 对每个受伤的新幼虫重复步骤3.3-3.17。

4. 病灶后处理和附加实验

  1. 尽快从96孔板中取出幼虫，并将它们转移到带有新鲜鱼类设施水的清洁培养皿中，以使幼虫在病变后恢复。将培养皿放入28°C的培养箱中。
    注意:损伤通常在病变后的第一个小时内继续传播。因此，应在延迟约 1 小时后通过荧光成像评估病变的实际范围。

5. 故障排除

  1. 如果 VAST 系统的试管和毛细管中存在气泡，请单击 LP 采样器窗口中的" 常用 "按钮将其移除。
  2. 考虑不成功的病变（根据病变部位的剩余荧光评估，除了预期的残留和均质背景），这可能是由于下面提到的几个原因。
    1. 低激光功率:发生这种情况时，请尝试使用更高的值。
      注:VAST 系统配备了染料激光器。这意味着用于激光生成的染料溶液的浓度会随时间而变化，从而导致激光功率的降低。用新的解决方案替换通常可以解决问题22。
    2. 校准不良:发生这种情况时，请按照步骤5.2.2.1-5.2.2.4验证激光系统的校准和功率。如果校准不正确，激光将无法定向到所需位置，从而导致相邻组织中不成功的病变或不希望的损伤。
      1. 将镜面载玻片放在毛细管室的顶部。将焦点放在涂层面（应面向物镜）。在幻灯片中使用上一个默认值可更轻松地获得焦点。
      2. 使用校准脚本应用激光烧蚀图案。
      3. 评估模式的质量。斑点或线条应显得清晰且不模糊。
      4. 使用功率增加的斜坡来评估激光功率与以前的会话相比是否发生了变化。
    3. 病变期间幼虫运动:幼虫对麻醉的反应不同;因此，激光病变可能在此过程中触发尾部的运动，从而阻止成功的横切。发生这种情况时，对激光病变步骤进行额外的迭代以完成它，同时仍然避免对周围组织的损害。
    4. 注意力不集中:当发生这种情况时，将注意力集中在中央运河的中间以获得最佳效果。
    5. ROI 绘图、位置和尺寸:ROI 的位置和大小对于成功进行横切至关重要。ROI应大于脊髓，并以脊髓中心为中心。为了解决这个问题，开始从脊髓的腹侧吸取ROI，然后向上朝背侧移动以获得成功的横断。这可能是由于烧蚀过程中激光射击序列触发的尾部运动。

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结果

脊髓横断的验证
进行结构和功能检查以评估方案是否允许完整的脊髓横断。

首先，为了验证病变部位的荧光损失是由于神经元组织损伤而不是激光照射的荧光光漂白引起的，使用针对乙酰化微管蛋白的抗体进行免疫染色（见 材料表 和 补充文件1）。观察到病变的尾侧和喙侧之间的轴突完全断裂，证实了脊髓的完全横断（

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讨论

迫切需要更深入地了解斑马鱼在再生过程中起作用的过程。这种动物模型为生物医学研究提供了许多好处，特别是对于脊髓损伤1。大多数研究涉及手动病变，需要训练有素的操作员并诱发多组织损伤。这里提出了激光病变方案，允许控制病变特征并减少对周围组织的损害。此外，这种技术很容易被相对未经训练的实验者成功使用。

该协议中的关键步骤是激?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项研究得到了BBSRC（BB/S0001778/1）的支持。CR由Princess Royal TENOVUS苏格兰医学研究奖学金计划资助。我们感谢David Greenald（爱丁堡大学CRH）和Katy Reid（爱丁堡大学CDBS）对转基因鱼的善意礼物（见 补充文件）。我们感谢Daniel Soong（爱丁堡大学CRH）对3i旋转盘共聚焦的友好访问。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0Carl Zeiss
ImageJ/FIJIOpen-Source
Visual Studio CodeMicrosoft
Microscope and accessories
ApoTome microscopeCarl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lensCarl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD camerasCarl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1Carl Zeiss
UV laserMicropoint
VAST BioImagerUnion Biometrica
Labware
90 mm Petri dishThermo-Fisher101R20
96-well plateCorning3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging KitInvitrogenC10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)Sigma-AldrichA5040
phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488Jackson703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3Jackson715-165-150
Mouse anti-GFPAbcamAB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibodySigmaT6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)N/AEstablished by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)N/AFirst described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)N/AFirst described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)N/AEstablished by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)N/AEstablished by David Greenhald, University of Edinburgh

参考文献

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260(2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

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Erratum


Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

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