ייצור אוטומטי בקנה מידה גדול של כדורי תאי גזע שמקורם בשומן להדפסה ביולוגית תלת-ממדית

Summary

כאן, אנו מתארים את הייצור בקנה מידה גדול של כדוריות סטרומליות/תאי גזע שמקורן בשומן (ASC) באמצעות מערכת פיפטינג אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח הומוגניות של גודל וצורת ספרואידים. כדורי ASC אלה יכולים לשמש כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

Abstract

תאי גזע סטרומליים/גזעיים שמקורם בשומן (ASCs) הם תת-אוכלוסייה של תאים המצויים בחלק הווסקולרי הסטרומלי של רקמת השומן התת-עורית האנושית המוכרת כמקור קלאסי לתאי סטרומל/גזע מזנכימליים. מחקרים רבים פורסמו עם ASCs עבור גישות מבוססות הנדסת רקמות מבוססות פיגומים, אשר חקרו בעיקר את התנהגותם של תאים אלה לאחר זריעתם על פיגומים ביו-אקטיביים. עם זאת, גישות נטולות פיגומים מתפתחות כדי להנדס רקמות במבחנה וב-in vivo, בעיקר על ידי שימוש בספרואידים, כדי להתגבר על המגבלות של גישות מבוססות פיגומים.

ספרואידים הם מיקרוטיסואים תלת-ממדיים הנוצרים על ידי תהליך ההרכבה העצמית. הם יכולים לחקות טוב יותר את הארכיטקטורה והמיקרו-סביבה של רקמות מקומיות, בעיקר הודות להגדלה של אינטראקציות בין תא לתא ומטריצה מחוץ לתא. לאחרונה, ספרואידים נחקרים בעיקר כמודלים למחלות, מחקרי סינון תרופות ואבני בניין להדפסה ביולוגית תלת-ממדית. עם זאת, עבור גישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, כדוריואידים רבים, הומוגניים בגודלם ובצורתם, נחוצים לביו-פבריקציה של מודלים מורכבים של רקמות ואיברים. בנוסף, כאשר spheroids מיוצרים באופן אוטומטי, יש סיכוי קטן לזיהום מיקרוביולוגי, הגדלת השכפול של השיטה.

הייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים נחשב לצעד החובה הראשון לפיתוח קו ביו-פבריקציה, הממשיך בתהליך ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית ומסתיים בהבשלה מלאה של מבנה הרקמה בביוריאקטורים. עם זאת, מספר המחקרים שבחנו את ייצור כדוריות ה-ASC בקנה מידה גדול עדיין נדיר, יחד עם מספר המחקרים שהשתמשו בספרואידים ASC כאבני בניין להדפסה ביולוגית תלת-ממדית. לכן, מאמר זה נועד להראות את הייצור בקנה מידה גדול של כדורי ASC באמצעות טכניקת הידרוג'ל מיקרומולד שאינה דביקה המפזרת כדורי ASC כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

Introduction

ספרואידים נחשבים לגישה נטולת פיגומים בהנדסת רקמות. ASCs מסוגלים ליצור ספרואידים על ידי תהליך ההרכבה העצמית. המיקרו-ארכיטקטורה התלת-ממדית של הספרואיד מגדילה את פוטנציאל ההתחדשות של ASCs, כולל יכולת ההתמיינות לשושלות מרובות ^1,2,3. קבוצת מחקר זו עובדת עם כדוריות ASC להנדסת סחוס ורקמות עצם ^4,5,6. חשוב מכך, ספרואידים נחשבים לאבני בניין בביו-פבריקציה של רקמות ואיברים, בעיקר בשל יכולת ההיתוך שלהם.

השימוש בספרואידים להיווצרות רקמות תלוי בשלוש נקודות עיקריות: (1) פיתוח שיטות רובוטיות סטנדרטיות ומדרגיות לביו-פבריקציה שלהם⁷, (2) פנוטיפ שיטתי של כדוריות^{רקמה 8}, (3) פיתוח שיטות להרכבה של רקמות תלת-ממדיות⁹. ניתן ליצור ספרואידים אלה עם סוגי תאים שונים ולהתקבל בשיטות שונות, כולל טיפה תלויה, צבירה מחדש, מיקרופלואידיקה ומיקרומולדס ^8,9,10. לכל אחת מהשיטות הללו יש יתרונות וחסרונות הקשורים להומוגניות של גודל וצורת הספרואידים, התאוששות הספרואידים לאחר היווצרותם, מספר הספרואידים המיוצרים, אוטומציה של תהליכים, עוצמת עבודה ועלויות¹¹.

בשיטת המיקרומולד, התאים מחולקים ומופקדים בתחתית המיקרומולד בגלל כוח הכבידה. ההידרוג'ל שאינו דבק אינו מאפשר לתאים להיצמד לתחתית, ואינטראקציות בין תאים לתא מובילות להיווצרות של ספרואיד יחיד לכל מיתון ^8,12. שיטת ביו-פבריקציה זו מייצרת ספרואידים בגודל הומוגני ומבוקר, ניתנת לרובוטיזציה לייצור בקנה מידה גדול בצורה חסכונית בזמן עם מאמץ מינימלי, ויש לה גורמים טובים של עלות-תועלת קריטית בתכנון של ביו-פבריקציה של ספרואיד^{רקמה 7,8}. ניתן ליישם שיטה זו כדי ליצור ספרואידים של כל שושלת תאים כדי להכין סוג רקמה חדש עם מאפיינים צפויים, אופטימליים וניתנים לשליטה⁸.

Biofabrication מוגדר כ"ייצור אוטומטי של מוצרים פונקציונליים ביולוגית עם ארגון מבני ..."¹³. לכן, הייצור האוטומטי של ספרואידים נחשב לצעד החובה הראשון לפיתוח קו ביו-פבריקציה, הממשיך בתהליך ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית ומסתיים בהבשלה מלאה של הרקמה המודפסת ביולוגית על ידי היתוך ספרואידים. במחקר זה, כדי לשפר את יכולת ההרחבה של ביו-פבריקציה של ASC spheroid, אנו משתמשים במערכת צינורות אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח את ההומוגניות של גודל וצורת הספרואידים. מאמר זה מראה כי ניתן היה לייצר מספר רב (אלפי) של ספרואידים הדרושים לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית כדי ליצור ביו-פבריקט של מודלים מורכבים יותר של רקמות.

Protocol

ה- ASCs ששימשו במחקר זה בודדו בעבר מתורמים אנושיים בריאים ושימשו בהקפאה כמתואר¹⁴ על פי ועדת האתיקה המחקרית של בית החולים האוניברסיטאי קלמנטינו פראגה פילו, האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, ברזיל (25818719.4.0000.5257). ראה טבלת חומרים לפרטים לגבי כל החומרים והציוד המשמשים במחקר זה.

1. טריפסיניזציה של מונולאייר ASC במעבר שלוש

1. פתח את תרבית הרקמה 175 ס"מ² בקבוקון המכיל את החד-שכבתי של ASCs במפגש של 80% והשלך את הסופרנטנט.
2. הוסיפו 7 מ"ל של מי מלח עם חציץ פוספט (PBS, 0.01 מ') ושטפו את החד-שכבתי פעמיים. לאחר מכן, השליכו את הנוזל.
3. הוסף 5 מ"ל של 0.125% טריפסין עם 0.78 mM חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA). לאחר מכן, דגירה במשך 5 דקות ב 37 °C (84 °F).
4. הוסיפו 10 מ" ל של Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) לתרבית הרקמה 175 ס"מ² צלוחית וערבבו היטב את תרחיף התא עם פיפטה סורולוגית של 10 מ"ל.
5. קוצרים את תרחיף התא עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל ומעבירים אותה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 400 × g במשך 5 דקות כדי לקבל את הכדור של ASCs. בצעו החייאה של גלולת התא באמצעות DMEM LOW המכיל 10% FBS.
6. בצע ספירת תאים על-ידי אי הכללת טריפאן.
7. לאחר הספירה, קח בסך הכל 1 × 10⁶ ASCs בצינור צנטריפוגה נפרד של 15 מ"ל כדי לזרוע את 81 המיתונים במיקרומולד עם הידרוג'ל שאינו דבק (בסך הכל 10,000 תאים / מ"ל שנזרעו כאן). כדי לזרוע 256 מיתונים של הידרוג'ל שאינו דבק במיקרומולד, קחו בסך הכל 5 ×-10⁵ ASCs לתוך צינור צנטריפוגה (סה"כ 2,500 תאים/מ"ל שנזרעו כאן).

2. ייצור הידרוג'ל אגרוז שאינו דבק במיקרומולד

1. הכינו 50 מ"ל של תמיסה סטרילית של 2% אגרוז אולטרה-פורה ב-0.9% NaCl במים אולטרה-פוריים. Autoclave את הפתרון במשך 30 דקות ב 121 °C (66 °F).
2. הוסיפו 500 μL של תמיסת אגרוז אולטרה-אפור סטרילית של 2% במרכז תבנית סיליקון המכילה 81 או 256 שקעים עגולים.
3. לאחר 40 דקות, שחררו את האגרוס האולטרה-פורה מתבנית הסיליקון והניחו אותו בבאר של צלחת פלסטיק בת 12 בארות.
4. הוסיפו 2 מ"ל של DMEM LOW בבאר עם האגרוז המיקרומולד ואינקובטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% CO₂ למשך 12 שעות לפחות לפני זריעת ה-ASCs.

3. ביו-פבריקציה של כדוריות ASC באמצעות מערכת הצינורות האוטומטית

1. בדוק את הדברים הבאים:
   1. בדקו אם הזרימה הלמינרית פועלת, וזרימת האוויר של הארון פועלת כראוי.
   2. בדוק אם הציוד מחובר למתח הנכון.
   3. בדוק אם הטאבלט מחובר לציוד.
   4. בדוק אם גובה זכוכית ההגנה על הארון הוא באותו גובה כמו סימון החיישן של הציוד.
2. לחץ על לחצן הפעלה/כיבוי בצד שמאל של הציוד והמתן עד שהטאבלט והציוד יתניעו.
3. מקם את תיבות הקצוות, את המדף לצינורות צנטריפוגה ואת הצלחת המכילה את הידרוג'ל האגרוז המיקרו-מסולסל בסביבת העבודה של הציוד.
4. בטאבלט עם התוכנה פתוחה, לחץ תחילה על עורך Labware.
5. הגדירו שולחן עבודה וירטואלי ובחרו את מיקומי הפיפטות, קופסאות הטיפים, המדף לצינורות הפלסטיק והצלחות.
   הערה: שולחן העבודה הווירטואלי חייב לייצג את המיקומים הפיזיים של האביזרים בציוד.
6. לחץ על הלחצן Switch to Produce כדי לכלול את הפרמטרים (ראה שלב 3.10) ואת הפקודות שהציוד יבצע במהלך הניסוי. המתן לפתיחת סרגל כלים ורשימת הפקה בתוכנה.
7. בתחילה, כדי לציין את הפקודות, כלול את מספר הדגימות שיש לצנרת ולגרור אותו לרשימת התוצרת.
   הערה: מספר הדגימות הוא מספר צינורות הצנטריפוגה מפלסטיק המכילים את תרחיף ה- ASC שיש לזרוע במרכז המיקרומולדות.
8. לאחר הזנת מספר הדגימות, לחץ על לחצן הפקודה העברת דגימה בתוכנה כדי להעביר את מתלה ה- ASC לבארות של לוחית 12 הקידוחים, המכילה את המיקרומולדות, ולגרור אותה לרשימת התוצרת.
9. לחץ על מאפיינים כדי להגדיר את מיקומי ההתחלה והסיום עבור הציוד להעברת הדגימה.
10. המתן עד שהתוכנה תחזור לדף טבלת עבודה. לחץ על כפתור אפשרויות כדי להגדיר את הפרמטרים לזריעה אוטומטית של ה- ASCs: i) מהירות שאיפה של 15.4 ^s-1; ii) לוותר על מהירות של 1 ^s-1; 3) עיכוב מכה של 0 אלפיות השנייה; 4) מהירות מכה של 15.4 ^s-1; v) שבץ ראשוני של 100%. בחר מים כסוג הנוזל הסטנדרטי.
11. הגדר את הפרמטרים כדי לערבב את ASCs כדי לקבל השעיה הומוגנית: i) מספר מחזורים של 5; 2) מהירות של 6.5 ^s-1; iii) נפח של 300 μL.
12. לאחר הגדרת הפרמטרים, הוסף את השעה של 40 דקות לרשימת התוצרת.
    הערה: הפעם יש צורך להמתין עד שהתרחיף ASC יתפרק בתחתית המיקרומולד.
13. ברשימת התוצרת, כלול את האפשרות העברת ריאגנטים כדי להעביר את מדיום תרבית הספרואידים לבארות המתאימות של הצלחת.
14. חזור על שלבים 3.9-3.11 כדי להגדיר את תצורות המיקום והפרמטרים כדי להעביר את מדיום תרבית הספרואידים.
15. לחץ על הכפתור עם סמל סימון בסרגל העליון של התוכנה כדי לוודא שאין שגיאת תכנות.
16. לחץ על לחצן הפעל (עם סמל משולש) בסרגל העליון של התוכנה כדי להפעיל את התוכנית.
17. תן לציוד להתחיל, כפי שתוכנת, ולחכות שהוא ישמיע צליל, מה שמעיד על כך שהוא הסתיים.
18. אספו את צלחת 12 הבאר ודגמו אותה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 18 שעות לפחות כדי שהספרואידים ייווצרו במלואם וקומפקטיים.
19. קציר ידנית את הספרואידים לאחר 1, 3 ו -7 ימים של תרבות לניתוח. לשטוף את המדיום באופן ידני עם מיקרופיפט כדי לשחרר את הספרואידים מההידרוג'ל האגרוז שאינו דבק במיקרומולד.
20. לאחר 5 דקות, בדקו מתחת למיקרוסקופ כדי לקבוע אם הספרואידים משתחררים לחלוטין מההידרוג'ל האגרוז שאינו דבק במיקרומולד.
21. אסוף את הספרואידים באופן ידני באמצעות מיקרופיפט והעביר אותם לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
22. לשטוף את הספרואידים לפחות פעמיים עם 0.01 M PBS. להעריך את הכדאיות ולבצע ניתוחים ביומכניים על דגימות הספרואידים הטריות. לצורך ניתוח מורפולוגיה (היסטולוגיה), דגירה של דגימות הספרואידים ב-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 18 שעות לפחות בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.

תוצאות

מערכת הפיפטה האוטומטית יכולה לזרוע את מתלי תאי ה-ASC ל-12 בארות של צלחת אחת בת 12 בארות ב-15 דקות. שימוש בהידרוג'ל 81 מיקרומולד שאינו דבק יפיק 972 ספרואידים בסוף הפרוטוקול. שימוש בהידרוג'ל 256 מיקרומולד שאינו דבק יפיק 3,072 ספרואידים בסוף הפרוטוקול. כדורי ASC נותחו על ההומוגניות של גודלם וצורתם. כדורי ASC ...

Discussion

מאמר זה מציג את הדור בקנה מידה גדול של כדורי ASC באמצעות מערכת פיפטה אוטומטית. השלב הקריטי של הפרוטוקול הוא להגדיר במדויק את התוכנה כדי להבטיח את הנפח הנכון של מתלה התא, המהירות והמרחק לצינורות. הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול נקבעו לאחר מספר ניסויים כדי לייעל את חלוקת ההשעיה של תאי ASC לבארות של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100