A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
تقدم هذه المقالة طريقة بسيطة للإنتاج السريع لحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة مع البروتينات الهيكلية الخلوية المغلفة. تثبت هذه الطريقة أنها مفيدة لإعادة تشكيل الهياكل الخلوية الهيكلية من أسفل إلى أعلى في الحبس والتفاعلات بين الهيكل الخلوي والغشاء.
كثيرا ما تستخدم الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) كنماذج للأغشية البيولوجية ، وبالتالي فهي أداة رائعة لدراسة العمليات الخلوية المتعلقة بالأغشية في المختبر. في السنوات الأخيرة ، أثبت التغليف داخل GUVs أنه نهج مفيد لتجارب إعادة التشكيل في بيولوجيا الخلية والمجالات ذات الصلة. إنه يحاكي بشكل أفضل ظروف الحبس داخل الخلايا الحية ، بدلا من إعادة التكوين الكيميائي الحيوي التقليدي. غالبا ما لا يكون من السهل تنفيذ طرق التغليف داخل GUVs ، ويمكن أن تختلف معدلات النجاح اختلافا كبيرا من مختبر إلى آخر. إحدى التقنيات التي أثبتت نجاحها في تغليف أنظمة البروتين الأكثر تعقيدا تسمى تغليف واجهة القطيرات المستمرة (cDICE). هنا ، يتم تقديم طريقة قائمة على cDICE لتغليف البروتينات الهيكلية الخلوية بسرعة في GUVs مع كفاءة تغليف عالية. في هذه الطريقة ، أولا ، يتم إنشاء قطرات أحادية الطبقة من الدهون عن طريق استحلاب محلول بروتيني ذي أهمية في خليط من الدهون / الزيت. بعد إضافتها إلى غرفة دوارة مطبوعة 3D ، تمر هذه القطرات أحادية الطبقات الدهنية عبر طبقة أحادية دهنية ثانية في واجهة مائية / زيتية داخل الغرفة لتشكيل GUVs التي تحتوي على نظام البروتين. تبسط هذه الطريقة الإجراء العام للتغليف داخل GUVs وتسرع العملية ، وبالتالي تسمح لنا بحصر ومراقبة التطور الديناميكي لتجميع الشبكة داخل الحويصلات ثنائية الطبقة الدهنية. هذه المنصة مفيدة لدراسة ميكانيكا تفاعلات غشاء الهيكل الخلوي في الحبس.
تستخدم مقصورات الدهون ثنائية الطبقة كخلايا اصطناعية نموذجية لدراسة التفاعلات العضوية المغلقة والعمليات القائمة على الأغشية أو كوحدات حاملة في تطبيقات توصيل الأدوية 1,2. تتطلب البيولوجيا من أسفل إلى أعلى مع المكونات النقية الحد الأدنى من الأنظمة التجريبية لاستكشاف الخصائص والتفاعلات بين الجزيئات الحيوية ، مثل البروتينات والدهون 3,4. ومع ذلك ، مع تقدم هذا المجال ، هناك حاجة متزايدة لأنظمة تجريبية أكثر تعقيدا تقلد بشكل أفضل الظروف في الخلايا البيولوجية. التغليف في GUVs هو نهج عملي يمكن أن يوفر بعض هذه الخصائص الشبيهة بالخلايا من خلال توفير طبقة ثنائية من الدهون قابلة للتشوه ونفاذية بشكل انتقائي ومساحة تفاعل ضيقة. على وجه الخصوص ، في المختبر إعادة تشكيل الأنظمة الهيكلية الخلوية ، كنماذج للخلايا الاصطناعية ، يمكن أن تستفيد من التغليف في مقصورات الغشاء5. ترتبط العديد من البروتينات الهيكلية الخلوية وتتفاعل مع غشاء الخلية. نظرا لأن معظم التجميعات الهيكلية الخلوية تشكل هياكل تمتد عبر كامل الخلية ، يتم تحديد شكلها بشكل طبيعي بواسطة الحبس بحجم الخلية6.
يتم استخدام طرق مختلفة لتوليد GUVs ، مثل التورم 7,8 ، واندماج الحويصلة الصغيرة9,10 ، ونقل المستحلب11,12 ، والنفث النبضي 13 ، وغيرها من طرق الموائع الدقيقة 14,15. على الرغم من أن هذه الأساليب لا تزال تستخدم ، إلا أن لكل منها حدودها. وبالتالي ، فإن اتباع نهج قوي ومباشر مع غلة عالية من تغليف GUV أمر مرغوب فيه للغاية. على الرغم من أن تقنيات مثل التورم التلقائي والتورم الكهربائي معتمدة على نطاق واسع لتشكيل GUVs ، إلا أن هذه الطرق متوافقة في المقام الأول مع تركيبات الدهون المحددة16 ، والمخازن المؤقتة منخفضة تركيز الملح 17 ، والحجم الجزيئي المغلف الأصغر18 ، وتتطلب حجما كبيرا من الكفائف. إن دمج العديد من الحويصلات الصغيرة في GUV غير موات بطبيعته ، مما يتطلب خصوصية في تركيبات الدهون المشحونة9 و / أو العوامل الخارجية المسببة للاندماج ، مثل الببتيدات19 أو غيرها من المواد الكيميائية. من ناحية أخرى ، قد يتطلب نقل المستحلب وطرق الموائع الدقيقة تثبيت القطيرات من خلال إزالة الفاعل بالسطح والمذيبات بعد تكوين الطبقة الثنائية ، على التوالي18,20. يفرض تعقيد الإعداد التجريبي والجهاز في تقنيات الموائع الدقيقة مثل النفث النبضي تحديا إضافيا21. cDICE هي طريقة قائمة على المستحلب مشتقة من مبادئ مماثلة تحكم نقل المستحلب22,23. يتم تقسيم المحلول المائي (المحلول الخارجي) وخليط الدهون والزيت إلى طبقات بواسطة قوى الطرد المركزي في غرفة أسطوانية دوارة (غرفة cDICE) تشكل واجهة مشبعة بالدهون. يؤدي نقل قطرات مائية أحادية الطبقة من الدهون إلى غرفة cDICE الدوارة إلى سحاب طبقة ثنائية الطبقة حيث تعبر القطرات الواجهة المشبعة بالدهون إلى المحلول المائي الخارجي22,24. نهج cDICE هو تقنية قوية لتغليف GUV. مع الطريقة المعدلة المقدمة ، لا يتم تحقيق غلة الحويصلة العالية النموذجية ل cDICE مع وقت تغليف أقصر بكثير (بضع ثوان) فحسب ، بل يتم تقليل وقت توليد GUV الذي يسمح بمراقبة العمليات المعتمدة على الوقت (على سبيل المثال ، تكوين شبكة actin cytoskeletal network) بشكل كبير. يستغرق البروتوكول حوالي 15-20 دقيقة من البداية إلى جمع GUV وتصويرها. هنا ، يتم وصف توليد GUV باستخدام طريقة cDICE المعدلة لتغليف الأكتين والبروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs). ومع ذلك ، فإن التقنية المقدمة قابلة للتطبيق لتغليف مجموعة واسعة من التفاعلات البيولوجية والتفاعلات الغشائية ، من تجميع البوليمرات الحيوية إلى التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا إلى نقل البضائع القائمة على الاندماج الغشائي.
1. إعداد خليط الزيت والدهون
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة في غطاء الدخان باتباع جميع إرشادات السلامة للتعامل مع الكلوروفورم.
2. توليد الحويصلة
3. التصوير وإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد
لإثبات النجاح في توليد GUVs الهيكلية الخلوية باستخدام البروتوكول الحالي ، أعيد تشكيل هياكل حزم fascin-actin في GUVs. Fascin هو رابط متقاطع قصير من خيوط الأكتين التي تشكل حزم أكتين متوازية صلبة ويتم تنقيتها من E. coli كبروتين اندماج Glutathione-S-Transferase (GST)26. تم إعادة تشكيل 5 ميكرومتر من الأكتين ...
تم استكشاف طرق مختلفة لتوليد GUVs لإنشاء خلايا اصطناعية ومع ذلك ، فإن تعقيد الإجراءات ، والوقت الممتد لتحقيق التغليف ، وتقييد أنواع الدهون والتركيب الجزيئي للغلاف ، والحاجة إلى مواد كيميائية غير فسيولوجية لتسهيل التغليف ، وانخفاض إنتاجية GUV ، وعدم الاتساق في كفاءة التغليف لا تزال تشكل تحدي...
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
تعترف APL بالدعم المقدم من زمالة Humboldt Research للباحثين ذوي الخبرة ومن المؤسسة الوطنية للعلوم (1939310 و 1817909) والمعاهد الوطنية للصحة (R01 EB030031).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
Fascin | homemade | N/A | |
F-buffer | homemade | N/A | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
G-buffer | homemade | N/A | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved