Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D

Riepilogo

Qui, descriviamo la produzione su larga scala di sferoidi stromali / cellule staminali (ASC) di derivazione adiposa utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questi sferoidi ASC possono essere utilizzati come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.

Abstract

Le cellule stromali/staminali di derivazione adiposa (ASC) sono una sottopopolazione di cellule presenti nella frazione vascolare stromale del tessuto adiposo sottocutaneo umano riconosciuta come fonte classica di cellule stromali/staminali mesenchimali. Molti studi sono stati pubblicati con ASC per approcci di ingegneria tissutale basati su scaffold, che hanno esplorato principalmente il comportamento di queste cellule dopo la loro semina su scaffold bioattivi. Tuttavia, stanno emergendo approcci senza impalcature per ingegnerizzare i tessuti in vitro e in vivo, principalmente utilizzando sferoidi, per superare i limiti degli approcci basati su scaffold.

Gli sferoidi sono microtessuti 3D formati dal processo di auto-assemblaggio. Possono imitare meglio l'architettura e il microambiente dei tessuti nativi, principalmente a causa dell'ingrandimento delle interazioni cellula-cellula e cellula-cellula-matrice extracellulare. Recentemente, gli sferoidi vengono esplorati principalmente come modelli di malattia, studi di screening farmacologico e elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Tuttavia, per gli approcci di bioprinting 3D, sono necessari numerosi sferoidi, omogenei per dimensioni e forma, per biofabbricare modelli complessi di tessuti e organi. Inoltre, quando gli sferoidi vengono prodotti automaticamente, ci sono poche possibilità di contaminazione microbiologica, aumentando la riproducibilità del metodo.

La produzione su larga scala di sferoidi è considerata il primo passo obbligatorio per lo sviluppo di una linea di biofabbricazione, che continua nel processo di bioprinting 3D e termina nella piena maturazione del costrutto tissutale nei bioreattori. Tuttavia, il numero di studi che hanno esplorato la produzione di sferoidi ASC su larga scala sono ancora scarsi, insieme al numero di studi che hanno utilizzato gli sferoidi ASC come elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Pertanto, questo articolo mira a mostrare la produzione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando una tecnica di idrogel microstampato non adesiva che diffonde sferoidi ASC come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.

Introduzione

Gli sferoidi sono considerati un approccio privo di impalcature nell'ingegneria tissutale. Gli ASC sono in grado di formare sferoidi dal processo di auto-assemblaggio. La microarchitettura 3D dello sferoide aumenta il potenziale rigenerativo delle ASC, compresa la capacità di differenziazione in più lignaggi ^1,2,3. Questo gruppo di ricerca ha lavorato con sferoidi ASC per l'ingegneria della cartilagine e del tessuto osseo ^4,5,6. Ancora più importante, gli sferoidi sono considerati el....

Protocollo

Gli ASC utilizzati in questo studio erano precedentemente isolati da donatori umani sani e crioconservati come descritto¹⁴ secondo il Comitato etico di ricerca dell'Ospedale Universitario Clementino Fraga Filho, Università Federale di Rio de Janeiro, Brasile (25818719.4.0000.5257). Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo studio.

1. Tripsinizzazione del monostrato ASC al passaggio tre

1. Aprire la coltura tissutale di 175 cm² matraccio contenente il monostrato di ASC all'80% di confluenza ed e....

Risultati

Il sistema di pipette automatiche può seminare la sospensione della cella ASC in 12 pozzetti di una piastra a 12 pozzetti in 15 minuti. L'utilizzo dell'idrogel non aderente 81 microstampato produrrà 972 sferoidi alla fine del protocollo. L'utilizzo di 256 idrogel non aderenti microstampato produrrà 3.072 sferoidi alla fine del protocollo. Gli sferoidi ASC sono stati analizzati per l'omogeneità delle loro dimensioni e forma. Gli sferoidi ASC dei microstidi con 81 recessioni hanno mostrato un diametro omogeneo durante .......

Discussione

Questo documento presenta la generazione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando un sistema di pipette automatizzato. Il passaggio critico del protocollo è quello di impostare con precisione il software per garantire il corretto volume di sospensione della cella, la velocità e la distanza per il pipettaggio. I parametri descritti nel protocollo sono stati determinati dopo una serie di prove per ottimizzare l'erogazione della sospensione cellulare ASC nei pozzetti di piastre a 12 pozzetti contenenti gli idrogel micro.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100