الإنتاج الآلي على نطاق واسع من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون كروية للطباعة الحيوية 3D

Summary

هنا ، نصف الإنتاج على نطاق واسع من الكرويات اللحمية / الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASC) باستخدام نظام سحب آلي لزرع تعليق الخلية ، وبالتالي ضمان تجانس حجم وشكل الكروية. يمكن استخدام هذه الكروية ASC ككتل بناء لنهج الطباعة الحيوية 3D.

Abstract

الخلايا اللحمية / الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا الموجودة في الجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البشرية تحت الجلد المعترف بها كمصدر كلاسيكي للخلايا اللحمية / الجذعية الوسيطة. تم نشر العديد من الدراسات مع ASCs لنهج هندسة الأنسجة القائمة على السقالات ، والتي استكشفت بشكل رئيسي سلوك هذه الخلايا بعد بذرها على السقالات النشطة بيولوجيا. ومع ذلك ، تظهر مناهج خالية من السقالات لهندسة الأنسجة في المختبر وفي الجسم الحي ، وذلك أساسا باستخدام الكرويات ، للتغلب على قيود النهج القائمة على السقالات.

الكروية هي الأنسجة الدقيقة 3D التي شكلتها عملية التجميع الذاتي. يمكنهم محاكاة البنية والبيئة الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل أفضل ، ويرجع ذلك أساسا إلى تكبير تفاعلات المصفوفة من خلية إلى خلية ومن خلية إلى خارج الخلية. في الآونة الأخيرة ، يتم استكشاف الكرويات بشكل رئيسي كنماذج للأمراض ، ودراسات فحص الأدوية ، ولبنات البناء للطباعة الحيوية 3D. ومع ذلك ، بالنسبة لنهج الطباعة الحيوية 3D ، فإن العديد من الكرويات ، المتجانسة في الحجم والشكل ، ضرورية للتصنيع الحيوي لنماذج الأنسجة والأعضاء المعقدة. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم إنتاج الكرويات تلقائيا ، هناك فرصة ضئيلة للتلوث الميكروبيولوجي ، مما يزيد من قابلية تكرار الطريقة.

يعتبر الإنتاج الواسع النطاق للكرويات الخطوة الإلزامية الأولى لتطوير خط التصنيع الحيوي ، والذي يستمر في عملية الطباعة الحيوية 3D وينتهي في النضج الكامل لبناء الأنسجة في المفاعلات الحيوية. ومع ذلك ، فإن عدد الدراسات التي استكشفت إنتاج ASC الكروي على نطاق واسع لا يزال نادرا ، إلى جانب عدد الدراسات التي استخدمت كرويات ASC ككتل بناء للطباعة الحيوية 3D. لذلك ، تهدف هذه المقالة إلى إظهار الإنتاج الواسع النطاق للكرويات ASC باستخدام تقنية هيدروجيل غير لاصقة micromolded تنشر كرويات ASC ككتل بناء لأساليب الطباعة الحيوية 3D.

Introduction

تعتبر الكرويات نهجا خاليا من السقالات في هندسة الأنسجة. ASCs قادرة على تشكيل كرويات من خلال عملية التجميع الذاتي. تزيد البنية الدقيقة ثلاثية الأبعاد للكروية من الإمكانات التجديدية ل ASCs ، بما في ذلك قدرة التمايز إلى سلالات متعددة¹،^2،3. تعمل هذه المجموعة البحثية مع كرويات ASC لهندسة الغضاريف والأنسجة العظمية⁴،^5،6. الأهم من ذلك ، تعتبر الكرويات لبنات بناء في التصنيع الحيوي للأنسجة والأعضاء ، ويرجع ذلك أساسا إلى قدرتها على الاندماج.

يعتمد استخدام الكرويات لتشكيل الأنسجة على ثلاث نقاط رئيسية: (1) تطوير طرق روبوتية موحدة وقابلة للتطوير لتصنيعها الحيوي⁷ ، (2) التنميط الظاهري المنهجي للكرويات النسيجية⁸ ، (3) تطوير طرق لتجميع الأنسجة ثلاثية الأبعاد⁹. يمكن تشكيل هذه الكرويات بأنواع مختلفة من الخلايا والحصول عليها من خلال طرق مختلفة ، بما في ذلك السقوط المعلق ، وإعادة التجميع ، والموائع الدقيقة ، والقوالب الدقيقة^8،9،10. كل من هذه الطرق لها مزايا وعيوب تتعلق بتجانس حجم وشكل الكرويات ، واستعادة الكرويات بعد التكوين ، وعدد الكرويات المنتجة ، وأتمتة العمليات ، وكثافة العمالة ، والتكاليف¹¹.

في طريقة micromold ، يتم توزيع الخلايا وإيداعها في الجزء السفلي من micromold بسبب الجاذبية. لا يسمح الهيدروجيل غير اللاصق للخلايا بالالتصاق بالقاع ، وتؤدي التفاعلات بين الخلايا إلى تكوين كروي واحد لكل ركود ^8,12. تولد طريقة التصنيع الحيوي هذه كرويات ذات حجم متجانس ومضبوط ، ويمكن استخدامها آليا للإنتاج على نطاق واسع بطريقة فعالة من حيث الوقت بأقل جهد ممكن ، ولها عوامل جيدة من حيث الفعالية من حيث التكلفة في تصميم التصنيع الحيوي للأنسجة الكروية ^7,8. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتشكيل كرويات من أي سلالة خلوية لإعداد نوع جديد من الأنسجة بخصائص يمكن التنبؤ بها ومثالية ويمكن التحكم فيها⁸.

يعرف التصنيع الحيوي بأنه "التوليد الآلي للمنتجات الوظيفية بيولوجيا مع التنظيم الهيكلي ..."¹³. لذلك ، يعتبر الإنتاج الآلي للكرويات الخطوة الإلزامية الأولى لتطوير خط التصنيع الحيوي ، والذي يستمر في عملية الطباعة الحيوية 3D وينتهي في النضج الكامل للأنسجة المطبوعة بيولوجيا عن طريق الانصهار الكروي. في هذه الدراسة ، لتحسين قابلية التوسع في التصنيع الحيوي الكروي ASC ، نستخدم نظام سحب آلي لزرع تعليق الخلية ، وبالتالي ضمان تجانس حجم وشكل كروي. تظهر هذه الورقة أنه كان من الممكن إنتاج عدد كبير (الآلاف) من الكرويات اللازمة لنهج الطباعة الحيوية 3D للتصنيع الحيوي لنماذج الأنسجة الأكثر تعقيدا.

Protocol

تم عزل ASCs المستخدمة في هذه الدراسة سابقا عن المتبرعين البشريين الأصحاء وحفظها بالتجميد كما هو موضح في¹⁴ وفقا للجنة أخلاقيات البحث في مستشفى جامعة كليمنتينو فراغا فيلهو ، الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو ، البرازيل (25818719.4.0000.5257). انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة.

1. التربسين من ASC أحادي الطبقة في الممر الثالث

1. افتح مزرعة الأنسجة 175 سم² قارورة تحتوي على الطبقة الأحادية من ASCs عند التقاء 80٪ وتخلص من supernatant.
2. أضف 7 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS ، 0.01 M) واغسل الطبقة الأحادية مرتين. بعد ذلك ، تخلص من السائل.
3. أضف 5 مل من 0.125٪ تريبسين مع 0.78 ملليمتر من حمض الإيثيلين ديامين تتراسيتيك (EDTA). بعد ذلك ، احتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
4. أضف 10 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) منخفض الجلوكوز مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS ) إلى مزرعة الأنسجة 175 سم² قارورة واخلط تعليق الخلية جيدا مع ماصة 10 مل سورولوجية.
5. حصاد تعليق الخلية مع ماصة مصلية 10 مل ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 50 مل. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه ASCs. أعد تعليق حبيبات الخلايا باستخدام DMEM LOW الذي يحتوي على 10٪ FBS.
6. قم بإجراء عدد الخلايا عن طريق استبعاد التربان.
7. بعد العد ، خذ ما مجموعه 1 × 10⁶ ASCs في أنبوب طرد مركزي منفصل 15 مل لزرع 81 حالة ركود مصقولبة بالهيدروجيل غير الملتصق (ما مجموعه 10000 خلية / مل مبذرة هنا). لزرع 256 حالة ركود من الهيدروجيل غير الملتصق بالميكرومصبوب ، خذ ما مجموعه 5 × 10⁵ ASCs في أنبوب طرد مركزي (ما مجموعه 2500 خلية / مل مبذرة هنا).

2. ميكرومصبوب غير ملتصقة تصنيع هيدروجيل الأغاروز

1. تحضير 50 مل من محلول معقم من 2٪ من الأغاروز فائق النقاء في 0.9٪ كلوريد الصوديوم في الماء فائق النقاء. أوتوكلاف الحل لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
2. أضف 500 ميكرولتر من محلول الأغاروز المعقم 2٪ فائق النقاء في وسط قالب سيليكون يحتوي على 81 أو 256 استراحة دائرية.
3. بعد 40 دقيقة ، قم بفك قالب الأغاروز فائق النقاء من قالب السيليكون وضعه في بئر من لوحة بلاستيكية من 12 بئرا.
4. أضف 2 مل من DMEM LOW في البئر مع الأغاروز المصبوب الدقيق واحتضنه في حاضنة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO₂ لمدة 12 ساعة على الأقل قبل بذر ASCs.

3. التصنيع الحيوي للكرويات ASC باستخدام نظام السحب الآلي

1. تحقق مما يلي:
   1. تحقق مما إذا كان التدفق الرقائقي قيد التشغيل ، وأن تدفق الهواء في الخزانة يعمل بشكل صحيح.
   2. تحقق مما إذا كان الجهاز متصلا بالجهد الصحيح.
   3. تحقق مما إذا كان الجهاز اللوحي متصلا بالجهاز.
   4. تحقق مما إذا كان ارتفاع زجاج حماية الخزانة في نفس ارتفاع علامة المستشعر الخاصة بالمعدات.
2. اضغط على الزر تشغيل /إيقاف تشغيل على الجانب الأيسر من الجهاز وانتظر حتى يبدأ تشغيل الجهاز اللوحي والجهاز.
3. ضع صناديق الأطراف ، ورف أنابيب الطرد المركزي ، واللوحة التي تحتوي على هيدروجيل الأغاروز المصبوب في مساحة عمل المعدات.
4. في الجهاز اللوحي مع فتح البرنامج ، انقر أولا على محرر Labware.
5. قم بإعداد طاولة عمل افتراضية واختر مواضع الماصات وصناديق الأطراف والحامل للأنابيب البلاستيكية والألواح.
   ملاحظة: يجب أن يمثل جدول العمل الظاهري المواضع الفعلية للملحقات في المعدات.
6. انقر فوق الزر التبديل إلى الإنتاج لتضمين المعلمات (انظر الخطوة 3.10) والأوامر التي ستنفذها المعدات طوال التجربة. انتظر حتى يتم فتح شريط أدوات وقائمة إنتاج في البرنامج.
7. في البداية، للإشارة إلى الأوامر، قم بتضمين عدد العينات المراد ماصتها واسحبها إلى قائمة الإنتاج.
   ملاحظة: عدد العينات هو عدد أنابيب أجهزة الطرد المركزي البلاستيكية التي تحتوي على تعليق ASC ليتم بذرها في وسط القوالب الدقيقة.
8. بعد إدخال عدد العينات ، انقر فوق الزر " نقل العينات " الموجود على البرنامج لنقل تعليق ASC إلى آبار لوحة البئر 12 ، التي تحتوي على القوالب الدقيقة ، واسحبها إلى قائمة الإنتاج.
9. انقر فوق خصائص لإعداد مواضع البداية والنهاية للمعدات لنقل العينة.
10. انتظر حتى يعود البرنامج إلى صفحة جدول العمل. انقر فوق الزر "خيارات" لإعداد المعلمات للبذر الآلي ل ASCs: i) سرعة الطموح 15.4 ^s-1 ؛ ب) سرعة الاستغناء عن 1 ^s-1 ؛ ج) ضربة تأخير من 0 مللي ثانية؛ iv) سرعة النفخ 15.4 ^s-1 ؛ v) السكتة الدماغية الأولية من 100 ٪. حدد الماء كنوع السائل القياسي.
11. إعداد المعلمات لخلط ASCs للحصول على تعليق متجانس: i) عدد الدورات من 5 ؛ ب) سرعة 6.5 ^s-1 ؛ ج) حجم 300 ميكرولتر.
12. بعد إعداد المعلمات، أضف الوقت البالغ 40 دقيقة إلى قائمة الإنتاج.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى هذه المرة لانتظار تعليق ASC لصب في الجزء السفلي من micromold.
13. في قائمة الإنتاج، قم بتضمين خيار نقل الكاشف لنقل وسط الثقافة الكروية إلى الآبار المقابلة للوحة.
14. كرر الخطوات من 3.9 إلى 3.11 لإعداد تكوينات الموضع والمعلمة لنقل وسيط الثقافة الكروية.
15. انقر فوق الزر الذي يحتوي على رمز الاختيار في الشريط العلوي من البرنامج لضمان عدم وجود خطأ في البرمجة.
16. انقر فوق الزر "تشغيل" (مع رمز مثلث) في الشريط العلوي من البرنامج لبدء تشغيل البرنامج.
17. دع المعدات تبدأ ، كما هو مبرمج ، وانتظر حتى تصدر صوتا ، مما يشير إلى أنها قد انتهت.
18. اجمع الصفيحة المكونة من 12 بئرا واحتضنها في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO₂ لمدة 18 ساعة على الأقل حتى يتم تشكيل الكرويات بالكامل وضغطها.
19. حصاد الكرويات يدويا بعد 1 و 3 و 7 أيام من الثقافة للتحليل. اغسل الوسط يدويا باستخدام ماصة دقيقة لتحرير الكرويات من هيدروجيل الأغاروز غير الملتصق بالقوالب الدقيقة.
20. بعد 5 دقائق ، تحقق تحت المجهر لتحديد ما إذا كانت الكرويات قد تم إطلاقها بالكامل من هيدروجيل الأغاروز غير الملتصق بالقوالب الدقيقة.
21. جمع الكرويات يدويا باستخدام ماصة دقيقة ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل.
22. اغسل الكرويات مرتين على الأقل باستخدام 0.01 M PBS. تقييم الجدوى وإجراء التحليلات الميكانيكية الحيوية على العينات الكروية الطازجة. لتحليل المورفولوجيا (علم الأنسجة) ، احتضن العينات الكروية في 4٪ paraformaldehyde في PBS لمدة 18 ساعة على الأقل عند 2-8 درجة مئوية.

النتائج

يمكن لنظام الماصة الأوتوماتيكي زرع تعليق خلية ASC في 12 بئرا من لوحة واحدة من 12 بئرا في 15 دقيقة. باستخدام 81 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، سينتج 972 كرويا في نهاية البروتوكول. باستخدام 256 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، سينتج 3072 كرويا في نهاية البروتوكول. تم تحليل الكرويات ASC للتأك?...

Discussion

تعرض هذه الورقة الجيل الواسع النطاق من الكرويات ASC باستخدام نظام ماصة آلي. الخطوة الحاسمة للبروتوكول هي إعداد البرنامج بدقة لضمان الحجم الصحيح لتعليق الخلايا وسرعتها ومسافة السحب عليها. تم تحديد المعلمات الموصوفة في البروتوكول بعد عدد من التجارب لتحسين توزيع تعليق خلية ASC في آبار ألواح 12 ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100