Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Özet

Bu makalede, kapsüllenmiş sitoiskelet proteinleri ile dev unilamellar veziküllerin hızlı üretimi için basit bir yöntem tanıtılmaktadır. Yöntemin, hapsetmede ve sitoiskelet-membran etkileşimlerinde sitoiskelet yapılarının aşağıdan yukarıya doğru resulaştırılmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Özet

Dev unilamellar veziküller (GUV'ler) sıklıkla biyolojik membran modelleri olarak kullanılır ve bu nedenle membranla ilişkili hücresel süreçleri in vitro olarak incelemek için harika bir araçtır. Son yıllarda, GUV'lar içindeki kapsüllemenin, hücre biyolojisi ve ilgili alanlarda sulandırma deneyleri için yararlı bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Geleneksel biyokimyasal sulandırmanın aksine, canlı hücrelerin içindeki hapsedilme koşullarını daha iyi taklit eder. GUV'lar içinde kapsülleme yöntemlerinin uygulanması genellikle kolay değildir ve başarı oranları laboratuvardan laboratuvara önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Daha karmaşık protein sistemlerini kapsüllemek için başarılı olduğu kanıtlanmış bir teknik, sürekli damlacık arayüzü çapraz kapsüllemesi (cDICE) olarak adlandırılır. Burada, GUV'larda sitoiskelet proteinlerinin yüksek kapsülleme verimliliğine sahip hızlı bir şekilde kapsüllenmesi için cDICE tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntemde, ilk olarak, bir lipit / yağ karışımında ilgilenilen bir protein çözeltisinin emülsifiye edilmesiyle lipit-tek katmanlı damlacıklar üretilir. Dönen bir 3D baskılı odaya eklendikten sonra, bu lipit tek katmanlı damlacıklar daha sonra protein sistemini içeren GUV'lar oluşturmak için odanın içindeki bir su / yağ arayüzünde ikinci bir lipit tek katmanından geçer. Bu yöntem, GUV'lar içindeki genel kapsülleme prosedürünü basitleştirir ve süreci hızlandırır ve böylece lipit çift katmanlı veziküller içindeki ağ montajının dinamik evrimini sınırlamamıza ve gözlemlememize olanak tanır. Bu platform, hapsedilmede sitoiskelet-membran etkileşimlerinin mekaniğini incelemek için kullanışlıdır.

Giriş

Lipid çift katmanlı bölmeler, kapalı organik reaksiyonları ve membran bazlı süreçleri incelemek için model sentetik hücreler olarak veya ilaç dağıtım uygulamalarında taşıyıcı modüller olarak kullanılır ^1,2. Saflaştırılmış bileşenlere sahip aşağıdan yukarıya biyoloji, proteinler ve lipitler gibi biyomoleküller arasındaki özellikleri ve etkileşimleri araştırmak için minimum deneysel sistemler gerektirir ^3,4. Bununla birlikte, alanın ilerlemesiyle birlikte, biyolojik hücrelerdeki koşulları daha iyi taklit eden daha karmaşık deneysel sistemlere olan ihtiyaç artmaktadır. GUV'larda kapsülleme, deforme edilebilir ve seçici olarak geçirgen bir lipit çift katmanı ve sınırlı bir reaksiyon alanı sağlayarak bu hücre benzeri özelliklerin bazılarını sunabilen pratik bir yaklaşımdır. Özellikle, sentetik hücrelerin modelleri olarak sitoiskelet sistemlerinin in vitro resusyonu, membran bölmelerinde kapsüllemeden yararlanabilir⁵. Birçok sitoiskelet proteini hücre zarına bağlanır ve etkileşime girer. Çoğu sitoiskelet düzeneği, hücrenin tamamını kapsayan yapılar oluşturduğundan, şekilleri doğal olarak hücre büyüklüğünde hapsetme⁶ ile belirlenir.

Şişlik^7,8, küçük vezikül füzyonu^9,10, emülsiyon transferi ^11,12, darbeli püskürtme 13 ve diğer mikroakışkan yaklaşımlar ^14,15 gibi ^GUV'ları üretmek için farklı yöntemler kullanılır. Bu yöntemler hala kullanılsa da, her birinin sınırlamaları vardır. Bu nedenle, yüksek GUV kapsülleme verimine sahip sağlam ve basit bir yaklaşım oldukça arzu edilir. GUV'ların oluşumu için spontan şişlik ve elektroşişme gibi teknikler yaygın olarak benimsenmesine rağmen, bu yöntemler öncelikle spesifik lipit bileşimleri¹⁶, düşük tuz konsantrasyonlu tamponlar 17, daha küçük kapsülleyici moleküler boyut¹⁸ ile uyumludur ve yüksek miktarda kapsülleyici gerektirir. Birden fazla küçük vezikülün bir GUV'ye kaynaştırılması doğal olarak enerjisel olarak elverişsizdir, bu nedenle yüklü lipit bileşimleri⁹ ve / veya peptidler¹⁹ veya diğer kimyasallar gibi harici füzyon indükleyici ajanlarda özgüllük gerektirir. Emülsiyon transferi ve mikroakışkan yöntemler ise çift katmanlı oluşumdan sonra yüzey aktif madde ve çözücü giderimi yoluyla damlacık stabilizasyonu gerektirebilir, sırasıyla^18,20. Darbeli püskürtme gibi mikroakışkan tekniklerdeki deneysel düzeneğin ve cihazın karmaşıklığı ek bir zorluk getirmektedir²¹. cDICE, emülsiyon transferi^22,23'ü yöneten benzer ilkelerden türetilen emülsiyon bazlı bir yöntemdir. Sulu bir çözelti (dış çözelti) ve bir lipit-yağ karışımı, lipit doymuş bir arayüz oluşturan dönen silindirik bir odada (cDICE odası) santrifüj kuvvetleri ile tabakalandırılır. Lipid tek katmanlı sulu damlacıkların dönen cDICE odasına sokulması, damlacıklar lipit doymuş arayüzü geçerek dış sulu çözelti ^22,24'e geçerken bir çift katmanın sıkıştırılmasına neden olur. cDICE yaklaşımı, GUV kapsüllemesi için sağlam bir tekniktir. Sunulan modifiye yöntemle, sadece önemli ölçüde daha kısa bir kapsülleme süresine (birkaç saniye) sahip cDICE için tipik olan yüksek vezikül verimi elde edilmekle kalmaz, aynı zamanda zamana bağlı süreçlerin (örneğin, aktin sitoiskelet ağı oluşumu) gözlemlenmesine izin veren GUV üretim süresi de önemli ölçüde azalır. Protokol başlangıçtan GUV toplama ve görüntülemeye kadar yaklaşık 15-20 dakika sürer. Burada, GUV üretimi, aktin ve aktin bağlayıcı proteinleri (ABP'ler) kapsüllemek için modifiye cDICE yöntemi kullanılarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, sunulan teknik, biyopolimerlerin montajından hücresiz protein ekspresyonuna, membran füzyon bazlı kargo transferine kadar çok çeşitli biyolojik reaksiyonları ve membran etkileşimlerini kapsüllemek için uygulanabilir.

Protokol

1. Yağ-lipit-karışımının hazırlanması

NOT: Adımın, kloroformun taşınması için tüm güvenlik kurallarına uygun olarak bir duman davlumbazında gerçekleştirilmesi gerekir.

1. 15 mL'lik bir cam şişede 0,5 mL kloroform alın. 15 ml'lik cam şişeye 88 μL 25 mg/mL dioleoyl-fosfokolin (DOPC), 9.3 μL 50 mg/mL kolesterol ve 5 μL 1 mg/mL dioleoyl-phosphoethanolamine-lissamine rhodamine B ( rodamin PE) ekleyin (bkz.
   NOT: Silikon yağı / mineral yağdaki DOPC ve kolesterolün son mol fraksiyonları sırasıyla% 69.9 ve% 30'dur. % 20-30 mol kolesterolün, sunulan teknik^25,26 kullanılarak üretilen GUV'ların membran akışkanlığı ve stabilitesi için optimize edilmiş bir konsantrasyon olduğu tespit edilmiştir. Fizyolojik olarak, bu değerler memeli hücre plazma membranlarında bulunan kolesterol konsantrasyon aralığındadır⁶. Lipid stokları kloroformda çözeltiler halinde elde edilir ve -20 °C'de depolanır. Lipid stok şişeleri açılmadan önce oda sıcaklığına alıştırılmalıdır.
2. Pipet, ikinci bir 15 mL şişede 7,2 mL silikon yağı ve 1,8 mL mineral yağ (bkz. Genel olarak, bunun düşük nemli bir torpido gözünde, özellikle mineral yağ yeniden kullanılıyorsa yapılması gerekir.
3. Yağları 10 s boyunca maksimum dönme hızında (3200 rpm) vorteks yaparak karıştırın, karışımı kloroform içindeki lipit karışımını içeren şişeye ekleyin ve hemen vorteks karıştırıcısına yerleştirin. Maksimum dönme hızında (3200 rpm) 10-15 s için vorteks. Elde edilen lipitler yağ içinde karışım hafif bulutlu olmalıdır, çünkü lipitler yağda tamamen çözünmez, bunun yerine küçük agregalar olarak dağılır²⁴.
4. Lipid-in-oil dispersiyonunu 80 W ultrasonik güce ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 40 kHz çalışma frekansına sahip bir banyo sonikatörüne ( Malzeme Tablosuna bakınız) koyun. Karışımı hemen kullanın veya maksimum 24 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.

2. Vezikül oluşumu

1. Siyah reçineden yapılmış 3D baskılı şaftı (Ek Dosya 1) tezgah üstü karıştırma plakasına monte edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve dönme hızını 1200 rpm'ye ayarlayın.
2. Şeffaf reçineden yapılmış 3D baskılı cDICE odasını (Ek Dosya 2) şaft üzerine monte edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 1A, B).
3. Aktin ve aktin bağlayıcı proteinler (ABP) çözeltilerini ayrı ayrı toplam 20 μL hacimde hazırlayın.
   1. Küresel aktin tamponunda (G-tamponu) %10 ATTO 488 aktin dahil olmak üzere 1-10 μM aktin hazırlayın (bkz.
      NOT: 1x G-tamponu 5 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 0.2 mM CaCl_2'den oluşur.
   2. Buz üzerinde aktin polimerizasyonuna başlamak için filamentli aktin polimerizasyon tamponu (F-tamponu) ekleyin. Bir çapraz bağlayıcı eklemeden önce aktin polimerizasyonunu yavaşlatmak için çözeltileri buz üzerinde tutun.
      NOT: 1x F-tamponu, 10 mM Tris, pH 7,5'te 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂ ve 3 mM ATP içerir.
   3. İstenilen molar oranda ilgilenilen çapraz bağlayıcıları eklemeden önce buz üzerinde aktin polimerizasyonunun başlatılmasına izin vermek için 15 dakika bekleyin. Kapsüllenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.
   4. Aktin bağlayıcı proteinleri (ABP'ler) bir mikrotüp içinde ayrı ayrı hazırlayın (Şekil 1C).
      NOT: Bu adım, ABP'lerin bir kombinasyonu (örneğin, miyosin, α-aktinin, fasist, Arp2/3 kompleksi) aktin^25,26,27 ile kapsüllendiğinde gerçekleştirilir. Bu gibi durumlarda, her ABP'nin istenen miktarı stoklarından çekilir ve ABP'ler için belirlenen mikrotüpe eklenir. Toplam çözelti 20 μL olacağından, ABP'lerin stok alikotları, toplam ABP karışımının istenen miktarı 5-6 μL'yi geçmeyecek şekilde hazırlanmalıdır. Buradaki temsili sonuçlarda kullanılan tek ABP, hazırlanması aşağıda belirtilen büyüleyicidir.
      1. 1.75 mg/mL'lik bir fasin stoğundan 1.57 μL fasin (bakınız Malzeme Tablosu) ve adım 2.7'de doğrudan aktin çözeltisine eklenir. Bu, çözeltideki 2.5 μM büyüsüne karşılık gelir.
4. GUV çökelmesini kolaylaştırmak için dış ve iç sulu faz arasında bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için aktin çözeltisine yoğunluk gradyanı ortamının% 7,5'ini ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
5. 200 mM glikozun dış çözeltisinin 700 μL'sini odaya dağıtın (Şekil 1D, solda).
   NOT: İç çözeltinin ozmolaritesi, glikoz konsantrasyonunu belirler. Bu deneyler için, iç çözeltinin ozmolaritesi ~ 200 mOsm'dur, bu nedenle dış çözelti olarak 200 mM'lik bir glikoz çözeltisi kullanılır.
6. Odanın% 60-80'i dolana kadar odaya yeterli miktarda lipit-yağ karışımı (oda boyutuna göre >3 mL) ekleyin (Şekil 1D, sağ). Lipit-yağ karışımı ile dış çözelti arasında bir arayüz oluşturulacaktır.
7. ABP'leri (adım 2.3.4'te hazırlanan) aktin çözeltisine aktarın. Normal bir 100-1000 μL pipet kullanarak, lipit-yağ karışımının 700 μL'sini derhal aktin-ABP karışımına aktarın (Şekil 1E, sol). Çapı 7-100 μm aralığında olan hücre boyutunda lipid tek katmanlı damlacıklar oluşturmak için 8 kez yukarı ve aşağı pipet alın (Şekil 1E, orta).
   NOT: Kapsüllemeden önce herhangi bir aktin ağ montajını önlemek için Adım 2.7'nin birkaç saniye içinde tamamlanması gerekir. Bu nedenle, adımı gerçekleştirmeden önce, pipet uçlarının pipetlere zaten takılı olduğundan ve karışımları aktarmaya hazır olduğundan emin olun.
8. Aynı 100-1000 μL pipeti kullanarak, tüm emülsiyonu derhal dönen odaya dağıtın. Damlacıklar, lipit tek tabakasını yağ-dış çözelti arayüzünde geçerek ikinci bir lipit broşürü elde edecek ve böylece GUV'lar oluşturacaktır (Şekil 1E, sağda).
9. Odayı karıştırma plakasından çıkarın ve odayı atık kabına eğerek lipit-yağ karışımının çoğunu atın, böylece lipit-yağ karışımının büyük bir kısmı odanın ortasındaki büyük açıklıktan boşaltılır.
   NOT: Bu şekilde, lipit-yağ karışımı haznenin dışına çekilir ve bir sonraki adımda lipit-yağ karışımının dış çözelti ile karıştırılmasını önler.
10. Odayı, kapağı kullanıcıya bakacak şekilde tutun. Oda kapağını açın ve odayı kullanıcıya doğru hafifçe eğin. GUV'ları içeren dış çözelti ile lipit-yağ karışımı arasındaki arayüz, hazne açıklığından (kapağın bulunduğu yerden) görülebilir.
11. Bir pipet kullanarak, GUV'ler içeren yeterli dış çözeltiyi toplayın ve uygun bir GUV yoğunluğu elde etmek için dış çözeltinin 50-300 μL'sini 96 delikli bir plakaya dağıtın.
    NOT: Bu protokolü takiben, hazne içindeki dış çözeltide toplam yaklaşık 2 x 10⁵ GUV'ler serbest bırakılır. GUV dağılımı ölçülmedi; Bununla birlikte, GUV'ların yaklaşık% 90'ının çapı 12-30 μm aralığındadır. popülasyonda 7-50 μm aralığında herhangi bir çapa sahip GUV'lar bulunabilir. Kapsüllenmiş yoğunluk gradyanı ortamına, GUV boyutuna ve kuyu plakasındaki çözelti derinliğine bağlı olarak, GUV'ların yüzeye yerleşmesi 2-15 dakika sürer. Yeniden yapılandırılmış aktin demetlerine sahip GUV'ların verimi yaklaşık% 90'dır.

3. Görüntüleme ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu

1. 96 kuyu plakasını, dönen disk (veya lazer tarama) konfokal ünitesi, bir EMCCD veya bir sCMOS kamera ve bir yağ daldırma 60x objektif lens ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin (bkz.
2. Herhangi bir ilgi alanına (ROI) odaklanın ve 0,5 μm z-adım aralığıyla ROI'den bir z-stack görüntü dizisi alın.
   NOT: GUV'ler zaman içinde yüzeyde hafifçe yer değiştirebildiğinden, birden fazla florofor görüntüleniyorsa, her z-düzleminde çok dalga boyunda bir görüntü kümesi yakalamanız önerilir, yani ATTO 488 aktin ve Rhod PE görüntülerini yakalamak için her bir z-şeridinde bir seferde 561 nm ve 488 nm görüntü grubu alın.
3. Her z-stack görüntü dizisini .tiff formatında kaydedin.
4. Bir görüntü işleme yazılımında (ImageJ/Fiji) ilgilendiğiniz bir görüntü dizisini açın. Görüntüyü en yüksek yoğunlukta tanımlayın. Parlaklık ve Kontrast penceresini açmak için "ctrl + shift + c" tuşlarını basılı tutun ve Sıfırla'ya tıklayın.
5. ImageJ/Fiji menüsünden, Analiz > Ölçek Ayarla'ya gidin ve her görüntü pikseli için bilinen fiziksel mesafeyi ve birimini girin.
6. ImageJ/Fiji menüsünden, z-yığınından bir 3B görüntüyü yeniden oluşturmak için Görüntü > Yığınları > 3B projesine gidin. "Projeksiyon yöntemi"ni Parlaklık Noktası, "Dilim Aralığı (μm)" değerini 0,5 olarak ayarlayın ve İnterpolat onay işaretini işaretleyin. Varsayılan seçenekler, ayarların geri kalanı için kullanılabilir.
   NOT: Bazı mikroskoplardaki z-aralıkları kalibre edilemeyebilir ve z-yönündeki gerçek hareket girilen z-aralığından (yani 0,5 μm) biraz farklı olabilir. Bu gibi durumlarda, gerçek z-aralığını elde etmek için bilinen bir çapa sahip floresan mikrosferler gibi bir 3D kalibrasyon örneği kullanılabilir. Bu nedenle bu değer, 3B projeksiyon için "Dilim Aralığı (μm)" olarak kullanılacaktır.

Sonuçlar

Mevcut protokol kullanılarak sitoiskelet GUV'larının başarılı bir şekilde üretildiğini göstermek için, GUV'lardaki fasin-aktin demet yapıları yeniden oluşturulmuştur. Fascin, sert paralel hizalanmış aktin demetleri oluşturan ve E. coli'den Glutatyon-S-Transferaz (GST) füzyon proteini²⁶ olarak saflaştırılan aktin filamentlerinin kısa bir çapraz bağlayıcısıdır. Aktin polimerizasyon tamponunda 0.53 μM ATTO488 aktin ve yoğunluk gradyan ortamının% 7.5'i dahil o...

Tartışmalar

Bununla birlikte, sentetik hücrelerin oluşturulması için GUV'ler üretmenin farklı yöntemleri araştırılmıştır Bununla birlikte, prosedürlerin karmaşıklığı, kapsüllemeye ulaşmak için uzatılmış süre, kapsüllemenin lipit tiplerinin ve kapsülleyicinin moleküler bileşiminin kısıtlanması, kapsüllemeyi kolaylaştırmak için fizyolojik olmayan kimyasallara duyulan ihtiyaç, düşük GUV verimi ve kapsülleme verimliliğindeki tutarsızlıklar bu alandaki araştırmacıları zorlamaya devam etmi?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667