巨型单层囊泡内重组细胞骨架的快速封装

摘要

本文介绍了一种简单的方法，用于快速生产具有包封细胞骨架蛋白的巨型单层囊泡。该方法被证明可用于自下而上的细胞骨架结构在约束和细胞骨架 - 膜相互作用中的重建。

摘要

巨型单层囊泡（GUV）经常被用作生物膜的模型，因此是 研究体外膜相关细胞过程的绝佳工具。近年来，GUV中的封装已被证明是细胞生物学和相关领域重建实验的有用方法。它更好地模拟活细胞内的限制条件，而不是传统的生化重建。在GUV内部封装的方法通常不容易实施，并且不同实验室的成功率可能会有很大差异。一种已被证明可以成功封装更复杂的蛋白质系统的技术称为连续液滴界面交叉封装（cDICE）。这里提出了一种基于cDICE的方法，用于在GUV中快速包封细胞骨架蛋白，具有高包封效率。在该方法中，首先，通过在脂质/油混合物中乳化感兴趣的蛋白质溶液来产生脂质 - 单层液滴。在被添加到旋转的3D打印室后，这些脂质单层液滴随后在腔室内的水/油界面处通过第二个脂质单层，形成含有蛋白质系统的GUV。该方法简化了GUV内封装的整体过程并加快了该过程，从而使我们能够限制和观察脂质双层囊泡内网络组装的动态演变。该平台对于研究禁闭中细胞骨架 - 膜相互作用的力学非常方便。

引言

脂质双层隔室用作模型合成细胞，用于研究封闭的有机反应和基于膜的过程，或用作药物递送应用中的载体模块^1，2。具有纯化成分的自下而上的生物学需要最少的实验系统来探索生物分子（例如蛋白质和脂质）之间的性质和相互作用^3，4。然而，随着该领域的进步，对更复杂的实验系统的需求增加，这些系统可以更好地模仿生物细胞中的条件。GUV中的包封是一种实用的方法，可以通过提供可变形和选择性渗透的脂质双层和有限的反应空间来提供一些这些细胞样特性。特别是，细胞骨架系统的 体外 重建，作为合成细胞的模型，可以从膜室⁵中的包封中受益。许多细胞骨架蛋白与细胞膜结合并相互作用。由于大多数细胞骨架组装形成跨越整个细胞的结构，因此它们的形状自然由细胞大小的限制⁶决定。

使用不同的方法来产生GUV，例如溶胀^7，8，小囊泡融合^9，10，乳液转移^11，12，脉冲喷射¹³，以及其它微流体方法^14，15。尽管这些方法仍在使用，但每种方法都有其局限性。因此，非常需要一种具有高GUV封装率的稳健而直接的方法。尽管诸如自发溶胀和电膨胀之类的技术被广泛用于GUV的形成，但这些方法主要与特定的脂质组合物¹⁶，低盐浓度缓冲液¹⁷，较小的封装胶分子尺寸¹⁸相容，并且需要大量封装胶。将多个小囊泡融合到GUV中本质上是不利于能量的，因此需要在带电脂质组合物⁹ 和/或外部融合诱导剂（例如肽¹⁹或其他化学物质）中具有特异性。另一方面，乳液转移和微流体方法可能需要在双层形成后通过表面活性剂和溶剂去除来稳定液滴，分别为^18，20。微流体技术（如脉冲喷射）中实验设置和装置的复杂性带来了额外的挑战²¹。cDICE是一种基于乳液的方法，其衍生自类似的支配乳液转移的原理^22，23。水溶液（外溶液）和脂质油混合物在旋转圆柱形室（cDICE室）中通过离心力分层，形成脂质饱和界面。将脂质单层水滴穿梭到旋转的cDICE室中导致双层的拉链，因为液滴穿过脂质饱和界面进入外层水溶液^22，24。cDICE方法是一种用于GUV封装的强大技术。使用所提出的改进方法，不仅可以实现cDICE典型的高囊泡产量，并且具有显着缩短的封装时间（几秒钟），而且允许观察时间依赖性过程（例如，肌动蛋白细胞骨架网络形成）的GUV生成时间显着降低。该方案从开始到GUV收集和成像大约需要15-20分钟。在这里，GUV的产生是使用修饰的cDICE方法包封肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白（ABP）来描述的。然而，所提出的技术适用于包封广泛的生物反应和膜相互作用，从生物聚合物的组装到无细胞蛋白质表达再到基于膜融合的货物转移。

研究方案

1. 油脂混合物的制备

注意:该步骤需要在通风橱中按照处理氯仿的所有安全指南进行。

1. 在15毫升玻璃小瓶中取0.5毫升氯仿。将88μL的25mg / mL二油酰基磷酸胆碱（DOPC），9.3μL的50mg / mL胆固醇和5μL的1mg / mL二分子酰基 - 磷酸乙醇胺 - 赖胺罗丹明B（罗丹明PE）（参见 材料表）加入15ml玻璃小瓶中。
   注意:硅油/矿物油中DOPC和胆固醇的最终摩尔分数分别为69.9%和30%。确定20-30摩尔%胆固醇是使用所提出的技术^25，26生成的GUV的膜流动性和稳定性的优化浓度。从生理学上讲，这些值完全在哺乳动物细胞质膜⁶中发现的胆固醇浓度范围内。脂质储备作为氯仿溶液获得并储存在-20°C。 脂质储备瓶在打开之前应适应室温。
2. 将7.2 mL硅油和1.8 mL矿物油移液到第二个15 mL小瓶中（参见 材料表）。一般来说，这需要在低湿度的手套箱中完成，主要是在矿物油重复使用的情况下。
3. 通过以最大转速（3200rpm）涡旋混合油10秒，将混合物加入含有氯仿脂质混合物的小瓶中，并立即将其置于涡旋混合器上。在最大转速 （3200 rpm） 下涡旋 10-15 秒。所得的油中脂质混合物应略微浑浊，因为脂质没有完全溶解在油中，而是分散为小聚集体²⁴。
4. 将油中脂质分散体置于浴式超声处理器（见 材料表）中，超声功率为80 W，工作频率为40 kHz，室温下30分钟。立即使用混合物或在4°C下储存最多24小时。

2. 囊泡生成

1. 将黑色树脂制成的3D打印轴（补充文件1）安装在台式搅拌板上，并将转速设置为1200 rpm。
2. 将由透明树脂制成的3D打印cDICE室（补充文件2）安装在轴上（图1A，B）。
3. 分别制备肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白（ABP）溶液，总体积为20μL。
   1. 在球状肌动蛋白缓冲液（G缓冲液）中制备1-10μM肌动蛋白，包括10%ATTO 488肌动蛋白（见 材料表）。
      注意:1x G缓冲液包括5 mM的Tris-HCl，pH 8.0和0.2 mM的CaCl₂。
   2. 加入丝状肌动蛋白聚合缓冲液（F缓冲液）开始在冰上进行肌动蛋白聚合。在加入交联剂之前，将溶液保存在冰上以减缓肌动蛋白聚合。
      注意:1x F缓冲液含有50 mM的KCl，2 mM的MgCl₂和3 mM的ATP，10 mM的Tris，pH 7.5。
   3. 等待15分钟以允许在冰上启动肌动蛋白聚合，然后以所需的摩尔比加入感兴趣的交联剂。将溶液保存在冰上，直到封装。
   4. 在微管中分别制备肌动蛋白结合蛋白（ABPs）（图1C）。
      注意:当ABPs（例如，肌球蛋白，α肌动蛋白，fascin，Arp2/3复合物）与肌动蛋白^25，26，27组合封装时^，执行此步骤。在这种情况下，从其库存中提取所需量的每个ABP并添加到指定用于ABP的微管中。由于总溶液为20μL，因此必须制备ABP的原液等分试样，以使总ABP混合物的所需量不超过5-6μL。此处代表性结果中使用的唯一ABP是fascin，其制备方法如下所述。
      1. 从1.75mg / mL的fascin储备中等分1.57μL法菌素（参见 材料表），并在步骤2.7中直接加入到肌动蛋白溶液中。这相当于溶液中2.5μM的筋膜。
4. 在肌动蛋白溶液中加入7.5%的密度梯度介质（见 材料表），在外水相和内水相之间形成密度梯度，便于GUV沉降。
5. 将700μL200mM葡萄糖的外溶液分配到腔室中（图1D，左）。
   注意:内部溶液的渗透压决定了葡萄糖的浓度。对于这些实验，内溶液的渗透压约为200 mOsm，因此使用200 mM葡萄糖溶液作为外溶液。
6. 向腔室中加入足够量的脂油混合物（根据腔室尺寸>3 mL），直到填充腔室的60%-80%（图1D，右）。在脂油混合物和外溶液之间将形成界面。
7. 将ABPs（在步骤2.3.4中制备）转移到肌动蛋白溶液中。使用常规的100-1000μL移液器，立即将700μL脂质油混合物转移到肌动蛋白 - ABP混合物中（图1E，左）。上下移液8次，以产生细胞大小的脂质单层液滴，直径范围为7-100μm（图1E，中间）。
   注:步骤2.7需要在几秒钟内完成，以避免封装前出现任何肌动蛋白网络组装。因此，在执行该步骤之前，请确保移液器吸头已插入移液器并准备转移混合物。
8. 使用相同的100-1000μL移液器，立即将整个乳液分配到旋转室中。液滴将通过在油 - 外溶液界面处穿过脂质单层来获得第二个小叶，从而形成GUV（图1E，右）。
9. 从搅拌板上取出腔室，并通过在废物容器中倾斜腔室来丢弃大部分脂油混合物，以便从腔室中心的大开口中排出大部分脂油混合物。
   注意:通过这种方式，将脂质 - 油混合物从腔室中抽出，避免脂质 - 油混合物与下一步中的外部溶液混合。
10. 握住腔室，其盖子朝向用户。打开腔室盖，将腔室向用户稍微倾斜。含有GUV的外溶液与脂油混合物之间的界面从腔室开口（盖子所在的位置）可见。
11. 使用移液器，收集足够的含有GUV的外部溶液，并将50-300μL外部溶液分配到96孔板中以获得适当密度的GUV。
    注意:按照该协议，在腔室内的外部溶液中总共释放约2 x 10⁵ GUV。GUV分散性未量化;然而，大约90%的GUV的直径在12-30μm的范围内，在群体中可以找到任何直径在7-50μm范围内的GUV。根据孔板中封装的密度梯度介质，GUV尺寸和溶液深度，GUV在表面上沉降需要2-15分钟。具有重组肌动蛋白束的GUV的收率约为90%。

3. 成像和3D图像重建

1. 将96孔板设置在配备旋转盘（或激光扫描）共聚焦单元，EMCCD或sCMOS相机以及油浸式60x物镜的倒置显微镜的载物台上（参见 材料表）。
2. 聚焦于任何感兴趣区域 （ROI），并从 ROI 中获取 z 轴堆栈图像序列，z 步长间隔为 0.5 μm。
   注意:由于GUV会随着时间的推移在表面上略微位移，因此如果对多个荧光团进行成像，建议在每个z平面上捕获一组多波长图像，即一次在每个z通道上拍摄一组561nm和488nm的图像，以捕获ATTO 488肌动蛋白和Rhod PE图像。
3. 以.tiff格式保存每个 z 堆栈图像序列。
4. 在图像处理软件（ImageJ/Fiji）中打开感兴趣的图像序列。识别具有最高强度的图像。按住"ctrl + shift + c"以打开"亮度和对比度"窗口，然后单击" 重置"。
5. 从 ImageJ/Fiji 菜单中，转到 分析>设置比例 ，然后输入每个图像像素的已知物理距离及其单位。
6. 从 ImageJ/Fiji 菜单中，转到 Image > Stacks > 3D 项目 ，以从 z 堆栈重建 3D 图像。将"投影方法"设置为 亮度点，将"切片间距（μm）"设置为 0.5，并选中 插值。默认选项可用于其余设置。
   注意:某些显微镜中的z区间可能没有校准，z方向的实际运动可能与输入的z区间略有不同（即0.5μm）。在这种情况下，可以使用3D校准样品（例如具有已知直径的荧光微球）来获得实际的z区间。因此，此值将用作 3D 投影的"切片间距 （μm）"。

结果

为了证明使用当前方案成功生成细胞骨架GUV，重建了GUV中的fascin-actin束结构。Fascin是肌动蛋白丝的短交联剂，其形成坚硬的平行排列的肌动蛋白束，并从 大肠杆菌 中纯化为谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白²⁶。首先重构5 μM肌动蛋白，包括肌动蛋白聚合缓冲液中的0.53 μM ATTO488肌动蛋白和7.5%的密度梯度培养基。在以2.5μM的浓度加入筋膜并包封法氏菌素 - 肌动蛋白混合物时?...

讨论

已经探索了产生GUV的不同方法来创建合成细胞然而，程序的复杂性，获得封装的时间延长，密封剂的脂质类型和分子组成的限制，需要非生理化学物质来促进封装，低GUV产率以及封装效率的不一致一直困扰着该领域的研究人员。考虑到可以在自下而上的合成生物学中开展的广泛潜在研究，一种无缝的高通量GUV封装方法，与不同的脂质组成兼容，并且可以封装任何分子，无论大小如何，都可能激发?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667