Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D

Resumen

Aquí, describimos la producción a gran escala de esferoides estromales /células madre (ASC) derivados de tejido adiposo utilizando un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Estos esferoides ASC se pueden utilizar como bloques de construcción para enfoques de bioimpresión 3D.

Resumen

Las células estromales/madre derivadas de tejido adiposo (ASC) son una subpoblación de células que se encuentran en la fracción vascular estromal del tejido adiposo subcutáneo humano reconocido como una fuente clásica de células estromales/madre mesenquimales. Se han publicado muchos estudios con ASC para enfoques de ingeniería de tejidos basados en andamios, que exploraron principalmente el comportamiento de estas células después de su siembra en andamios bioactivos. Sin embargo, están surgiendo enfoques libres de andamios para diseñar tejidos in vitro e in vivo, principalmente mediante el uso de esferoides, para superar las limitaciones de los enfoques basados en andamios.

Los esferoides son microtejidos 3D formados por el proceso de autoensamblaje. Pueden imitar mejor la arquitectura y el microambiente de los tejidos nativos, principalmente debido a la ampliación de las interacciones de célula a célula y de célula a matriz extracelular. Recientemente, los esferoides se están explorando principalmente como modelos de enfermedades, estudios de detección de drogas y bloques de construcción para la bioimpresión 3D. Sin embargo, para los enfoques de bioimpresión 3D, numerosos esferoides, homogéneos en tamaño y forma, son necesarios para biofabricar modelos complejos de tejidos y órganos. Además, cuando los esferoides se producen automáticamente, hay pocas posibilidades de contaminación microbiológica, lo que aumenta la reproducibilidad del método.

La producción a gran escala de esferoides se considera el primer paso obligatorio para desarrollar una línea de biofabricación, que continúa en el proceso de bioimpresión 3D y termina en la maduración completa de la construcción de tejidos en biorreactores. Sin embargo, el número de estudios que exploraron la producción de esferoides ASC a gran escala aún es escaso, junto con el número de estudios que utilizaron esferoides ASC como bloques de construcción para la bioimpresión 3D. Por lo tanto, este artículo tiene como objetivo mostrar la producción a gran escala de esferoides ASC utilizando una técnica de hidrogel micromoldeado no adhesivo que difunde los esferoides ASC como bloques de construcción para los enfoques de bioimpresión 3D.

Introducción

Los esferoides se consideran un enfoque libre de andamios en la ingeniería de tejidos. Los ASC son capaces de formar esferoides mediante el proceso de autoensamblaje. La microarquitectura 3D del esferoide aumenta el potencial regenerativo de los ASC, incluida la capacidad de diferenciación en múltiples linajes ^1,2,3. Este grupo de investigación ha estado trabajando con esferoides ASC para la ingeniería de cartílago y tejido óseo ^4,5,6. Más importante aún, los esferoides se consideran bloques de construcción en la biofabricación de tejidos y órganos, principalmente debido a su capacidad de fusión.

El uso de esferoides para la formación de tejidos depende de tres puntos principales: (1) el desarrollo de métodos robóticos estandarizados y escalables para su biofabricación⁷, (2) el fenotipado sistemático de esferoides tisulares⁸, (3) el desarrollo de métodos para el ensamblaje de tejidos 3D⁹. Estos esferoides se pueden formar con diferentes tipos de células y obtenerse a través de diversos métodos, incluyendo gota colgante, reagregación, microfluídica y micromoldes ^8,9,10. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas relacionadas con la homogeneidad del tamaño y la forma de los esferoides, la recuperación de los esferoides después de la formación, el número de esferoides producidos, la automatización del proceso, la intensidad de la mano de obra y los costos¹¹.

En el método del micromoldo, las células se dispensan y se depositan en la parte inferior del micromoldo debido a la gravedad. El hidrogel no adhesivo no permite que las células se adhieran al fondo, y las interacciones de célula a célula conducen a la formación de un solo esferoide por recesión ^8,12. Este método de biofabricación genera esferoides de tamaño homogéneo y controlado, puede ser robotizado para la producción a gran escala de una manera eficiente en el tiempo con el mínimo esfuerzo, y tiene buenos factores críticos de costo-efectividad en el diseño de una biofabricación de esferoide tisular ^7,8. Este método se puede aplicar para formar esferoides de cualquier linaje celular para preparar un nuevo tipo de tejido con características predecibles, óptimas y controlables⁸.

La biofabricación se define como "la generación automatizada de productos biológicamente funcionales con organización estructural..."¹³. Por lo tanto, la producción automatizada de esferoides se considera el primer paso obligatorio para desarrollar una línea de biofabricación, que continúa en el proceso de bioimpresión 3D y termina en la maduración completa del tejido bioimpreso por fusión esferoide. En este estudio, para mejorar la escalabilidad de la biofabricación de esferoides ASC, utilizamos un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Este artículo muestra que fue posible producir un gran número (miles) de esferoides necesarios para los enfoques de bioimpresión 3D para biofabricar modelos de tejidos más complejos.

Protocolo

Los ASC utilizados en este estudio fueron previamente aislados de donantes humanos sanos y criopreservados como se describe¹⁴ según el Comité de Ética en Investigación del Hospital Universitario Clementino Fraga Filho, Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil (25818719.4.0000.5257). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este estudio.

1. Tripsinización de la monocapa ASC en el paso tres

1. Abrir el matraz de cultivo tisular^de 175 cm 2 que contiene la monocapa de ASCs al 80% de confluencia y desechar el sobrenadante.
2. Agregue 7 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0.01 M) y lave la monocapa dos veces. A continuación, deseche el líquido.
3. Añadir 5 ml de tripsina al 0,125% con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 0,78 ml de ácido etilendiaminotetraacético. A continuación, incubar durante 5 min a 37 °C.
4. Añadir 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) bajo en glucosa con suero fetal bovino (FBS) al cultivo tisular de 175 cm² matraz y mezclar bien la suspensión celular con una pipeta sorológica de 10 mL.
5. Cosechar la suspensión celular con una pipeta serológica de 10 ml y transferirla a un tubo centrífugo de 50 ml. A continuación, centrifugar a 400 × g durante 5 min para obtener el pellet de ASCs. Resuspend el pellet celular usando DMEM LOW que contiene 10% fbs.
6. Realice un recuento de celdas por exclusión de tripano.
7. Después de contar, tome un total de 1 × 10⁶ ASC en un tubo de centrífuga separado de 15 ml para sembrar las 81 recesiones micromoldeadas con hidrogel no adherente (un total de 10,000 células / ml sembradas aquí). Para sembrar 256 recesiones de hidrogel micromoldeado no adherente, tome un total de 5 × 10⁵ ASC en un tubo de centrífuga (un total de 2,500 células / ml sembrados aquí).

2. Fabricación de hidrogel de agarosa no adherente micromoldeado

1. Preparar 50 ml de una solución estéril de agarosa ultrapura al 2% en NaCl al 0,9% en agua ultrapura. Autoclave la solución durante 30 min a 121 °C.
2. Agregue 500 μL de solución estéril de agarosa ultrapura al 2% en el centro de un molde de silicona que contenga 81 o 256 huecos circulares.
3. Después de 40 minutos, desmolde la agarosa ultrapura del molde de silicona y colócala en un pozo de una placa de plástico de 12 pocillos.
4. Añadir 2 mL de DMEM LOW en el pozo con la agarosa micromoldeada e incubar en una incubadora a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO₂ durante al menos 12 h antes de sembrar los ASC.

3. Biofabricación de esferoides ASC utilizando el sistema de pipeteo automatizado

1. Compruebe lo siguiente:
   1. Compruebe si el flujo laminar está activado y si el flujo de aire del gabinete funciona correctamente.
   2. Compruebe si el equipo está conectado a la tensión correcta.
   3. Compruebe si la tableta está conectada al equipo.
   4. Compruebe si la altura del vidrio de protección del gabinete está a la misma altura que el marcado del sensor del equipo.
2. Presione el botón de encendido / apagado en el lado izquierdo del equipo y espere a que la tableta y el equipo se inicien.
3. Coloque las cajas de punta, el bastidor para tubos de centrífuga y la placa que contiene el hidrogel de agarosa micromoldeado en el espacio de trabajo del equipo.
4. En la tableta con el software abierto, primero haga clic en Labware Editor.
5. Configure una mesa de trabajo virtual y elija las posiciones de las pipetas, las cajas de puntas, el bastidor para los tubos de plástico y las placas.
   NOTA: La mesa de trabajo virtual debe representar las posiciones físicas de los accesorios en el equipo.
6. Haga clic en el botón Cambiar a producir para incluir los parámetros (consulte el paso 3.10) y los comandos que el equipo llevará a cabo a lo largo del experimento. Espere a que se abra una barra de herramientas y una lista de productos en el software.
7. Inicialmente, para indicar los comandos, incluya el número de muestras que se van a pipetear y arrástrelo a la Lista de productos.
   NOTA: El número de muestras es el número de tubos de centrífuga de plástico que contienen la suspensión ASC que se sembrará en el centro de los micromoldes.
8. Después de ingresar el número de muestras, haga clic en el botón de comando Transferencia de muestras en el software para transferir la suspensión ASC a los pocillos de la placa de 12 pocillos, que contiene los micromoldes, y arrástrela a la Lista de productos.
9. Haga clic en Propiedades para configurar las posiciones de inicio y fin del equipo para transferir la muestra.
10. Espere a que el software vuelva a la página Tabla de trabajo . Haga clic en el botón Opciones para configurar los parámetros para la siembra automatizada de los ASC: i) Velocidad de aspiración de 15.4 ^s-1; ii) Velocidad de dispensación de 1 ^s-1; iii) Retardo de soplado de 0 ms; iv) Velocidad de soplado de 15.4 ^s-1; v) Accidente cerebrovascular inicial del 100%. Seleccione Agua como el tipo de líquido estándar.
11. Configurar los parámetros para mezclar los ASCs para obtener una suspensión homogénea: i) Número de Ciclos de 5; ii) Velocidad de 6.5 ^s-1; iii) Volumen de 300 μL.
12. Después de configurar los parámetros, agregue el tiempo de 40 minutos a la lista de productos.
    NOTA: Este tiempo es necesario esperar a que la suspensión ASC se decante en la parte inferior del micromold.
13. En la Lista de productos, incluya la opción Transferencia de reactivos para transferir el medio de cultivo de esferoides a los pozos correspondientes de la placa.
14. Repita los pasos 3.9 a 3.11 para configurar las configuraciones de posición y parámetros para transferir el medio de cultivo de esferoides.
15. Haga clic en el botón con un símbolo de verificación en la barra superior del software para asegurarse de que no haya ningún error de programación.
16. Haga clic en el botón Reproducir (con un símbolo de triángulo) en la barra superior del software para iniciar el programa.
17. Deje que el equipo arranque, según lo programado, y espere a que emita un sonido, indicando que ha terminado.
18. Recoge la placa de 12 pocillos e inculícala en una incubadora a 37 °C, 5% CO₂ durante al menos 18 h para que los esferoides estén completamente formados y compactos.
19. Cosechar manualmente los esferoides después de 1, 3 y 7 días de cultivo para su análisis. Enjuague manualmente el medio con una micropipeta para liberar los esferoides del hidrogel de agarosa no adherente micromoldeado.
20. Después de 5 min, verifique bajo el microscopio para determinar si los esferoides se liberan completamente del hidrogel de agarosa no adherente micromoldeado.
21. Recoja los esferoides manualmente usando una micropipeta y transfiéralos a un tubo centrífugo de 15 ml.
22. Lave los esferoides al menos dos veces con 0,01 M PBS. Evaluar la viabilidad y realizar análisis biomecánicos en las muestras de esferoides frescos. Para el análisis morfológico (histología), incubar las muestras de esferoides en paraformaldehído al 4% en PBS durante al menos 18 h a 2-8 °C.

Resultados

El sistema automático de pipetas puede sembrar la suspensión de células ASC en 12 pocillos de una placa de 12 pocillos en 15 minutos. El uso del hidrogel no adherente micromoldeado de 81 producirá 972 esferoides al final del protocolo. Utilizando el hidrogel no adherente micromoldeado 256 producirá 3.072 esferoides al final del protocolo. Los esferoides ASC fueron analizados por la homogeneidad de su tamaño y forma. Los esferoides ASC de micromoldes con 81 recesiones mostraron un diámetro homogéneo durante el per...

Discusión

Este artículo presenta la generación a gran escala de esferoides ASC utilizando un sistema automatizado de pipetas. El paso crítico del protocolo es configurar con precisión el software para garantizar el volumen correcto de suspensión de celdas, velocidad y distancia para el pipeteo. Los parámetros descritos en el protocolo se determinaron después de una serie de ensayos para optimizar la dispensación de la suspensión celular ASC en los pocillos de placas de 12 pocillos que contienen los hidrogeles micromoldead...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100