A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
מאמר זה מציג שיטה פשוטה לייצור מהיר של שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות עם חלבוני שלד ציטוסקטליים עטופים. השיטה מוכיחה את עצמה כיעילה לשילוב מחדש מלמטה למעלה של מבנים ציטוסקטליים באינטראקציות כליאה וציטוסקלטון-ממברנה.
שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות (GUVs) משמשות לעתים קרובות כמודלים של ממברנות ביולוגיות ולכן הן כלי נהדר לחקר תהליכים תאיים הקשורים לממברנה במבחנה. בשנים האחרונות, אנקפסולציה בתוך GUVs הוכיחה את עצמה כגישה מועילה לניסויים חוזרים בביולוגיה של התא ובתחומים קשורים. הוא מחקה טוב יותר את תנאי הכליאה בתוך תאים חיים, בניגוד לשיקום ביוכימי קונבנציונלי. לעתים קרובות לא קל ליישם שיטות לעטיפה בתוך GUVs, ושיעורי ההצלחה יכולים להיות שונים באופן משמעותי ממעבדה למעבדה. טכניקה אחת שהוכחה כמוצלחת לעטוף מערכות חלבונים מורכבות יותר נקראת אנקפסולציה רציפה של ממשק טיפות (cDICE). כאן מוצגת שיטה מבוססת cDICE לעטיפה מהירה של חלבוני שלד ציטוסקטליים ב-GUVs עם יעילות אנקפסולציה גבוהה. בשיטה זו, ראשית, טיפות שומנים-חד-שכבתיות נוצרות על ידי תחליב של תמיסת חלבון בעלת עניין בתערובת שומנים/שמן. לאחר שמוסיפים אותם לתוך תא מודפס בתלת-ממד מסתובב, טיפות חד-שכבתיות אלה עוברות דרך מונו-שכבתי שומנים שני בממשק מים/שמן בתוך החדר כדי ליצור GUVs המכילים את מערכת החלבון. שיטה זו מפשטת את ההליך הכולל של אנקפסולציה בתוך GUVs ומאיצה את התהליך, ובכך מאפשרת לנו להגביל ולהתבונן באבולוציה הדינמית של הרכבת הרשת בתוך בועיות דו-שכבתיות של שומנים. פלטפורמה זו שימושית לחקר המכניקה של אינטראקציות שלד-ממברנה ציטוסקית בכליאה.
תאי דו-תאי ליפידים משמשים כתאים סינתטיים לדוגמה לחקר תגובות אורגניות סגורות ותהליכים מבוססי ממברנה או כמודלים נשאים ביישומי אספקת תרופות 1,2. ביולוגיה מלמטה למעלה עם רכיבים מטוהרים דורשת מערכות ניסוי מינימליות כדי לחקור תכונות ואינטראקציות בין ביומולקולות, כגון חלבונים ושומנים 3,4. עם זאת, עם התקדמות התחום, יש צורך גובר במערכות ניסוי מורכבות יותר המחקות טוב יותר את התנאים בתאים ביולוגיים. אנקפסולציה ב- GUVs היא גישה מעשית שיכולה להציע חלק מהתכונות דמויות התאים הללו על ידי מתן דו-שכבת שומנים מעוותת וחדירה באופן סלקטיבי ומרחב תגובה מוגבל. בפרט, שחזור חוץ גופי של מערכות שלד ציטוסקטליות, כמודלים של תאים סינתטיים, יכול להפיק תועלת מאנקפסולציה בתאי ממברנה5. חלבונים ציטוסקטליים רבים נקשרים ומתקשרים עם קרום התא. מכיוון שרוב מכלולי השלד הציטוסקטליים יוצרים מבנים המשתרעים על פני כל התא, צורתם נקבעת באופן טבעי על ידי כליאה בגודל תא6.
שיטות שונות משמשות ליצירת GUVs, כגון נפיחות 7,8, היתוך שלפוחית קטן 9,10, העברת תחליב11,12, סילון פועם13, וגישות מיקרופלואידיות אחרות14,15. למרות ששיטות אלה עדיין בשימוש, לכל אחת מהן יש את המגבלות שלה. לפיכך, גישה חזקה ופשוטה עם תפוקה גבוהה של אנקפסולציה GUV היא רצויה מאוד. אף על פי שטכניקות כגון נפיחות ספונטנית ואלקטרוסוולינג מאומצות באופן נרחב ליצירת GUVs, שיטות אלה תואמות בעיקר להרכבי שומנים ספציפיים16, מאגרי ריכוז מלח נמוכים17, גודל מולקולרי אנקפסולנטי קטן יותר18, ודורשים נפח גבוה של האנקפסולנט. התמזגות של שלפוחיות קטנות מרובות לתוך GUV היא שלילית מטבעה מבחינה אנרגטית, ולכן דורשת ספציפיות בהרכבי שומנים טעונים9 ו/או חומרים חיצוניים הגורמים לאיחוי, כגון פפטידים19 או כימיקלים אחרים. העברת תחליב ושיטות מיקרופלואידיות, לעומת זאת, עשויות לדרוש ייצוב טיפות באמצעות פעילי שטח והסרת ממסים לאחר היווצרות דו-שכבתית, בהתאמה18,20. המורכבות של מערך הניסוי והמכשיר בטכניקות מיקרופלואידיות כגון סילון פועם מטילים אתגר נוסף21. cDICE היא שיטה מבוססת אמולסיה הנגזרת מעקרונות דומים המסדירים העברת תחליב22,23. תמיסה מימית (תמיסה חיצונית) ותערובת שומנים-שמן מרובדים על ידי כוחות צנטריפוגליים בתא גלילי מסתובב (תא cDICE) היוצרים ממשק רווי שומנים. טפטוף של טיפות מימיות חד-שכבתיות של שומנים חד-שכבתיים לתוך תא ה-cDICE המסתובב גורם לרוכסן של דו-שכבתי כאשר טיפות חוצות את הממשק רווי השומנים אל תוך התמיסה המימית החיצונית22,24. גישת cDICE היא טכניקה חזקה עבור אנקפסולציה של GUV. עם השיטה המתוקנת המוצגת, לא רק תפוקת השלפוחית הגבוהה האופיינית ל- cDICE עם זמן אנקפסולציה קצר משמעותית (כמה שניות) מושגת, אלא שזמן יצירת GUV המאפשר תצפית על תהליכים תלויי זמן (למשל, היווצרות רשת ציטוסקטלית של אקטין ציטוסקלית) מצטמצם באופן משמעותי. הפרוטוקול לוקח בערך 15-20 דקות מההתחלה לאיסוף GUV והדמיה. כאן, יצירת GUV מתוארת באמצעות שיטת cDICE שעברה שינוי לעטיפת חלבונים קושרי אקטין ואקטין (ABPs). עם זאת, הטכניקה המוצגת ישימה לתמצות מגוון רחב של תגובות ביולוגיות ואינטראקציות עם ממברנות, החל מהרכבת ביופולימרים, דרך ביטוי חלבונים ללא תאים וכלה בהעברת מטען מבוססת היתוך ממברנה.
1. הכנת תערובת שמן-שומנים
הערה: הצעד צריך להתבצע במכסה אדים בהתאם לכל הנחיות הבטיחות לטיפול בכלורופורם.
2. יצירת שלפוחית
3. הדמיה ושחזור תמונה בתלת-ממד
כדי להדגים את הדור המוצלח של GUVs של שלדיים באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, נבנו מחדש מבנים של צרור קסין-אקטין ב-GUVs. Fascin הוא קרוסלינקר קצר של חוטי אקטין היוצר צרורות אקטין נוקשים המיושרים במקביל ומטוהר מ- E. coli כחלבון היתוך גלוטתיון-S-טרנספראז (GST)26. 5 μM של אקטין שוחזר לראשונה, כולל 0.5...
שיטות שונות ליצירת GUVs נחקרו ליצירת תאים סינתטיים עם זאת, המורכבות של ההליכים, זמן ממושך להשגת אנקפסולציה, הגבלת סוגי שומנים והרכב מולקולרי של האנקפסולנט, הצורך בכימיקלים לא פיזיולוגיים כדי להקל על אנקפסולציה, תפוקת GUV נמוכה וחוסר עקביות ביעילות האנקפסולציה המשיכו לאתגר חוקרים בתחום זה. ב?...
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
APL מכיר בתמיכה של מלגת מחקר של הומבולדט לחוקרים מנוסים ומהקרן הלאומית למדע (1939310 1817909) ומהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 EB030031).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
Fascin | homemade | N/A | |
F-buffer | homemade | N/A | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
G-buffer | homemade | N/A | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved