Encapsulamento rápido do Citoesqueleto Reconstituído Dentro de Vesículos Unilamellar Gigantes

Resumo

Este artigo introduz um método simples para a produção rápida de vesículas unilamellar gigantes com proteínas citoesqueletal encapsuladas. O método se mostra útil para a reconstituição de estruturas citoesqueletal em interações de confinamento e citoesqueleto-membrana.

Resumo

Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são frequentemente usadas como modelos de membranas biológicas e, portanto, são uma ótima ferramenta para estudar processos celulares relacionados à membrana in vitro. Nos últimos anos, o encapsulamento dentro dos GUVs provou ser uma abordagem útil para experimentos de reconstituição em biologia celular e campos relacionados. Ele imita melhor as condições de confinamento dentro das células vivas, em oposição à reconstituição bioquímica convencional. Métodos de encapsulamento dentro de GUVs muitas vezes não são fáceis de implementar, e as taxas de sucesso podem diferir significativamente de laboratório para laboratório. Uma técnica que tem sido bem sucedida para encapsular sistemas proteicos mais complexos é chamada de encapsulamento contínuo de cruzamento de interface de gotícula (cDICE). Aqui, um método baseado em cDICE é apresentado para encapsular rapidamente proteínas citoesqueletal em GUVs com alta eficiência de encapsulamento. Neste método, primeiro, gotículas lipídicas-monocamadas são geradas pela emulsificação de uma solução proteica de interesse em uma mistura lipídica/óleo. Depois de serem adicionados em uma câmara impressa em 3D rotativa, essas gotículas lipídicas-monocamadas passam por uma segunda monocamada lipídica em uma interface água/óleo dentro da câmara para formar GUVs que contêm o sistema de proteínas. Este método simplifica o procedimento global de encapsulamento dentro dos GUVs e acelera o processo, e assim nos permite limitar e observar a evolução dinâmica do conjunto de rede dentro de vesículas lipídicas bicamadas. Esta plataforma é útil para estudar a mecânica das interações citoesqueleto-membrana no confinamento.

Introdução

Os compartimentos de bicamadas lipídicas são usados como modelo de células sintéticas para estudar reações orgânicas fechadas e processos baseados em membrana ou como módulos portadores em aplicações de entrega de medicamentos ^1,2. A biologia de baixo para cima com componentes purificados requer sistemas experimentais mínimos para explorar propriedades e interações entre biomoléculas, como proteínas e lipídios ^3,4. No entanto, com o avanço do campo, há uma necessidade aumentada de sistemas experimentais mais complexos que imitem melhor as condições nas....

Protocolo

1. Preparação de mistura óleo-lipídida

NOTA: A etapa precisa ser realizada em um capô de fumaça seguindo todas as diretrizes de segurança para o manuseio do clorofórmio.

1. Tome 0,5 mL de clorofórmio em um frasco de vidro de 15 mL. Adicione 88 μL de 25 mg/mL dioleoyl-fosfocholina (DOPC), 9,3 μL de colesterol de 50 mg/mL, e 5 μL de 1 mg/mL dioleoyl-phosphoethanolamina-lissamina rhodamina B (rhodamina PE) (ver Tabela de Materiais) no frasco de vidro de 15 ml.
   NOTA: As frações finais de mol do DOPC e do colesterol no óleo/óleo mineral de silicone são de 69,9% e 30%, respectivamente. Foi estabelecido ....

Resultados

Para demonstrar a geração bem sucedida de GUVs citosqueléticos usando o protocolo atual, estruturas de feixe de fascin-actin em GUVs foram reconstituídas. Fascin é um curto crosslinker de filamentos de actina que forma feixes rígidos de actina alinhados paralelos e é purificado de E. coli como Proteína de fusão Glutathione-S-Transferase (GST)²⁶. 5 μM de actina foi primeiro reconstituído, incluindo 0,53 μM de atto488 actin no tampão de polimerização de actina e 7,5% do gradi.......

Discussão

Diferentes métodos de geração de GUVs têm sido explorados para a criação de células sintéticas No entanto, a complexidade dos procedimentos, o tempo estendido para alcançar o encapsulamento, a restrição dos tipos lipídicos e a composição molecular do encapsulador, a necessidade de produtos químicos não fisiológicos para facilitar o encapsulamento, o baixo rendimento do GUV e as inconsistências na eficiência do encapsulamento continuaram a desafiar os pesquisadores neste campo. Considerando a ampla gama.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667