Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

Resumo

Aqui, descrevemos a produção em larga escala de esferoides esferoides de células-tronco derivados de adiposos (ASC) usando um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Estes esferoides ASC podem ser usados como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.

Resumo

Células-tronco/estromenas derivadas de adiposos (ASCs) são uma subpopulação de células encontradas na fração vascular estromada do tecido adiposo subcutâneo humano reconhecido como uma fonte clássica de células mesenquimais estromicas/tronco. Muitos estudos foram publicados com ASCs para abordagens de engenharia de tecidos baseadas em andaimes, que exploraram principalmente o comportamento dessas células após sua semeadura em andaimes bioativos. No entanto, abordagens livres de andaimes estão surgindo para projetar tecidos in vitro e in vivo, principalmente usando esferoides, para superar as limitações das abordagens baseadas em andaimes.

Os spheróides são microtissues 3D formados pelo processo de auto-montagem. Eles podem imitar melhor a arquitetura e o microambiente dos tecidos nativos, principalmente devido à ampliação das interações de matriz celular-célula e célula-extracelular. Recentemente, os esferoides estão sendo explorados principalmente como modelos de doenças, estudos de rastreamento de medicamentos e blocos de construção para bioimpressão 3D. No entanto, para abordagens de bioimpressão 3D, numerosos esferoides, homogêneos em tamanho e forma, são necessários para biofabricar tecidos complexos e modelos de órgãos. Além disso, quando os esferoides são produzidos automaticamente, há pouca chance de contaminação microbiológica, aumentando a reprodutibilidade do método.

A produção em larga escala de esferoides é considerada o primeiro passo obrigatório para o desenvolvimento de uma linha de biofabricação, que continua no processo de bioimpressão 3D e termina na maturação total do tecido construído em bioreatores. No entanto, o número de estudos que exploraram a produção de spheroid ASC em larga escala ainda são escassos, juntamente com o número de estudos que usaram esferoides ASC como blocos de construção para bioimpressão 3D. Portanto, este artigo tem como objetivo mostrar a produção em larga escala de esferoides ASC usando uma técnica de hidrogel micromoldado não adesivo que espalha os esferoides ASC como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.

Introdução

Os spheróides são considerados uma abordagem livre de andaimes na engenharia de tecidos. AsCs são capazes de formar esferoides pelo processo de auto-montagem. A microarquitetura 3D do spheroid aumenta o potencial regenerativo das ASCs, incluindo a capacidade de diferenciação em várias linhagens ^1,2,3. Este grupo de pesquisa tem trabalhado com esferoides ASC para engenharia de cartilagem e tecido ^{ósseo 4,5,6}. Mais importante, os esferoides são considerados blocos de construção na biofabricação de tecidos e órgãos, principalmente devido à sua capacidade de fusão.

O uso de esferoides para formação de tecidos depende de três pontos principais: (1) o desenvolvimento de métodos robóticos padronizados e escaláveis para sua biofabricação⁷, (2) o fenotipagem sistemática dos esferoides teciduais⁸, (3) o desenvolvimento de métodos para a montagem de tecidos 3D⁹. Esses esferoides podem ser formados com diferentes tipos de células e obtidos através de vários métodos, incluindo queda de suspensão, reagregação, microfluidos e micromedes ^8,9,10. Cada um desses métodos possui vantagens e desvantagens relacionadas à homogeneidade de tamanho e forma dos esferoides, recuperação dos esferoides após a formação, número de esferoides produzidos, automação de processos, intensidade de mão-de-obra e custos¹¹.

No método micromold, as células são dispensadas e depositadas na parte inferior do micromold por causa da gravidade. O hidrogel não adesivo não permite que as células aderam ao fundo, e interações célula-célula levam à formação de uma única recessão por perifóide ^8,12. Este método de biofabricação gera esferoides de tamanho homogêneo e controlado, pode ser robotizado para produção em larga escala de forma eficiente com esforço mínimo, e tem bons fatores críticos de custo-efetividade no projeto de uma biofabricação de tecido spheroid ^7,8. Este método pode ser aplicado para formar esferoides de qualquer linhagem celular para preparar um novo tipo de tecido com características previsíveis, ótimas e controláveis⁸.

A biofabização é definida como "a geração automatizada de produtos biologicamente funcionais com organização estrutural..."¹³. Portanto, a produção automatizada de esferoides é considerada o primeiro passo obrigatório para o desenvolvimento de uma linha de biofabricação, que continua no processo de bioimpressão 3D e termina na maturação total do tecido bioimpresso pela fusão esferoide. Neste estudo, para melhorar a escalabilidade da biofabricação esferoide ASC, utilizamos um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Este artigo mostra que foi possível produzir um grande número (milhares) de esferoides necessários para abordagens de bioimpressão 3D para biofabricar modelos de tecidos mais complexos.

Protocolo

Os ASCs utilizados neste estudo foram previamente isolados de doadores humanos saudáveis e criopreservados conforme descrito¹⁴ segundo o Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro( 25818719.4.0000.5257). Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste estudo.

1. Trypsinização da monocamada ASC na passagem três

1. Abra a cultura tecidual 175 cm² frasco contendo a monocamadas de ASCs a 80% de confluência e descarte o supernatante.
2. Adicione 7 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS, 0,01 M) e lave a monocamada duas vezes. Em seguida, descarte o líquido.
3. Adicione 5 mL de 0,125% de trippsina com ácido 0,78 mM etilenodiaminetetraacético (EDTA). Em seguida, incubar por 5 min a 37 °C.
4. Adicione 10 mL de baixa glicose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) com 10% de soro bovino fetal (FBS) à cultura tecidual 175 cm² frasco e misture bem a suspensão celular com uma pipeta sorológica de 10 mL.
5. Colde a suspensão celular com uma pipeta sorológica de 10 mL e transfira-a para um tubo de centrífuga de 50 mL. Em seguida, centrífuga a 400 × g por 5 min para obter a pelota de ASCs. Resuspende a pelota de célula usando DMEM LOW contendo 10% de FBS.
6. Realize uma contagem de células por exclusão de tripano.
7. Após a contagem, pegue um total de 1 × 10⁶ ASCs em um tubo de centrífuga separado de 15 mL para semear as 81 recessões micromoed com hidrogel não aderente (um total de 10.000 células/mL semeadas aqui). Para semear 256 recessões de hidrogel micromoedido não aderente, leve um total de 5 × 10⁵ ASCs em um tubo de centrífuga (um total de 2.500 células/mL semeadas aqui).

2. Fabricação de hidrogel agarose não aderente micromoeda

1. Prepare 50 mL de uma solução estéril de 2% de agarose ultrapure em 0,9% NaCl em água ultrauso. Autoclave a solução por 30 min a 121 °C.
2. Adicione 500 μL de solução de agarose ultrapure de 2% estéril no centro de um molde de silicone contendo 81 ou 256 recessos circulares.
3. Depois de 40 min, desenforme a agarose ultrapure do molde de silicone e colocá-lo em um poço de uma placa de plástico de 12 poços.
4. Adicione 2 mL de DMEM LOW no poço com a ágarose micromoldada e incubar em uma incubadora a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5% por pelo menos 12 h antes de semear os ASCs.

3. Biofabricação de spheróides ASC usando o sistema automatizado de pipetização

1. Confira a seguir:
   1. Verifique se o fluxo laminar está ligado e o fluxo de ar do gabinete está funcionando corretamente.
   2. Verifique se o equipamento está conectado à tensão correta.
   3. Verifique se o tablet está conectado ao equipamento.
   4. Verifique se a altura do vidro de proteção do armário está na mesma altura que a marcação do sensor do equipamento.
2. Pressione o botão Ligar/Desligar no lado esquerdo do equipamento e aguarde o tablet e o equipamento para iniciar.
3. Posicione as caixas de ponta, o rack para tubos de centrífugas e a placa contendo o hidrogel de agarose micromoldado no espaço de trabalho do equipamento.
4. No tablet com o software aberto, primeiro clique no Labware Editor.
5. Configure uma mesa de trabalho virtual e escolha as posições das pipetas, caixas de ponta, o rack para os tubos de plástico e as placas.
   NOTA: A mesa de trabalho virtual deve representar as posições físicas dos acessórios no equipamento.
6. Clique no botão Switch to Produce para incluir os parâmetros (ver passo 3.10) e comandos que o equipamento realizará durante todo o experimento. Aguarde uma barra de ferramentas e uma Lista de Produtos para abrir no software.
7. Inicialmente, para indicar os comandos, inclua o número de amostras a serem pipetadas e arraste-as para a Lista de Produtos.
   NOTA: O número de amostras é o número de tubos de centrífugas plásticas contendo a suspensão ASC a ser semeada no centro dos micromedes.
8. Depois de inserir o número de amostras, clique no botão de comando Transferência de amostra no software para transferir a suspensão ASC para os poços da placa de 12 poços, contendo os micromedes, e arraste-a para a Lista de Produtos.
9. Clique em Propriedades para configurar as posições de início e extremidade para o equipamento transferir a amostra.
10. Aguarde que o software retorne à página Tabela de Trabalho . Clique no botão Opções para configurar os parâmetros para semeadura automatizada das ASCs: i) Velocidade de aspiração de 15,4 ^s-1; ii) Dispensar velocidade de 1 ^s-1; iii) Blow Delay de 0 ms; iv) Velocidade de estouro de 15,4 ^s-1; v) Curso inicial de 100%.. Selecione Água como o tipo líquido padrão.
11. Configurar os parâmetros para misturar as ASCs para obter uma suspensão homogênea: i) Número de Ciclos de 5; ii) Velocidade de 6,5 ^s-1; iii) Volume de 300 μL.
12. Após a configuração dos parâmetros, adicione o tempo de 40 minutos à Lista de Produtos.
    NOTA: Este tempo é necessário para esperar que a suspensão asc decante na parte inferior do micromold.
13. Na Lista de Produtos, inclua a opção Transferência de Reagente para transferir o meio de cultura esferoide para os poços correspondentes da placa.
14. Repita as etapas 3.9-3.11 para configurar as configurações de posição e parâmetro para transferir o meio de cultura esferoide.
15. Clique no botão com um símbolo de verificação na barra superior do software para garantir que não haja erro de programação.
16. Clique no botão Reproduzir (com um símbolo de triângulo) na barra superior do software para iniciar o programa.
17. Que o equipamento comece, como programado, e aguarde que ele faça um som, indicando que ele terminou.
18. Colete a placa de 12 poços e incuba-a em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ por pelo menos 18 h para que os esferoides sejam completamente formados e compactos.
19. Colher manualmente os esferoides após 1, 3 e 7 dias de cultura para análise. Lave manualmente o meio com uma micropipette para liberar os esferoides do hidrogel agarose microolded não-aderente.
20. Após 5 min, verifique sob o microscópio para determinar se os esferoides estão completamente liberados do hidrogel agarose micromolded não-aderente.
21. Colete os esferoides manualmente usando uma micropipette e transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mL.
22. Lave os esferoides pelo menos duas vezes com 0,01 M PBS. Avalie a viabilidade e realize análises biomecânicas nas amostras de esferoide frescos. Para análise de morfologia (histologia), incubar as amostras de esferoides em 4% de paraformaldeído em PBS por pelo menos 18 h a 2-8 °C.

Resultados

O sistema de pipeta automática pode semear a suspensão da célula ASC em 12 poços de uma placa de 12 poços em 15 minutos. Usando o hidrogel não aderente de 81 micromoldados produzirá 972 esferoides no final do protocolo. O uso do hidrogel não aderente de 256 micromoldados produzirá 3.072 esferoides no final do protocolo. Os spheróides ASC foram analisados para a homogeneidade de seu tamanho e forma. Os esferoides ASC de micromedes com 81 recessões apresentaram diâmetro homogêneo durante o período de cultura ...

Discussão

Este artigo apresenta a geração em larga escala de esferoides ASC usando um sistema automatizado de pipetas. O passo crítico do protocolo é configurar precisamente o software para garantir o volume correto de suspensão, velocidade e distância da célula para a tubulação. Os parâmetros descritos no protocolo foram determinados após uma série de ensaios para otimizar a dispensa da suspensão da célula ASC nos poços de placas de 12 poços contendo os hidrogéis micromoedos e não aderentes. A otimização foi a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100