3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

요약

여기에서는 세포 현탁액을 시드하기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASC) 구상체의 대규모 생산을 설명하므로 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 ASC 구상체는 3D 바이오 프린팅 접근법의 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다.

초록

지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASCs)는 중간엽 기질 / 줄기 세포의 고전적인 원천으로 인정되는 인간 피하 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 발견되는 세포의 하위 집단입니다. 스캐폴드 기반 조직 공학 접근법에 대한 ASC와 함께 많은 연구가 발표되었으며, 주로 생리 활성 스캐폴드에 시딩 한 후 이러한 세포의 행동을 탐구했습니다. 그러나, 스캐폴드-프리 접근법은 스캐폴드-기반 접근법의 한계를 극복하기 위해 주로 스페로이드를 사용하여 시험관내 및 생체내에서 조직을 설계하기 위해 등장하고 있다.

구상체는 자기 조립 공정에 의해 형성된 3D 미세조직이다. 그들은 주로 세포 대 세포 및 세포 대 세포 매트릭스 상호 작용의 확대로 인해 네이티브 조직의 구조와 미세 환경을 더 잘 모방 할 수 있습니다. 최근에는 구상체가 주로 질병 모델, 약물 스크리닝 연구 및 3D 바이오 프린팅을위한 빌딩 블록으로 탐구되고 있습니다. 그러나 3D 바이오 프린팅 접근법의 경우 크기와 모양이 균질 한 수많은 구상체가 복잡한 조직 및 장기 모델을 생물로 제작하는 데 필요합니다. 또한, 구상체가 자동으로 생성되면 미생물 오염의 가능성이 거의 없으므로 방법의 재현성이 높아집니다.

구상체의 대규모 생산은 3D 바이오 프린팅 공정에서 계속되고 생물 반응기에서 조직 구성물의 완전한 성숙으로 끝나는 생물 제조 라인을 개발하기위한 첫 번째 필수 단계로 간주됩니다. 그러나 대규모 ASC 스페로이드 생산을 탐구 한 연구의 수는 ASC 구상체를 3D 바이오 프린팅의 빌딩 블록으로 사용한 연구의 수와 함께 여전히 부족합니다. 따라서, 본 글은 3D 바이오프린팅 접근법의 빌딩 블록으로서 ASC 구상체를 확산시키는 비접착성 마이크로몰딩 하이드로겔 기술을 이용한 ASC 구상체의 대규모 생산을 보여주는 것을 목표로 한다.

서문

구상체는 조직 공학에서 스캐폴드가없는 접근법으로 간주됩니다. ASC는 자체 조립 공정에 의해 구상체를 형성 할 수 있습니다. 스페로이드의 3D 마이크로 아키텍처는 ASC의 재생 잠재력을 증가시키며, 여기에는 여러 계보 ^1,2,3으로의 분화 능력이 포함됩니다. 이 연구 그룹은 연골 및 뼈 조직 공학 ^4,5,6을 위해 ASC 구상체와 협력하고 ^있습니다. 더 중요한 것은, 구상체는 주로 융합 능력으로 인해 조직과 기관의 생물 조작에서 빌딩 블록으로 간주됩니다.

조직 형성을위한 구상체의 사용은 세 가지 주요 포인트에 달려 있습니다 : (1) 생물 제조를위한 표준화되고 확장 가능한 로봇 방법의 개발⁷, (2) 조직 구상체의 체계적인 표현형⁸, (3) 3D 조직의 조립을위한 방법의 개발⁹. 이들 구상체는 상이한 세포 유형으로 형성될 수 있고, 교수형 드롭, 재응집, 미세유체학, 및 마이크로몰드 ^8,9,10을 포함하는 다양한 방법을 통해 수득될 수 있다. 이들 방법들 각각은 구상체의 크기 및 형상의 균질성, 형성 후 구상체의 회수, 생산된 구상체의 수, 공정 자동화, 노동 강도 및 비용(¹¹)과 관련된 장단점을 갖는다.

마이크로몰드 방법에서, 세포는 중력 때문에 마이크로몰드의 바닥에 분배되고 증착된다. 비접착성 하이드로겔은 세포가 바닥에 부착하는 것을 허용하지 않으며, 세포-대-세포 상호작용은 후퇴 당 단일 스페로이드의 형성을 유도한다 ^8,12. 이 생물 제조 방법은 균일하고 통제 된 크기의 구상체를 생성하고, 최소한의 노력으로 시간 효율적인 방식으로 대규모 생산을 위해 로봇화 될 수 있으며, 조직 스페로이드 ^7,8의 생물 제조 설계에 비용 효율성이 중요한 요소를 가지고 있습니다. 이 방법은 예측 가능하고 최적이며 조절 가능한 특성을 갖는 새로운 조직 유형을 제조하기 위해 임의의 세포 계보의 구상체를 형성하는데 적용될 수 있다⁸.

생물 제조는 "구조적 조직을 가진 생물학적 기능성 제품의 자동화 된 생성"으로 정의됩니다 ..."¹³. 따라서 구상체의 자동 생산은 3D 바이오 프린팅 공정에서 계속되고 스페로이드 융합에 의한 생체 인쇄 조직의 완전한 성숙으로 마무리되는 생물 제조 라인을 개발하기위한 첫 번째 필수 단계로 간주됩니다. 이 연구에서는 ASC 스페로이드 생물 제조의 확장 성을 향상시키기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 세포 현탁액을 시드하여 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 논문은 더 복잡한 조직 모델을 생물 제조하기위한 3D 바이오 프린팅 접근법에 필요한 많은 수의 (수천)의 구상체를 생산할 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜

이 연구에 사용 된 ASC는 이전에 건강한 인간 기증자로부터 분리되었으며 브라질 리우데자네이루 연방 대학 클레멘티노 프라가 필로 대학 병원 (25818719.4.0000.5257)의 연구 윤리위원회에 따라 14에 설명 된 바와 같이 냉동 보존되었습니다. 이 연구에 사용 된 모든 재료 및 장비에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.

1. 세 번째 통로에서 ASC 단층의 트립신화

1. ASCs의 단층을 함유하는 조직 배양물을 80% 합류에서 함유하는 175^cm2 플라스크를 열고 상청액을 폐기한다.
2. 인산완충식염수(PBS, 0.01 M) 7 mL를 첨가하고 단층을 두 번 세척한다. 그런 다음 액체를 버리십시오.
3. 0.125% 트립신 5mL를 0.78mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 함께 첨가한다. 다음에, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
4. 조직 배양 175^cm2 플라스크에 10% 태아 소 혈청(FBS)이 있는 저글루코스 둘베코 변형 이글 배지(DMEM LOW) 10 mL를 첨가하고, 세포 현탁액을 10 mL 혈청 피펫과 잘 섞는다.
5. 세포 현탁액을 10 mL 혈청학적 피펫으로 수확하고 이를 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 다음으로, 400 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 ASCs의 펠렛을 얻었다. 세포 펠릿을 10% FBS를 함유하는 DMEM LOW 를 사용하여 재현탁시킨다.
6. 트립판 제외에 의해 셀 카운트를 수행하십시오.
7. 계수한 후, 별도의 15 mL 원심분리 튜브에 총 1 × 10,6 ASCs를 취하여 비부착성 하이드로젤로 마이크로몰딩된 81개의 후퇴를 시드한다(여기에 시딩된 총 10,000 세포/mL). 마이크로몰딩된 비부착성 하이드로젤의 256개의 후퇴를 시드하려면, 총 5개의 × 10개의 5개의 ASC를 원심분리 튜브(여기에 시드된 총 2,500^개의 세포/mL)에 취하십시오.

2. 마이크로 몰딩 된 비 부착성 아가로스 하이드로 겔 제조

1. 초순수에서 0.9% NaCl 중의 2% 초순수 아가로스의 멸균 용액 50 mL를 제조하였다. 용액을 121°C에서 30분 동안 오토클레이브한다.
2. 500 μL의 멸균 2% 초순수 아가로스 용액을 81 또는 256개의 원형 오목부를 함유하는 실리콘 몰드의 중앙에 첨가한다.
3. 40분 후, 실리콘 몰드로부터 초순수 아가로오스를 성형을 풀고 12웰 플라스틱 플레이트의 웰에 놓는다.
4. 마이크로몰딩된 아가로오스와 함께 웰에 DMEM LOW 의 2 mL를 첨가하고, ASCs를 시딩하기 전에 적어도 12시간 동안 5%_CO2 분위기에서 37°C의 인큐베이터에서 인큐베이션한다.

3. 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용한 ASC 구상체의 생물 제조

1. 다음을 확인하십시오.
   1. 층류가 켜져 있고 캐비닛의 공기 흐름이 제대로 작동하는지 확인하십시오.
   2. 장비가 올바른 전압에 연결되어 있는지 확인하십시오.
   3. 태블릿이 장비에 연결되어 있는지 확인합니다.
   4. 캐비닛 보호 유리의 높이가 장비의 센서 표시와 동일한 높이인지 확인하십시오.
2. 장비 왼쪽의 켜기/끄기 버튼을 누르고 태블릿과 장비가 시작될 때까지 기다립니다.
3. 팁 박스, 원심분리 튜브용 랙 및 마이크로몰딩된 아가로스 하이드로겔이 포함된 플레이트를 장비의 작업 공간에 배치합니다.
4. 소프트웨어가 열린 태블릿에서 먼저 Labware Editor를 클릭하십시오.
5. 가상 작업대를 설정하고 피펫, 팁 박스, 플라스틱 튜브용 랙 및 플레이트의 위치를 선택합니다.
   참고: 가상 작업대는 장비에서 액세서리의 물리적 위치를 나타내야 합니다.
6. Switch to Produce 버튼을 클릭하여 실험 전반에 걸쳐 장비가 수행할 파라미터(3.10단계 참조)와 명령을 포함합니다. 도구 모음과 생성 목록이 소프트웨어에서 열릴 때까지 기다립니다.
7. 처음에는 명령을 나타내려면 피펫팅할 샘플 수를 포함하고 이를 생성 목록으로 끕니다.
   참고: 샘플의 수는 마이크로몰드의 중앙에 시딩될 ASC 현탁액을 포함하는 플라스틱 원심분리 튜브의 수이다.
8. 샘플 수를 입력한 후 소프트웨어의 샘플 전송 명령 단추를 클릭하여 ASC 서스펜션을 마이크로몰드가 포함된 12웰 플레이트의 웰로 전송 하고 이를 생산 목록으로 드래그합니다.
9. 속성을 클릭하여 장비를 시료로 전송할 시작 및 끝 위치를 설정합니다.
10. 소프트웨어가 작업 테이블 페이지로 돌아갈 때까지 기다립니다. 옵션 버튼을 클릭하여 ASC의 자동 시드에 대한 매개 변수를 설정하십시오 : i) 15.4 ^s-1의 흡인 속도; ii) 1 ^s-1의 분배 속도; iii) 0ms의 송풍 지연; iv) 15.4 ^s-1의 송풍 속도; v) 100 %의 초기 스트로크. 표준 액체 유형으로 물을 선택합니다.
11. 균질한 현탁액을 얻기 위해 ASC를 혼합하도록 파라미터를 설정한다: i) 사이클 수 5; ii) 6.5 ^s-1의 속도; iii) 300 μL의 부피.
12. 매개 변수를 설정 한 후 40 분의 시간을 생산 목록에 추가하십시오.
    참고: 이 시간은 ASC 서스펜션이 마이크로몰드의 바닥에서 데칸트될 때까지 기다리는 데 필요합니다.
13. 생산 목록에는 스페로이드 배양 배지를 플레이트의 해당 웰로 옮기는 시약 전달 옵션을 포함시키십시오.
14. 3.9-3.11단계를 반복하여 스페로이드 배양 배지를 전달하도록 위치 및 파라미터 구성을 설정합니다.
15. 소프트웨어의 상단 막대에 확인 기호가있는 버튼을 클릭하여 프로그래밍 오류가 없는지 확인하십시오.
16. 소프트웨어의 상단 막대에있는 재생 버튼 (삼각형 기호 포함)을 클릭하여 프로그램을 시작하십시오.
17. 프로그래밍된대로 장비를 시작하고 소리가 나고 완료되었음을 나타낼 때까지 기다리십시오.
18. 12-웰 플레이트를 수집하고, 구상체가 완전히 형성되고 콤팩트해지도록 적어도 18시간 동안 37°C, 5%_CO2 의 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
19. 분석을 위해 배양 1, 3 및 7일 후에 구상체를 수동으로 수확한다. 배지를 마이크로피펫으로 수동으로 플러시하여 마이크로몰딩된 비부착성 아가로스 하이드로젤로부터 구상체를 해방시킨다.
20. 5분 후, 현미경으로 확인하여 미세성형된 비부착성 아가로스 하이드로젤로부터 구상체가 완전히 방출되는지 여부를 확인하였다.
21. 마이크로피펫을 사용하여 수동으로 구상체를 수집하고 이를 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
22. 구상체를 0.01 M PBS로 적어도 두 번 세척한다. 생존력을 평가하고 신선한 스페로이드 샘플에 대한 생체 역학 분석을 수행합니다. 형태학 분석(조직학)을 위해, 스페로이드 샘플을 2-8°C에서 적어도 18시간 동안 PBS 중의 4% 파라포름알데히드로 인큐베이션한다.

결과

자동 피펫 시스템은 ASC 세포 현탁액을 15분 안에 하나의 12웰 플레이트의 12웰에 시드할 수 있다. 81개의 마이크로몰딩된 비부착성 하이드로젤을 사용하면 프로토콜의 끝에서 972개의 구상체가 생성될 것이다. 256개의 마이크로몰딩된 비부착성 하이드로젤을 사용하면 프로토콜의 끝에서 3,072개의 구상체가 생성될 것이다. ASC 구상체는 그들의 크기 및 형상의 균질성에 대해 분석되었다. 81번의 후퇴를 ...

토론

이 백서에서는 자동화된 피펫 시스템을 사용하여 대규모 ASC 구상체 생성을 제시합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 피펫팅을위한 셀 서스펜션, 속도 및 거리의 올바른 볼륨을 보장하기 위해 소프트웨어를 정확하게 설정하는 것입니다. 프로토콜에 기재된 파라미터는 마이크로몰딩된, 비부착성 하이드로겔을 함유하는 12-웰 플레이트의 웰 내로 ASC 세포 현탁액의 분배를 최적화하기 위한 다수의 시?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100