Lesiones controladas semiautomatizadas inducidas por láser para estudiar la regeneración de la médula espinal en larvas de pez cebra

Resumen

El presente protocolo describe un método para inducir lesiones específicas de tejido y altamente reproducibles en larvas de pez cebra utilizando un sistema de lesiones láser combinado con una plataforma microfluídica automatizada para el manejo de larvas.

Resumen

Las larvas de pez cebra poseen un sistema nervioso central (SNC) completamente funcional con una alta capacidad regenerativa solo unos días después de la fertilización. Esto hace que este modelo animal sea muy útil para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal. El protocolo estándar para inducir tales lesiones es transectar la parte dorsal del tronco manualmente. Sin embargo, esta técnica requiere un entrenamiento extenso y daña tejidos adicionales. Se desarrolló un protocolo para lesiones inducidas por láser para eludir estas limitaciones, lo que permite una alta reproducibilidad e integridad de la transección de la médula espinal en muchos animales y entre diferentes sesiones, incluso para un operador no entrenado. Además, el daño tisular se limita principalmente a la propia médula espinal, lo que reduce los efectos de confusión de la lesión de diferentes tejidos, por ejemplo, piel, músculo y SNC. Además, las hemi-lesiones de la médula espinal son posibles. La preservación mejorada de la integridad del tejido después de una lesión por láser facilita las disecciones adicionales necesarias para análisis adicionales, como la electrofisiología. Por lo tanto, este método ofrece un control preciso de la extensión de la lesión que es inalcanzable manualmente. Esto permite nuevos paradigmas experimentales en este poderoso modelo en el futuro.

Introducción

A diferencia de los mamíferos, el pez cebra (Danio rerio) puede reparar su sistema nervioso central (SNC) después de ^{una lesión1}. El uso de larvas de pez cebra como modelo para la regeneración de la médula espinal es relativamente reciente. Ha demostrado ser valioso investigar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la ^reparación2. Esto se debe a la facilidad de manipulación, el ciclo experimental corto (nuevas larvas cada semana), la transparencia óptica de los tejidos y el pequeño tamaño de las larvas, ideal para la microscopía de fluorescencia in vivo .

En el caso de la regeneración de la médula espinal, dos ventajas adicionales del uso de larvas son la velocidad de recuperación, unos pocos días en comparación con unas pocas semanas para los adultos, y la facilidad de inducir lesiones utilizando técnicas manuales. Esto se ha utilizado con éxito en muchos ^{estudios3,4,5}, incluyendo investigaciones ^recientes6,7. En general, esto conduce a una mayor producción de datos significativos, una alta adaptabilidad de los protocolos experimentales y una disminución de los costos experimentales. El uso de larvas menores de 5 días después de la fertilización también reduce el uso de animales siguiendo los principios 3R en la investigación con ^animales8.

Después de una lesión de la médula espinal en larvas de pez cebra, ocurren muchos procesos biológicos, incluida la respuesta inflamatoria, la proliferación celular, la neurogénesis, la migración de células sobrevivientes o recién generadas, la reforma de los axones funcionales y una remodelación global de los circuitos de procesos neuronales y los tejidos de la columna vertebral6,7,9,10 . Para ser orquestados con éxito, estos procesos implican una interacción finamente regulada entre una variedad de tipos de células, componentes de la matriz extracelular y señales ^{bioquímicas11,12}. Desentrañar los detalles de esta reorganización significativa de un tejido complejo como la médula espinal requiere el uso y desarrollo de enfoques experimentales precisos y controlados.

El principal paradigma experimental utilizado para estudiar la regeneración de la médula espinal en el pez cebra es utilizar medios quirúrgicos para inducir daño tisular por resección, apuñalamiento o crioinjuria3,13. Estos enfoques tienen la desventaja de requerir capacitación específica en habilidades de microcirugía, lo que consume mucho tiempo para cualquier nuevo operador y puede evitar su uso en proyectos a corto plazo. Además, generalmente inducen daño a los tejidos circundantes, lo que puede influir en la regeneración.

Otro enfoque es inducir daño celular ^{químicamente14} o mediante manipulaciones ^genéticas15. Este último permite daños altamente dirigidos. Sin embargo, tal técnica requiere un largo trabajo preparatorio para generar nuevos peces transgénicos antes de hacer cualquier experimento, renovados cada vez que se apunta a un tipo de célula único.

Existe, por lo tanto, la necesidad de un método que permita lesiones dirigidas pero versátiles adecuadas para una variedad de estudios en regeneración. Una solución consiste en utilizar un láser para inducir daño localizado en el tejido de interés16,17,18,19,20. De hecho, el uso de daño tisular inducido por láser presenta un enfoque robusto para generar lesiones de la médula espinal con muchas ventajas. Los microscopios equipados con tales módulos de manipulación láser permiten especificar un área de forma personalizada donde se producirá la ablación celular, con el beneficio adicional del control temporal. El tamaño y la posición de la lesión se pueden adaptar para abordar cualquier pregunta.

La característica que falta en la mayoría de los sistemas de lesiones láser es la posibilidad de inducir lesiones de una manera altamente reproducible para una serie de larvas. Aquí se describe un protocolo original utilizando un láser UV para inducir lesiones semiautomatizadas precisas y controladas en larvas de pez cebra basadas en una plataforma microfluídica diseñada para el manejo automatizado de ^larvas21. Además, en el sistema presentado aquí, las larvas se insertan en un capilar de vidrio, lo que permite la rotación libre del animal alrededor de su eje rostrocaudal. El usuario puede elegir qué lado de la larva presentar al láser mientras permite que las imágenes de fluorescencia se dirijan con precisión al rayo láser y evalúen el daño después de la lesión.

El protocolo descrito aquí se utiliza con un sistema de imágenes de larvas de pez cebra semiautomatizado combinado con un disco giratorio equipado con un láser UV (designado en lo sucesivo como el sistema VAST). Sin embargo, los puntos principales del protocolo y la mayoría de las afirmaciones de la técnica son válidos para cualquier sistema equipado con un láser capaz de ablación celular, incluidos los microscopios de escaneo láser de dos fotones, los microscopios de disco giratorio provistos de un láser UV (módulo FRAP) o los videomicroscopios con un módulo láser para la manipulación fotográfica. Una de las principales diferencias entre el sistema VAST y el manejo convencional de muestras será que para este último, se requerirá el montaje de larvas en agarosa de bajo punto de fusión en cubiertas de vidrio / placas de Petri con fondo de vidrio en lugar de cargarlas en una placa de 96 pocillos.

Los beneficios que ofrece este método abren oportunidades para la investigación innovadora sobre los mecanismos celulares y moleculares durante el proceso de regeneración. Además, la alta calidad de los datos permite realizar investigaciones cuantitativas en un contexto multidisciplinario.

Protocolo

Todos los estudios en animales se llevaron a cabo con la aprobación del Ministerio del Interior del Reino Unido y de acuerdo con sus regulaciones, bajo la licencia de proyecto PP8160052. El proyecto fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Edimburgo. Para los análisis experimentales, se utilizaron larvas de pez cebra de hasta 5 días de edad de ambos sexos de las siguientes líneas transgénicas disponibles: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactina:utrofina-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) y Tg(mnx1:gfp) (ver Archivo Complementario 1 sobre la generación de las líneas de pez cebra transgénico). En la Figura 1 se muestra un esquema del protocolo utilizando la plataforma automatizada de manejo de larvas de pez cebra. Todo el software personalizado, scripts y protocolos experimentales detallados utilizados en este trabajo están disponibles en https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. Preparación de la muestra

1. A las 5 h post-fecundación, clasificar los embriones para la etapa de desarrollo ^correcta21. Descarte los óvulos muertos y los embriones poco desarrollados y sobredesarrollados.
2. A los 3 días después de la fertilización (dpf), anestesiar las larvas agregando 2 ml de 0,4% de metiléster aminobenzoico-ácido-etílico al 50 ml de agua de la instalación de peces en una placa de Petri de 90 mm. Utilice animales criados con feniltiorea (PTU) (ver Tabla de material) para prevenir la pigmentación de la piel si es un problema, lo que no es el caso de las lesiones de la médula espinal en larvas de 3 dpf descritas en este protocolo.
   NOTA: Esta concentración anestésica relativamente alta se utiliza para prevenir los movimientos de las larvas después del impacto del láser.
3. Examinar los embriones para detectar la expresión fluorescente del reportero (Archivo complementario 1).
   NOTA: A menudo se requiere un informador fluorescente para la médula espinal (u otra estructura de interés) para evaluar la eficiencia de la lesión. El uso de tg(Xla.Tubb:DsRed) ayuda a identificar la médula espinal.
4. Transfiera las larvas seleccionadas a una placa de 96 pocillos para su uso en el sistema VAST (consulte la Tabla de materiales) con 300 μL de agua de la instalación de peces por pozo. Utilice el medio que contiene el anestésico de la placa de Petri de 90 mm directamente. Asegúrese de tener solo una larva por pozo. Prepare una placa vacía adicional de 96 pocillos para recolectar las larvas lesionadas.
   NOTA: Si utiliza otro sistema de lesiones con láser, monte las larvas en gel de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) al 1% en una cámara de observación adecuada.

2. Preparación del microscopio

1. Encienda todos los componentes del sistema (VAST, microscopio, láser, PC), incluido el láser para la ablación.
2. Una vez que el hardware esté completamente inicializado, inicie el software de microscopio, ImageJ / Fiji, un entorno de desarrollo integrado (IDE) de Python y el software automatizado de imágenes de pez cebra (sistema VAST) si utiliza esta plataforma (consulte la Tabla de materiales).
3. Configure el software VAST siguiendo los pasos a continuación.
   1. Cuando se inicie el software VAST, elija Placa en la primera ventana y haga clic en el botón Listo (Figura 2A). Aparecerá otra pequeña ventana preguntando si el capilar está vacío y limpio. Verifique mirando la imagen del capilar si hay burbujas de aire en el interior. Si no es así, haga clic en Sí. Si hay burbujas, haga clic en No y siga los pasos 2.3.2-2.3.3 (Figura 2B).
   2. En la ventana Muestreador de partículas grandes (LP), haga clic en Prime para eliminar las burbujas de aire (Figura 2C).
   3. Vaya a la ventana principal del software (con la imagen capilar) y haga clic derecho en la imagen. Seleccione Grabar imagen capilar vacía en el menú emergente (Figura 2B).
   4. En la ventana LP Sampler , vaya al menú Archivo y seleccione la opción Abrir script . Elija un archivo que contenga el script correspondiente al experimento que se va a realizar.
   5. En la ventana principal del software VAST, vaya a Archivo y elija Abrir experimento. Elija el archivo de experimento correspondiente al experimento planificado.
      NOTA: Asegúrese de que las casillas Descarga automática y Salida masiva a residuos NO estén marcadas.
4. Configure el software del microscopio para la obtención de imágenes.
   1. Inicie el software de imágenes del microscopio (consulte la Tabla de materiales) para inicializar el hardware. Esto puede tardar unos minutos, dependiendo del sistema.
   2. Vaya a la configuración de adquisición y configure el microscopio para obtener imágenes del fluoróforo expresado en las larvas. Utilice un objetivo de inmersión en agua 10x NA 0.5 para asegurarse de que el volumen focal sea lo suficientemente alargado a lo largo del eje óptico para lesionar toda la profundidad de la médula espinal o el tejido objetivo.
5. Configurar ImageJ/Fiji para lesiones láser.
   1. Vaya al menú Archivo , elija Nuevo/Script para abrir la ventana de script.
   2. En la ventana Nuevo , vaya al menú Archivo y elija Abrir para cargar el script de lesión láser (Manual_MP_Operation.ijm).
6. Configure el IDE de Python.
   1. Inicie el IDE de Python.
   2. Vaya al menú Archivo y elija Abrir archivo para cargar el script para administrar el láser (Watch_for_ROIs_py3.py).
   3. Vaya al menú Ejecutar y elija Ejecutar sin depuración para ejecutar el script. Compruebe que aparece una secuencia de mensajes en el panel TERMINAL junto con algo de ruido mientras se inicializa el atenuador láser (Figura 2D).

3. Realización de lesiones láser en el sistema VAST

1. Centrar el capilar en relación con el objetivo del microscopio moviendo el escenario haciendo clic en los botones de flecha en la ventana principal del software VAST (Figura 2B).
2. Concéntrese en la parte superior del capilar mirando a través de los oculares y utilizando la luz transmitida del microscopio.
   PRECAUCIÓN: El capilar es muy frágil y puede romperse si es tocado por el objetivo. Mueva la perilla del microscopio lentamente cuando enfoque hacia adentro y hacia afuera.
3. Coloque las placas de 96 pocillos en el soporte de la placa del muestreador LP del sistema VAST. Coloque la placa que contiene las larvas en el soporte izquierdo y la placa para la recolección a la derecha. Asegúrese de que las placas estén correctamente orientadas: el pozo A1 debe estar en la esquina delantera izquierda del soporte.
4. En el software VAST, en la ventana LP Sampler, haga clic en el botón Plantilla de placa y seleccione todos los pozos que contienen larvas. Haga clic en el botón Aceptar para validar y cerrar la ventana (Figura 2C).
5. En la ventana LP Sampler, haga clic en el botón Ejecutar placa para comenzar a cargar una larva.
   NOTA: Después de algún tiempo, la larva debe ser visible en el capilar en posición (predefinida en el archivo de definición del experimento), lo que permite lesionar la médula espinal. La luz de la bandeja VAST se apagará después de algunas rotaciones para establecer la larva con el lado lateral frente al objetivo del microscopio.
6. Vaya al software del microscopio y haga clic en el botón Live para obtener una imagen de la larva.
7. Gire la perilla del foco del microscopio hasta que el canal central de la médula espinal esté visible.
   NOTA: Puede ser más fácil enfocar usando la luz transmitida primero, y luego refinar con fluorescencia.
8. Tome una instantánea en fluorescencia y guarde la imagen en una carpeta dedicada.
9. Abra la imagen en ImageJ y ajuste el contraste si es necesario (utilizando el menú Imagen/Ajustar/Brillo/contraste... en ImageJ).
10. Haga clic en la herramienta de línea Región de interés (ROI) y dibuje una línea corta (20 μm) centrada en la médula espinal (Figura 3A).
11. Cambie el microscopio a la posición de espejo 100% reflectante.
12. Cargue el script ImageJ y haga clic en el botón Ejecutar . Utilice los siguientes parámetros: Repetición - 2; Muestra - 1; Ancho - 40 micras; Atenuación - 89 (Potencia láser completa) (Figura 3C).
13. Cuando finalice la secuencia de disparo láser, cambie a imágenes de fluorescencia en el software de imágenes y ajuste el enfoque si es necesario.
    NOTA: A menudo se observa un cambio en el enfoque debido al desplazamiento de la cola durante la exposición al láser.
14. Tome una nueva instantánea y guárdela.
15. Abra esta nueva imagen en ImageJ y dibuje una nueva línea que debe ser más grande que la propia médula espinal (~ 80 μm), comenzando por debajo del lado ventral de la médula espinal en la parte superior de la notocorda y yendo hacia el lado dorsal para terminar en el espacio entre la médula espinal y la piel (Figura 3B).
16. Cambie el microscopio a la posición de espejo 100% reflectante.
17. Vaya a la ventana de script de ImageJ y haga clic en el botón Ejecutar . Utilice los siguientes parámetros: Repetición - 2; Muestra - 1; Ancho - 40 micras; Atenuación - 89 (Potencia láser completa).
18. Una vez finalizada la secuencia de disparo láser (más larga), verifique la calidad de la transección mediante la fluorescencia y el enfoque de imágenes. Asegúrese de que ninguna célula o axón permanezca intacto en el sitio de la lesión, que debe aparecer como un área fluorescente oscura o débil y homogénea (Figura 3D, panel inferior).
19. Recoja las larvas lesionadas en la placa vacía de 96 pocillos (con las mismas coordenadas de pozo que la del pozo original) yendo a la ventana principal del software VAST y haciendo clic en el botón Recopilar .
20. Vuelva a encender la luz del sistema VAST haciendo clic en la casilla de verificación Luz de bandeja en la parte inferior izquierda de la ventana.
21. Repita el paso 3.3-3.17 para cada nueva larva que se lesione.

4. Manejo posterior a la lesión y experimentos adicionales

1. Saque las larvas de la placa de 96 pocillos lo antes posible y transfiéralas a una placa de Petri limpia con agua fresca para que las larvas se recuperen después de la lesión. Coloque la placa de Petri en una incubadora a 28 °C.
   NOTA: El daño a menudo continúa propagándose en la primera hora después de la lesión. Por lo tanto, la extensión real de la lesión debe evaluarse mediante imágenes de fluorescencia después de un retraso de aproximadamente 1 h.

5. Solución de problemas

1. Si hay burbujas de aire presentes en los tubos y capilares del sistema VAST, haga clic en el botón Prime en la ventana lp sampler para eliminarlas.
2. Considere las lesiones fallidas (evaluadas a partir de la fluorescencia restante en el sitio de la lesión, aparte del fondo residual y homogéneo esperado), que pueden deberse a varias razones que se mencionan a continuación.
   1. Baja potencia láser: Cuando esto suceda, intente con un valor más alto.
      NOTA: El sistema VAST está equipado con un láser de tinte. Esto implica que la concentración de la solución de tinte utilizada para la generación de luz láser puede cambiar con el tiempo, lo que lleva a una disminución de la potencia del láser. Reemplazar con una nueva solución generalmente resuelve el ^problema22.
   2. Calibración deficiente: Cuando esto suceda, verifique la calibración y la potencia del sistema láser según el paso 5.2.2.1-5.2.2.4. Si no se calibra correctamente, el láser no se dirigirá a la ubicación deseada, lo que provocará lesiones fallidas o daños no deseados en los tejidos adyacentes.
      1. Coloque un espejo deslizante en la parte superior de la cámara capilar. Concéntrese en el lado recubierto (debe enfrentar el objetivo). Utilice un valor predeterminado anterior en la diapositiva para enfocar más fácilmente.
      2. Aplique un patrón de ablación con láser utilizando un script de calibración.
      3. Evaluar la calidad del patrón. Las manchas o líneas deben aparecer nítidas y no borrosas.
      4. Utilice una rampa con potencia creciente para evaluar si la potencia del láser ha cambiado en comparación con las sesiones anteriores.
   3. Movimiento larvario durante las lesiones: Las larvas responden de manera diferente a la anestesia; por lo tanto, la lesión láser puede desencadenar movimientos de la cola durante el proceso, impidiendo así una transección exitosa. Cuando esto suceda, realice una iteración adicional de los pasos de la lesión láser para completarla y evitar el daño a los tejidos circundantes.
   4. Mal enfoque: Cuando esto ocurra, concéntrese en el medio del canal central para obtener los mejores resultados.
   5. Dibujo, posición y tamaño del ROI: La posición y el tamaño del ROI son fundamentales para las transecciones exitosas. El ROI debe ser más grande que la médula espinal y centrado en el centro de la médula espinal. Para resolver esto, comience a extraer el ROI del lado ventral de la médula espinal y suba hacia el lado dorsal para obtener una transección exitosa. Esto probablemente se deba a los movimientos de la cola desencadenados por la secuencia de disparos láser durante el procedimiento de ablación.

Resultados

Validación de la transección de la médula espinal
Se realizaron investigaciones estructurales y funcionales para evaluar si el protocolo permite una transección completa de la médula espinal.

En primer lugar, para verificar que la pérdida de fluorescencia en el sitio de la lesión se debió a daño en el tejido neuronal y no al fotoblanqueo de fluorescencia de la iluminación láser, se realizó inmunotinción utilizando un anticuerpo contra la tubulina acetilada (ver...

Discusión

Existe una necesidad urgente de una comprensión más profunda de los procesos en juego durante la regeneración en el pez cebra. Este modelo animal ofrece muchos beneficios para la investigación biomédica, en particular para las lesiones de la médula ^espinal1. La mayoría de los estudios involucran lesiones manuales que requieren un operador bien entrenado e inducen daño multisular. Aquí se presenta un protocolo de lesiones con láser, que permite controlar las características de la lesión...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0	Carl Zeiss
ImageJ/FIJI	Open-Source
Visual Studio Code	Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope	Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens	Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras	Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880	Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1	Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1	Carl Zeiss
UV laser	Micropoint
VAST BioImager	Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish	Thermo-Fisher	101R20
96-well plate	Corning	3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040
phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488	Jackson	703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3	Jackson	715-165-150
Mouse anti-GFP	Abcam	AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody	Sigma	T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)		N/A	First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)		N/A	First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)		N/A	Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh