Encapsulation rapide du cytosquelette reconstitué à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

Résumé

Cet article présente une méthode simple pour la production rapide de vésicules unilamellaires géantes avec des protéines cytosquelettiques encapsulées. La méthode s’avère utile pour la reconstitution ascendante des structures cytosquelettiques dans le confinement et les interactions cytosquelette-membrane.

Résumé

Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont fréquemment utilisées comme modèles de membranes biologiques et constituent donc un excellent outil pour étudier les processus cellulaires liés à la membrane in vitro. Ces dernières années, l’encapsulation dans les GUV s’est avérée être une approche utile pour les expériences de reconstitution en biologie cellulaire et dans des domaines connexes. Il imite mieux les conditions de confinement à l’intérieur des cellules vivantes, par opposition à la reconstitution biochimique conventionnelle. Les méthodes d’encapsulation à l’intérieur des GUV ne sont souvent pas faciles à mettre en œuvre, et les taux de réussite peuvent différer considérablement d’un laboratoire à l’autre. Une technique qui s’est avérée efficace pour encapsuler des systèmes protéiques plus complexes est appelée encapsulation croisée d’interface gouttelette continue (cDICE). Ici, une méthode basée sur cDICE est présentée pour encapsuler rapidement des protéines cytosquelettiques dans des GUV avec une efficacité d’encapsulation élevée. Dans cette méthode, tout d’abord, les gouttelettes lipido-monocouches sont générées en émulsionnant une solution protéique d’intérêt dans un mélange lipide/huile. Après avoir été ajoutées dans une chambre rotative imprimée en 3D, ces gouttelettes monocouches lipidiques passent ensuite à travers une deuxième monocouche lipidique à une interface eau/huile à l’intérieur de la chambre pour former des GUV qui contiennent le système protéique. Cette méthode simplifie la procédure globale d’encapsulation dans les GUV et accélère le processus, et nous permet ainsi de confiner et d’observer l’évolution dynamique de l’assemblage du réseau à l’intérieur des vésicules bicouches lipidiques. Cette plate-forme est pratique pour étudier la mécanique des interactions cytosquelette-membrane en confinement.

Introduction

Les compartiments bicouches lipidiques sont utilisés comme modèles de cellules synthétiques pour l’étude des réactions organiques fermées et des processus membranaires ou comme modules porteurs dans les applications d’administration^de médicaments ^1,2. La biologie ascendante avec des composants purifiés nécessite un minimum de systèmes expérimentaux pour explorer les propriétés et les interactions entre les biomolécules, telles que les protéines et les lipides ^3,4. Cependant, avec les progrès du domaine, il y a un besoin accru de systèmes expérimentaux plus complexes qui imitent mieux les conditions dans les cellules biologiques. L’encapsulation dans les GUV est une approche pratique qui peut offrir certaines de ces propriétés cellulaires en fournissant une bicouche lipidique déformable et sélectivement perméable et un espace de réaction confiné. En particulier, la reconstitution in vitro de systèmes cytosquelettiques, en tant que modèles de cellules synthétiques, peut bénéficier de l’encapsulation dans les compartiments membranaires⁵. De nombreuses protéines du cytosquelette se lient et interagissent avec la membrane cellulaire. Comme la plupart des assemblages cytosquelettiques forment des structures qui couvrent l’ensemble de la cellule, leur forme est naturellement déterminée par le confinement de la taille^{d’une cellule 6}.

Différentes méthodes sont utilisées pour générer des GUV, telles que le gonflement ^7,8, la fusion de petites vésicules ^9,10, le transfert d’émulsion ^11,12, le jet pulsé¹³ et d’autres approches microfluidiques^14,15. Bien que ces méthodes soient encore utilisées, chacune a ses limites. Ainsi, une approche robuste et simple avec un rendement élevé d’encapsulation GUV est hautement souhaitable. Bien que des techniques telles que le gonflement spontané et l’électrosuit soient largement adoptées pour la formation de GUV, ces méthodes sont principalement compatibles avec des compositions lipidiques spécifiques¹⁶, des tampons à faible concentration de sel¹⁷, une taille moléculaire encapsulante^{plus petite 18} et nécessitent un volume élevé d’encapsulant. La fusion de plusieurs petites vésicules dans un GUV est intrinsèquement énergétiquement défavorable, nécessitant ainsi une spécificité dans les compositions lipidiques chargées⁹ et / ou les agents externes induisant la fusion, tels que les peptides¹⁹ ou d’autres produits chimiques. Le transfert d’émulsion et les méthodes microfluidiques, d’autre part, peuvent nécessiter une stabilisation des gouttelettes par l’élimination des tensioactifs et des solvants après la formation de bicouches, respectivement^18,20. La complexité de la configuration expérimentale et du dispositif dans les techniques microfluidiques telles que le jet pulsé impose un défi supplémentaire²¹. cDICE est une méthode basée sur l’émulsion dérivée de principes similaires régissant le transfert d’émulsion^22,23. Une solution aqueuse (solution externe) et un mélange lipid-huile sont stratifiés par forces centrifuges dans une chambre cylindrique rotative (chambre cDICE) formant une interface saturée de lipides. La navette de gouttelettes aqueuses monocouches lipidiques dans la chambre cDICE rotative entraîne la fermeture éclair d’une bicouche lorsque les gouttelettes traversent l’interface saturée de lipides dans la solution aqueuse externe^22,24. L’approche cDICE est une technique robuste pour l’encapsulation GUV. Avec la méthode modifiée présentée, non seulement le rendement élevé des vésicules typique de la cDICE avec un temps d’encapsulation significativement plus court (quelques secondes) est atteint, mais le temps de génération de GUV qui permet l’observation des processus dépendant du temps (par exemple, la formation d’un réseau cytosquelettique d’actine) est considérablement réduit. Le protocole prend environ 15-20 minutes du début à la collecte et à l’imagerie GUV. Ici, la génération de GUV est décrite à l’aide de la méthode cDICE modifiée pour encapsuler l’actine et les protéines de liaison à l’actine (ABP). Cependant, la technique présentée est applicable pour encapsuler un large éventail de réactions biologiques et d’interactions membranaires, de l’assemblage de biopolymères à l’expression de protéines sans cellules en passant par le transfert de cargaison basé sur la fusion membranaire.

Protocole

1. Préparation du mélange huile-lipides

REMARQUE: L’étape doit être effectuée dans une hotte en suivant toutes les directives de sécurité pour la manipulation du chloroforme.

1. Prendre 0,5 mL de chloroforme dans un flacon en verre de 15 mL. Ajouter 88 μL de 25 mg/mL de dioléoyl-phosphocholine (DOPC), 9,3 μL de 50 mg/mL de cholestérol et 5 μL de 1 mg/mL de dioléoyl-phosphoéthanolamine-lissamine B (rhodamine PE) (voir tableau des matériaux) dans le flacon en verre de 15 ml.
   REMARQUE: Les fractions molaires finales de DOPC et de cholestérol dans l’huile de silicone / huile minérale sont de 69,9% et 30%, respectivement. Il a été établi que le cholestérol 20-30 mol% est une concentration optimisée pour la fluidité membranaire et la stabilité des GUV générés en utilisant la technique présentée^25,26. Physiologiquement, ces valeurs se situent bien dans la plage de concentration de cholestérol trouvée dans les membranes plasmiques des cellules de mammifères⁶. Les stocks lipidiques sont acquis sous forme de solutions dans le chloroforme et stockés à -20 °C. Les flacons lipidiques doivent être acclimatés à la température ambiante avant d’être ouverts.
2. Pipette 7,2 mL d’huile de silicone et 1,8 mL d’huile minérale dans un deuxième flacon de 15 mL (voir Tableau des matériaux). Généralement, cela doit être fait dans une boîte à gants à faible humidité, principalement si l’huile minérale est réutilisée.
3. Mélanger les huiles en vortexant à la vitesse de rotation maximale (3200 tr/min) pendant 10 s, ajouter le mélange au flacon contenant le mélange lipidique dans le chloroforme et le placer immédiatement sur le mélangeur vortex. Vortex pendant 10-15 s à la vitesse de rotation maximale (3200 tr/min). Le mélange lipides-dans-huile qui en résulte doit être légèrement trouble, car les lipides ne sont pas complètement dissous dans l’huile mais plutôt dispersés sous forme de petits agrégats²⁴.
4. Mettre la dispersion lipidique dans l’huile dans un sonicateur de bain (voir Tableau des matériaux) d’une puissance ultrasonique de 80 W et d’une fréquence de fonctionnement de 40 kHz à température ambiante pendant 30 min. Utiliser le mélange immédiatement ou conserver à 4 °C pendant une durée maximale de 24 h.

2. Génération de vésicules

1. Montez l’arbre imprimé en 3D (fichier supplémentaire 1) en résine noire (voir Tableau des matériaux) sur la plaque d’agitation de la paillasse et réglez la vitesse de rotation à 1200 tr / min.
2. Montez la chambre cDICE imprimée en 3D (dossier supplémentaire 2) en résine transparente (voir tableau des matériaux) sur l’arbre (figure 1A, B).
3. Préparer séparément les solutions d’actine et de protéines de liaison à l’actine (ABP) dans un volume total de 20 μL.
   1. Préparer 1 à 10 μM d’actine dans un tampon globulaire d’actine (tampon G), y compris 10 % d’actine ATTO 488 (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE: 1x G-buffer comprend 5 mM de Tris-HCl, pH 8,0 et 0,2 mM de CaCl₂.
   2. Ajouter un tampon de polymérisation de l’actine filamenteuse (tampon F) pour commencer la polymérisation de l’actine sur la glace. Gardez les solutions sur la glace pour ralentir la polymérisation de l’actine avant l’ajout d’un réticulant.
      REMARQUE: Le tampon F 1x contient 50 mM de KCl, 2 mM de MgCl₂ et 3 mM d’ATP dans 10 mM de Tris, pH 7,5.
   3. Attendre 15 min pour permettre l’initiation de la polymérisation de l’actine sur la glace avant d’ajouter des réticulants d’intérêt au rapport molaire souhaité. Conserver la solution sur la glace jusqu’à l’encapsulation.
   4. Préparer les protéines de liaison à l’actine (ABP) séparément dans un microtube (Figure 1C).
      REMARQUE: Cette étape est effectuée lorsqu’une combinaison d’ABP (par exemple, myosine, α-actinine, fascine, complexe Arp2/3) s’encapsule avec de l’actine 25,26,27. Dans de tels cas, la quantité souhaitée de chaque PBA est prélevée sur son stock et ajoutée dans le microtube désigné pour les PBA. Comme la solution totale doit être de 20 μL, des aliquotes mères d’ABP doivent être préparées de manière à ce que la quantité souhaitée du mélange total de PBA ne dépasse pas 5-6 μL. Le seul ABP utilisé dans les résultats représentatifs ici est la fascine, dont la préparation est mentionnée ci-dessous.
      1. Aliquote 1,57 μL de fascine à partir d’un stock de 1,75 mg/mL de fascine (voir tableau des matériaux) et ajouter directement à la solution d’actine à l’étape 2.7. Cela correspond à 2,5 μM de fascine dans la solution.
4. Ajouter 7,5 % du milieu de gradient de densité (voir Tableau des matériaux) dans la solution d’actine pour créer un gradient de densité entre la phase aqueuse externe et interne afin de faciliter la sédimentation du GUV.
5. Distribuer 700 μL de la solution externe de 200 mM de glucose dans la chambre (Figure 1D, à gauche).
   REMARQUE: L’osmolarité de la solution interne détermine la concentration de glucose. Pour ces expériences, l’osmolarité de la solution interne est d’environ 200 mOsm, de sorte qu’une solution de glucose de 200 mM est utilisée comme solution externe.
6. Ajouter une quantité suffisante de mélange lipid-huile (>3 mL en fonction de la taille de la chambre) dans la chambre jusqu’à ce que 60 % à 80 % de la chambre soit remplie (Figure 1D, à droite). Une interface se formera entre le mélange lipid-huile et la solution externe.
7. Transférer les ABP (préparés à l’étape 2.3.4) dans la solution d’actine. À l’aide d’une pipette ordinaire de 100 à 1000 μL, transférer immédiatement les 700 μL du mélange lipidique-huile dans le mélange actine-ABP (figure 1E, à gauche). Pipettez de haut en bas 8 fois pour générer des gouttelettes monocouches lipidiques de la taille d’une cellule d’un diamètre compris entre 7 et 100 μm (Figure 1E, milieu).
   REMARQUE: L’étape 2.7 doit être terminée en quelques secondes pour éviter tout assemblage de réseau actin avant l’encapsulation. Ainsi, avant d’effectuer l’étape, assurez-vous que les embouts de pipette sont déjà insérés dans les pipettes et prêts à transférer les mélanges.
8. À l’aide de la même pipette de 100 à 1000 μL, distribuer immédiatement l’émulsion entière dans la chambre rotative. Les gouttelettes acquerront une deuxième feuillet de lipides en croisant la monocouche lipidique à l’interface huile-solution externe, formant ainsi des GUV (Figure 1E, à droite).
9. Retirez la chambre de la plaque à remuer et jetez la majeure partie du mélange lipid-huile en inclinant la chambre dans le récipient à déchets de sorte qu’une grande partie du mélange lipide-huile soit drainée de la grande ouverture au centre de la chambre.
   REMARQUE: De cette façon, le mélange lipid-huile est extrait de la chambre, en évitant le mélange du mélange lipid-huile avec la solution externe à l’étape suivante.
10. Tenez la chambre avec son couvercle tourné vers l’utilisateur. Ouvrez le couvercle de la chambre et inclinez légèrement la chambre vers l’utilisateur. L’interface entre la solution extérieure contenant des GUV et le mélange lipid-huile est visible depuis l’ouverture de la chambre (où se trouve le couvercle).
11. À l’aide d’une pipette, recueillir suffisamment de solution extérieure contenant des GUV et distribuer 50 à 300 μL de la solution externe dans une plaque de 96 puits pour obtenir une densité appropriée de GUV.
    REMARQUE: En suivant ce protocole, un total d’environ 2 x 10⁵ GUV sont libérés dans la solution externe à l’intérieur de la chambre. La dispersion du GUV n’a pas été quantifiée; cependant, le diamètre d’environ 90% des GUV est de l’ordre de 12-30 μm. Des GUV avec n’importe quel diamètre dans la gamme de 7-50 μm peuvent être trouvés dans la population. Selon le milieu de gradient de densité encapsulé, la taille du GUV et la profondeur de la solution dans la plaque de puits, il faut 2 à 15 minutes pour que les GUV se déposent à la surface. Le rendement des GUV avec des faisceaux d’actine reconstitués est d’environ 90%.

3. Imagerie et reconstruction d’images 3D

1. Installez la plaque de 96 puits sur la scène d’un microscope inversé équipé d’une unité confocale à disque rotatif (ou balayage laser), d’une caméra EMCCD ou sCMOS et d’un objectif 60x à immersion dans l’huile (voir tableau des matériaux).
2. Concentrez-vous sur n’importe quelle région d’intérêt (ROI) et prenez une séquence d’images z-stack à partir du ROI avec un intervalle z-step de 0,5 μm.
   REMARQUE: Étant donné que les GUV peuvent être légèrement déplacés sur la surface au fil du temps, il est recommandé de capturer un ensemble d’images multi-longueurs d’onde à chaque plan z si plusieurs fluorophores sont photographiés, c’est-à-dire prendre un groupe d’images de 561 nm et 488 nm à chaque voie z à la fois pour capturer des images ATTO 488 actine et Rhod PE.
3. Enregistrez chaque séquence d’images z-stack au format .tiff.
4. Ouvrez une séquence d’images d’intérêt dans un logiciel de traitement d’images (ImageJ/Fiji). Identifiez l’image avec la plus haute intensité. Maintenez « ctrl + maj + c » pour ouvrir la fenêtre Luminosité et contraste et cliquez sur Réinitialiser.
5. Dans le menu ImageJ/Fidji, accédez à Analyser > Définir l’échelle et entrez la distance physique connue et son unité pour chaque pixel d’image.
6. Dans le menu ImageJ/Fidji, accédez à Image > Stacks > projet 3D pour reconstruire une image 3D à partir de la pile z. Définissez « Méthode de projection » sur Point de luminosité, « Espacement des tranches (μm) » sur 0,5 et cochez Interpoler. Les options par défaut peuvent être utilisées pour le reste des paramètres.
   REMARQUE: les intervalles z dans certains microscopes peuvent ne pas être étalonnés et le mouvement réel dans la direction z peut différer légèrement de l’intervalle z entré (c.-à-d. 0,5 μm). Dans de tels cas, un spécimen d’étalonnage 3D tel que des microsphères fluorescentes d’un diamètre connu peut être utilisé pour obtenir l’intervalle z réel. Cette valeur sera donc utilisée comme « Espacement des tranches (μm) » pour la projection 3D.

Résultats

Pour démontrer la génération réussie de GUV cytosquelettiques à l’aide du protocole actuel, des structures de faisceau fascine-actine dans les GUV ont été reconstituées. La fascine est un réticulant court de filaments d’actine qui forme des faisceaux d’actine rigides alignés en parallèle et est purifié à partir d’E. coli sous forme de protéine de fusion glutathion-S-transférase (GST)²⁶. 5 μM d’actine ont d’abord été reconstitués, dont 0,53 μM d’actine ATT...

Discussion

Différentes méthodes de génération de GUV ont été explorées pour la création de cellules synthétiques Cependant, la complexité des procédures, le temps prolongé pour atteindre l’encapsulation, la restriction des types de lipides et de la composition moléculaire de l’encapsulant, le besoin de produits chimiques non physiologiques pour faciliter l’encapsulation, le faible rendement en GUV et les incohérences dans l’efficacité de l’encapsulation ont continué à défier les chercheurs dans ce domain...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667