Быстрая инкапсуляция восстановленного цитоскелета внутри гигантских одноцветных везикул

Резюме

В данной статье представлен простой метод ускоренного производства гигантских одноламеллярных везикул с инкапсулированными цитоскелетными белками. Метод оказывается полезным для восстановления цитоскелетных структур снизу вверх в конфайнменте и взаимодействиях цитоскелет-мембрана.

Аннотация

Гигантские одноламеллярные везикулы (GUV) часто используются в качестве моделей биологических мембран и, таким образом, являются отличным инструментом для изучения клеточных процессов in vitro, связанных с мембраной. В последние годы инкапсуляция в ГУВ оказалась полезным подходом для экспериментов по восстановлению в клеточной биологии и смежных областях. Он лучше имитирует условия удержания внутри живых клеток, в отличие от обычного биохимического восстановления. Методы инкапсуляции внутри ГУВ часто нелегко реализовать, и показатели успеха могут значительно отличаться от лаборатории к лаборатории. Один из методов, который оказался успешным для инкапсуляции более сложных белковых систем, называется непрерывной инкапсуляцией пересечения интерфейса капель (cDICE). Здесь представлен метод на основе cDICE для быстрой инкапсуляции цитоскелетных белков в ГУВ с высокой эффективностью инкапсуляции. В этом способе, во-первых, липидно-монослойные капли получают путем эмульгирования белкового раствора, представляющего интерес, в липидно-масляной смеси. После добавления во вращающуюся 3D-печатную камеру эти липидно-монослойные капли затем проходят через второй липидный монослой на границе раздела вода/масло внутри камеры с образованием ГУВ, содержащих белковую систему. Этот метод упрощает общую процедуру инкапсуляции в ГУВ и ускоряет процесс, и, таким образом, позволяет ограничить и наблюдать динамическую эволюцию сетевой сборки внутри липидных двухслойных везикул. Эта платформа удобна для изучения механики цитоскелетно-мембранных взаимодействий в конфайнменте.

Введение

Липидные двухслойные компартменты используются в качестве модельных синтетических клеток для изучения замкнутых органических реакций и мембранных процессов или в качестве модулей-носителей в приложениях доставки лекарств ^1,2. Биология снизу вверх с очищенными компонентами требует минимальных экспериментальных систем для изучения свойств и взаимодействий между биомолекулами, такими как белки и липиды ^3,4. Однако с развитием этой области возрастает потребность в более сложных экспериментальных системах, которые лучше имитируют условия в биологических клетках. Инкапсуляция в ГУВ является практическим подходом, который может предложить некоторые из этих клеточных свойств, обеспечивая деформируемый и селективно проницаемый липидный бислой и ограниченное реакционное пространство. В частности, восстановление in vitro цитоскелетных систем, как моделей синтетических клеток, может извлечь выгоду из инкапсуляции в мембранных компартментах⁵. Многие цитоскелетные белки связываются и взаимодействуют с клеточной мембраной. Поскольку большинство цитоскелетных сборок образуют структуры, которые охватывают всю клетку, их форма естественным образом определяется удержанием размером с клетку⁶.

Для генерации ГУВ используются различные методы, такие как набухание ^7,8, слияние малых^{пузырьков 9,10}, перенос эмульсии ^11,12, импульсная струя¹³ и другие микрофлюидные подходы ^14,15. Хотя эти методы все еще используются, каждый из них имеет свои ограничения. Таким образом, очень желателен надежный и простой подход с высокой урожайностью инкапсуляции ГУВ. Хотя такие методы, как спонтанное набухание и электросвеличивание, широко распространены для образования ГУВ, эти методы в первую очередь совместимы со специфическими липидными композициями¹⁶, буферами с низкой концентрацией соли¹⁷, меньшим размером молекулы инкапсуланта¹⁸ и требуют большого объема инкапсулянта. Слияние нескольких мелких пузырьков в ГУВ по своей природе энергетически неблагоприятно, что требует специфичности в заряженных липидных композициях⁹ и/или внешних агентах, вызывающих слияние, таких как пептиды¹⁹ или другие химические вещества. С другой стороны, перенос эмульсии и микрофлюидные методы могут потребовать стабилизации капель путем удаления поверхностно-активного вещества и растворителя после образования бислоя, соответственно^18,20. Сложность экспериментальной установки и устройства в микрофлюидных методах, таких как импульсная струйная обработка, создает дополнительную проблему²¹. cDICE представляет собой метод на основе эмульсии, полученный из аналогичных принципов^, регулирующих перенос эмульсии ^22,23. Водный раствор (наружный раствор) и липидно-масляная смесь стратифицируются центробежными силами во вращающейся цилиндрической камере (камере cDICE), образуя насыщенную липидами границу раздела. Перемещение липидных монослойных водных капель во вращающуюся камеру cDICE приводит к застегиванию бислоя, поскольку капли пересекают насыщенную липидами границу в наружный водный раствор ^22,24. Подход cDICE является надежным методом инкапсуляции GUV. При представленном модифицированном способе достигается не только высокий выход пузырьков, характерный для cDICE со значительно более коротким временем инкапсуляции (несколько секунд), но и время генерации ГУВ, позволяющее наблюдать зависимые от времени процессы (например, формирование актиновых цитоскелетных сетей), значительно сокращается. Протокол занимает около 15-20 минут от начала сбора и визуализации GUV. Здесь генерация GUV описывается с использованием модифицированного метода cDICE для инкапсуляции актина и актин-связывающих белков (ABP). Однако представленный способ применим для инкапсуляции широкого спектра биологических реакций и мембранных взаимодействий, от сборки биополимеров до бесклеточной экспрессии белка и переноса груза на основе мембранного слияния.

протокол

1. Приготовление масляно-липидной смеси

ПРИМЕЧАНИЕ: Этап должен быть выполнен в вытяжном шкафу в соответствии со всеми рекомендациями по безопасности при обращении с хлороформом.

1. Возьмите 0,5 мл хлороформа в стеклянном флаконе объемом 15 мл. Добавьте 88 мкл 25 мг/мл диолеоил-фосфохолина (DOPC), 9,3 мкл холестерина 50 мг/мл и 5 мкл 1 мг/мл диолеоил-фосфоэтаноламина-лизрамина родамина B (родамин ПЭ) (см. Таблицу материалов) в стеклянный флакон объемом 15 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные молевые фракции DOPC и холестерина в силиконовом масле/минеральном масле составляют 69,9% и 30% соответственно. Установлено, что 20-30 моль% холестерина является оптимизированной концентрацией для мембранной текучести и стабильности ГУВ, генерируемых по представленной методике^25,26. Физиологически эти значения находятся в пределах диапазона концентраций холестерина, обнаруженного в плазматических мембранах клеток млекопитающих⁶. Запасы липидов получают в виде растворов хлороформа и хранят при -20 °C. Флаконы с липидным запасом должны быть акклиматизированы до комнатной температуры перед их открытием.
2. Пипетка 7,2 мл силиконового масла и 1,8 мл минерального масла во втором флаконе объемом 15 мл (см. Таблицу материалов). Как правило, это нужно делать в бардачке с низкой влажностью, в основном, если минеральное масло используется повторно.
3. Смешайте масла путем вихря на максимальной скорости вращения (3200 об/мин) в течение 10 с, добавьте смесь во флакон, содержащий липидно-хлороформную смесь, и немедленно поместите ее на вихревой смеситель. Вихрь на 10-15 с при максимальной скорости вращения (3200 об/мин). Полученная смесь липидов в масле должна быть слегка мутной, так как липиды не полностью растворяются в масле, а скорее диспергируются в виде мелких агрегатов²⁴.
4. Поместите дисперсию липидов в масле в ультразвуковой аппарат ванны (см. Таблицу материалов) с ультразвуковой мощностью 80 Вт и рабочей частотой 40 кГц при комнатной температуре в течение 30 мин. Используйте смесь немедленно или храните при температуре 4 °C в течение максимум 24 ч.

2. Генерация везикул

1. Установите 3D-печатный вал (дополнительный файл 1), изготовленный из черной смолы (см. Таблицу материалов) на настольной перемешиваемой пластине и установите скорость вращения до 1200 об/мин.
2. Установите на вал 3D-печатную камеру cDICE (Дополнительный файл 2), изготовленную из прозрачной смолы (см. Таблицу материалов) (рисунок 1A,B).
3. Готовят растворы актина и актин-связывающих белков (АБП) по отдельности в общем объеме 20 мкл.
   1. Получают 1-10 мкМ актина в глобулярном актиновом буфере (G-буфере), включая 10% актина ATTO 488 (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x G-буфер содержит 5 мМ Tris-HCl, pH 8,0 и 0,2 мМ CaCl₂.
   2. Добавьте нитевидный буфер полимеризации актина (F-буфер), чтобы начать полимеризацию актина на льду. Держите растворы на льду, чтобы замедлить полимеризацию актина перед добавлением сшивателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x F-буфер содержит 50 мМ KCl, 2 мМ_MgCl2 и 3 мМ АТФ в 10 мМ Tris, рН 7,5.
   3. Подождите 15 минут, чтобы обеспечить начало полимеризации актина на льду, прежде чем добавлять интересующие сшиватели в желаемом молярном соотношении. Держите раствор на льду до инкапсуляции.
   4. Получают актин-связывающие белки (ABP) отдельно в микропробирке (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется, когда комбинация ABP (например, миозин, α-актинин, фазцин, комплекс Arp2/3) инкапсулируется с актином 25,26,27. В таких случаях желаемое количество каждого ABP извлекается из его запаса и добавляется в микропробирку, предназначенную для ABP. Поскольку общий раствор должен составлять 20 мкл, запасы АЛКВО должны быть подготовлены таким образом, чтобы желаемое количество общей смеси АВП не превышало 5-6 мкл. Единственным ABP, используемым в репрезентативных результатах здесь, является фасцин, препарат которого упомянут ниже.
      1. Аликвот 1,57 мкл фасцина из 1,75 мг/мл запаса фасцина (см. Таблицу материалов) и непосредственно добавляют в раствор актина на стадии 2.7. Это соответствует 2,5 мкМ фазцина в растворе.
4. Добавьте 7,5% среды градиента плотности (см. Таблицу материалов) в раствор актина для создания градиента плотности между внешней и внутренней водной фазами для облегчения осаждения ГУВ.
5. Дозировать 700 мкл наружного раствора 200 мМ глюкозы в камеру (рисунок 1D, слева).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осмолярность внутреннего раствора определяет концентрацию глюкозы. Для этих экспериментов осмолярность внутреннего раствора составляет ~200 мОсм, поэтому в качестве наружного раствора используется раствор глюкозы 200 мМ.
6. Добавьте достаточное количество липидно-масляной смеси (>3 мл в зависимости от размера камеры) в камеру до тех пор, пока не будет заполнено 60-80% камеры (рисунок 1D, справа). Между липидно-масляной смесью и наружным раствором образуется интерфейс.
7. Переведите ABP (приготовленные на этапе 2.3.4) в раствор актина. Используя обычную пипетку объемом 100-1000 мкл, немедленно переложите 700 мкл липидно-масляной смеси в смесь актин-АБФ (рисунок 1Е, слева). Пипетка вверх и вниз 8 раз для получения липидно-монослойных капель размером с клетку диаметром в пределах 7-100 мкм (рисунок 1Е, средний).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.7 должен быть выполнен за несколько секунд, чтобы избежать сборки сети актина перед инкапсуляцией. Таким образом, перед выполнением этапа убедитесь, что наконечники пипеток уже вставлены в пипетки и готовы к переносу смеси.
8. Используя ту же пипетку объемом 100-1000 мкл, немедленно дозируйте всю эмульсию во вращающуюся камеру. Капли приобретают второй листок липидов, пересекая монослой липидов на границе раздела масло-внешний раствор, тем самым образуя ГУВ (рисунок 1E, справа).
9. Снимите камеру с перемешиваемой пластины и выбросьте большую часть липидно-масляной смеси, наклонив камеру в контейнере для отходов так, чтобы большая часть липидно-масляной смеси была слита из большого отверстия в центре камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, липидно-масляная смесь вытягивается из камеры, избегая смешивания липидно-масляной смеси с наружным раствором на следующей стадии.
10. Держите камеру крышкой лицом к пользователю. Откройте крышку камеры и слегка наклоните камеру в сторону пользователя. Интерфейс между наружным раствором, содержащим ГУВ, и липидно-масляной смесью виден из отверстия камеры (где расположена крышка).
11. Используя пипетку, соберите достаточное количество наружного раствора, содержащего ГУВ, и дозируйте 50-300 мкл наружного раствора в 96-луночную пластину для получения соответствующей плотности ГУВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя этому протоколу, в общей сложности около 2 х 10⁵ ГУВ высвобождаются во внешнем растворе внутри камеры. Дисперсия ГУВ не была количественно определена; однако диаметр около 90% ГУВ находится в пределах 12-30 мкм. ГУВ с любым диаметром в диапазоне 7-50 мкм можно встретить в популяции. В зависимости от инкапсулированной среды градиента плотности, размера ГУВ и глубины раствора в плите скважины, ГУВ оседанию на поверхности требуется 2-15 мин. Выход ГУВ с восстановленными актиновыми пучками составляет около 90%.

3. Визуализация и реконструкция 3D-изображений

1. Установите пластину из 96 скважин на сцене перевернутого микроскопа, оснащенного вращающимся дисковым (или лазерным сканированием) конфокальным блоком, камерой EMCCD или sCMOS и объективом с погружением в масло 60x (см. Таблицу материалов).
2. Сосредоточьтесь на любой интересующей области (ROI) и возьмите последовательность изображений z-стека из ROI с интервалом z-шага 0,5 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ГУВ могут быть слегка смещены на поверхности с течением времени, рекомендуется захватывать многоволновый набор изображений в каждой z-плоскости, если визуализируется несколько флуорофоров, т. Е. Делать группу изображений 561 нм и 488 нм на каждой z-полосе за раз, чтобы захватить изображения АКТИНА ATTO 488 и RHOD PE.
3. Сохраните каждую последовательность изображений z-стека в .tiff формате.
4. Откройте интересующую последовательность изображений в программном обеспечении для обработки изображений (ImageJ/Fiji). Определите изображение с наибольшей интенсивностью. Удерживайте «ctrl + shift + c», чтобы открыть окно «Яркость и контрастность», и нажмите « Сброс».
5. В меню ImageJ/Fiji перейдите в раздел Анализ > Установить масштаб и введите известное физическое расстояние и его единицу измерения для каждого пикселя изображения.
6. В меню ImageJ/Fiji перейдите в раздел Image > Stacks > 3D-проект , чтобы реконструировать 3D-изображение из z-стека. Установите «Метод проекции» в качестве точки яркости, «Интервал между срезами (мкм)» в 0,5 и установите флажок Интерполировать. Параметры по умолчанию можно использовать для остальных параметров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: z-интервалы в некоторых микроскопах могут не калиброваться, и фактическое движение в z-направлении может незначительно отличаться от введенного z-интервала (т.е. 0,5 мкм). В таких случаях 3D-калибровочный образец, такой как флуоресцентные микросферы с известным диаметром, может быть использован для получения фактического z-интервала. Таким образом, это значение будет использоваться как «Интервал между срезами (мкм)» для 3D-проекции.

Результаты

Чтобы продемонстрировать успешную генерацию цитоскелетных ГУВ с использованием текущего протокола, были восстановлены структуры пучков фасцин-актин в ГУВ. Фасцин представляет собой короткий сшиватель актиновых нитей, который образует жесткие параллельно выровненные пучки актина и ...

Обсуждение

Различные методы генерации ГУВ были изучены для создания синтетических клеток Однако сложность процедур, длительное время для достижения инкапсуляции, ограничение типов липидов и молекулярного состава инкапсулянта, потребность в нефизиологических химических веществах для облегчен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667