Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die großtechnische Produktion von aus Fett gewonnenen Stroma-/Stammzell-Sphäroiden (ASC) unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems zur Aussaat der Zellsuspension, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Diese ASC-Sphäroide können als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze verwendet werden.

Zusammenfassung

Adipose-abgeleitete Stromal-/Stammzellen (ASCs) sind eine Subpopulation von Zellen, die in der stromalen vaskulären Fraktion des menschlichen subkutanen Fettgewebes vorkommen und als klassische Quelle mesenchymaler Stroma-/Stammzellen anerkannt sind. Viele Studien wurden mit ASCs für gerüstbasierte Tissue-Engineering-Ansätze veröffentlicht, die hauptsächlich das Verhalten dieser Zellen nach ihrer Aussaat auf bioaktiven Gerüsten untersuchten. Es entstehen jedoch gerüstfreie Ansätze, um Gewebe in vitro und in vivo zu entwickeln, hauptsächlich durch die Verwendung von Sphäroiden, um die Einschränkungen von gerüstbasierten Ansätzen zu überwinden.

Sphäroide sind 3D-Mikrogewebe, die durch den Selbstorganisationsprozess gebildet werden. Sie können die Architektur und Mikroumgebung von nativem Gewebe besser nachahmen, hauptsächlich aufgrund der Vergrößerung von Zell-zu-Zell- und Zell-zu-extrazellulärer Matrix-Interaktionen. In jüngster Zeit werden Sphäroide hauptsächlich als Krankheitsmodelle, Arzneimittelscreening-Studien und Bausteine für den 3D-Bioprinting untersucht. Für 3D-Bioprinting-Ansätze sind jedoch zahlreiche Sphäroide in Größe und Form erforderlich, um komplexe Gewebe- und Organmodelle bioherzustellen. Darüber hinaus besteht bei der automatischen Herstellung von Sphäroiden die Wahrscheinlichkeit einer mikrobiologischen Kontamination gering, was die Reproduzierbarkeit der Methode erhöht.

Die großtechnische Produktion von Sphäroiden gilt als erster obligatorischer Schritt für die Entwicklung einer Biofabrikationslinie, die im 3D-Bioprinting-Prozess fortgesetzt wird und in der vollständigen Reifung des Gewebekonstrukts in Bioreaktoren endet. Die Anzahl der Studien, die die groß angelegte ASC-Sphäroidproduktion untersuchten, ist jedoch immer noch gering, zusammen mit der Anzahl der Studien, die ASC-Sphäroide als Bausteine für den 3D-Bioprinting verwendeten. Daher zielt dieser Artikel darauf ab, die großtechnische Produktion von ASC-Sphäroiden unter Verwendung einer nicht klebenden mikrogeformten Hydrogeltechnik zu zeigen, die ASC-Sphäroide als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze ausbreitet.

Einleitung

Sphäroide gelten als gerüstfreier Ansatz im Tissue Engineering. ASCs sind in der Lage, Sphäroide durch den Selbstorganisationsprozess zu bilden. Die 3D-Mikroarchitektur des Sphäroides erhöht das Regenerationspotenzial von ASCs, einschließlich der Differenzierungskapazität in mehrere Linien ^1,2,3. Diese Forschungsgruppe hat mit ASC-Sphäroiden für Knorpel- und Knochengewebe-Engineering ^{gearbeitet 4,5,6}. Noch wichtiger ist, dass Sphäroide als Bausteine in der Biofabrikation von Geweben und Organen gelten, hauptsächlich aufgrund ihrer Fusionskapazität.

Der Einsatz von Sphäroiden zur Gewebebildung hängt von drei Hauptpunkten ab: (1) der Entwicklung standardisierter und skalierbarer robotischer Methoden für deren Biofabrikation⁷, (2) der systematischen Phänotypisierung von Gewebesphäroiden⁸, (3) der Entwicklung von Methoden zur Montage von 3D-Geweben⁹. Diese Sphäroide können mit verschiedenen Zelltypen gebildet und durch verschiedene Methoden erhalten werden, einschließlich hängender Tropfen, Reaggregation, Mikrofluidik und Mikroformen ^8,9,10. Jede dieser Methoden hat Vor- und Nachteile in Bezug auf die Homogenität der Größe und Form der Sphäroide, die Rückgewinnung der Sphäroide nach der Bildung, die Anzahl der produzierten Sphäroide, die Prozessautomatisierung, die Arbeitsintensität und die Kosten¹¹.

Bei der Mikroform-Methode werden die Zellen aufgrund der Schwerkraft am Boden der Mikroform dosiert und abgeschieden. Das nicht adhäsive Hydrogel erlaubt es den Zellen nicht, am Boden zu haften, und Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen führen zur Bildung eines einzelnen Sphäroids pro Rezession ^8,12. Diese Biofabrikationsmethode erzeugt Sphäroide homogener und kontrollierter Größe, kann mit minimalem Aufwand zeiteffizient für die Großserienproduktion robotisiert werden und hat gute kosteneffizienzkritische Faktoren bei der Konstruktion einer Biofabrikation von Gewebesphäroid ^7,8. Diese Methode kann angewendet werden, um Sphäroide jeder Zelllinie zu bilden, um einen neuen Gewebetyp mit vorhersagbaren, optimalen und kontrollierbaren Eigenschaften^{herzustellen 8}.

Biofabrikation ist definiert als "die automatisierte Erzeugung biologisch funktioneller Produkte mit struktureller Organisation ...^"13. Daher gilt die automatisierte Herstellung von Sphäroiden als erster obligatorischer Schritt für die Entwicklung einer Biofabrikationslinie, die im 3D-Bioprinting-Prozess fortgesetzt wird und in der vollständigen Reifung des biogedruckten Gewebes durch Sphäroidfusion endet. Um die Skalierbarkeit der ASC-Sphäroid-Biofabrikation zu verbessern, verwenden wir in dieser Studie ein automatisiertes Pipettiersystem, um die Zellsuspension zu säen, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Dieses Papier zeigt, dass es möglich war, eine große Anzahl (Tausende) von Sphäroiden herzustellen, die für 3D-Bioprinting-Ansätze benötigt werden, um komplexere Gewebemodelle bioherzustellen.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten ASCs wurden zuvor von gesunden menschlichen Spendern isoliert und kryokonserviert, wie beschrieben¹⁴ gemäß der Forschungsethikkommission des Clementino Fraga Filho Universitätskrankenhauses, Bundesuniversität von Rio de Janeiro, Brasilien (25818719.4.0000.5257). Weitere Informationen zu allen in dieser Studie verwendeten Materialien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle .

1. Trypsinisierung der ASC-Monoschicht bei Passage drei

1. Öffnen Sie den 175 cm^2-Kolben der Gewebekultur, der die Monoschicht aus ASCs bei 80% Zusammenfluss enthält, und entsorgen Sie den Überstand.
2. Fügen Sie 7 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 0,01 M) hinzu und waschen Sie die Monoschicht zweimal. Als nächstes entsorgen Sie die Flüssigkeit.
3. Fügen Sie 5 ml 0,125% Trypsin mit 0,78 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzu. Als nächstes für 5 min bei 37 °C inkubieren.
4. Geben Sie 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) in die Gewebekultur 175 cm² Flasche und mischen Sie die Zellsuspension gut mit einer 10 ml sorologischen Pipette.
5. Ernten Sie die Zellsuspension mit einer serologischen 10-ml-Pipette und geben Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie bei 400 × g für 5 Minuten, um das Pellet von ASCs zu erhalten. Resuspendiert das Zellpellet mit DMEM LOW mit 10% FBS.
6. Führen Sie eine Zellenzählung durch Trypan-Ausschluss durch.
7. Nach dem Zählen nehmen Sie insgesamt 1 × 10⁶ ASCs in ein separates 15-ml-Zentrifugenröhrchen, um die 81 Rezessionen zu säen, die mit nicht anhaftendem Hydrogel mikrogeformt wurden (insgesamt 10.000 Zellen / ml hier ausgesät). Um 256 Rezessionen von mikrogeformtem, nicht haftendem Hydrogel zu säen, nehmen Sie insgesamt 5 × 10⁵ ASCs in ein Zentrifugenröhrchen (insgesamt 2.500 Zellen / ml hier ausgesät).

2. Herstellung von mikrogeformtem, nicht anhaftendem Agarose-Hydrogel

1. Bereiten Sie 50 ml einer sterilen Lösung von 2% hochreiner Agarose in 0,9% NaCl in Reinstwasser vor. Autoklavieren Sie die Lösung für 30 min bei 121 °C.
2. Geben Sie 500 μL sterile 2% hochreine Agaroselösung in die Mitte einer Silikonform mit 81 oder 256 kreisförmigen Aussparungen.
3. Nach 40 min die hochreine Agarose aus der Silikonform entformen und in eine Vertiefung einer 12-Well-Kunststoffplatte geben.
4. 2 ml DMEM LOW in das Bohrloch mit der mikrogeformten Agarose geben und in einem Inkubator bei 37 °C in einer 5%igen CO_{2-Atmosphäre} für mindestens 12 h inkubieren, bevor die ASCs ausgesät werden.

3. Biofabrikation von ASC-Sphäroiden mit dem automatisierten Pipettiersystem

1. Überprüfen Sie Folgendes:
   1. Überprüfen Sie, ob die laminare Strömung eingeschaltet ist und der Luftstrom des Schranks ordnungsgemäß funktioniert.
   2. Überprüfen Sie, ob das Gerät an die richtige Spannung angeschlossen ist.
   3. Überprüfen Sie, ob das Tablet mit dem Gerät verbunden ist.
   4. Prüfen Sie, ob die Höhe des Schrankschutzglases auf der Höhe der Sensormarkierung des Gerätes liegt.
2. Drücken Sie die Ein-/Aus-Taste auf der linken Seite des Geräts und warten Sie, bis das Tablet und das Gerät gestartet sind.
3. Positionieren Sie die Spitzenkästen, das Rack für Zentrifugenröhrchen und die Platte mit dem mikrogeformten Agarosehydrogel im Arbeitsbereich der Ausrüstung.
4. Klicken Sie am Tablet mit geöffneter Software zunächst auf den Labware Editor.
5. Richten Sie einen virtuellen Arbeitstisch ein und wählen Sie die Positionen der Pipetten, Spitzenkästen, des Racks für die Kunststoffrohre und der Platten aus.
   HINWEIS: Der virtuelle Arbeitstisch muss die physischen Positionen des Zubehörs in der Ausrüstung darstellen.
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Switch to Produce , um die Parameter (siehe Schritt 3.10) und Befehle einzuschließen, die das Gerät während des gesamten Experiments ausführen wird. Warten Sie, bis eine Symbolleiste und eine Produktliste in der Software geöffnet sind.
7. Um die Befehle anzugeben, geben Sie zunächst die Anzahl der Proben an, die pipettiert werden sollen, und ziehen Sie sie in die Produktionsliste.
   HINWEIS: Die Anzahl der Proben ist die Anzahl der Kunststoffzentrifugenröhrchen, die die ASC-Suspension enthalten, die in der Mitte der Mikroformen ausgesät werden soll.
8. Nachdem Sie die Anzahl der Proben eingegeben haben, klicken Sie auf die Befehlsschaltfläche Probentransfer in der Software, um die ASC-Suspension auf die Vertiefungen der 12-Well-Platte zu übertragen, die die Mikroformen enthält, und ziehen Sie sie in die Produktliste.
9. Klicken Sie auf Eigenschaften , um die Start- und Endpositionen für das Gerät einzurichten, um die Probe zu übertragen.
10. Warten Sie, bis die Software zur Seite Arbeitstabelle zurückgekehrt ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Optionen, um die Parameter für die automatische Aussaat der ASCs einzurichten: i) Aspirationsgeschwindigkeit von 15,4 ^s-1; ii) Abgabegeschwindigkeit von 1 ^s-1; iii) Blasverzögerung von 0 ms; iv) Blasgeschwindigkeit von 15,4 ^s-1; v) Anfangsstrich von 100%. Wählen Sie Wasser als Standardflüssigkeitstyp aus.
11. Legen Sie die Parameter fest, um die ASCs zu mischen, um eine homogene Suspension zu erhalten: i) Anzahl der Zyklen von 5; ii) Geschwindigkeit von 6,5 ^s-1; iii) Volumen von 300 μL.
12. Nachdem Sie die Parameter eingerichtet haben, fügen Sie die Zeit von 40 Minuten zur Produktliste hinzu.
    HINWEIS: Diese Zeit wird benötigt, um zu warten, bis die ASC-Suspension an der Unterseite der Mikroform dekantiert.
13. Fügen Sie in der Produktliste die Option Reagenzientransfer hinzu, um das Sphäroidkulturmedium auf die entsprechenden Vertiefungen der Platte zu übertragen.
14. Wiederholen Sie die Schritte 3.9-3.11, um die Positions- und Parameterkonfigurationen für die Übertragung des Sphäroidkulturmediums einzurichten.
15. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit einem Häkchensymbol in der oberen Leiste der Software, um sicherzustellen, dass kein Programmierfehler vorliegt.
16. Klicken Sie auf die Schaltfläche Play (mit einem Dreieckssymbol) in der oberen Leiste der Software, um das Programm zu starten.
17. Lassen Sie das Gerät wie programmiert starten und warten Sie, bis es einen Ton macht, der anzeigt, dass es fertig ist.
18. Sammeln Sie die 12-Well-Platte und inkubieren Sie sie in einem Inkubator bei 37 ° C, 5% CO₂ für mindestens 18 h, damit die Sphäroide vollständig geformt und kompakt sind.
19. Ernten Sie die Sphäroide manuell nach 1, 3 und 7 Tagen Kultur zur Analyse. Spülen Sie das Medium manuell mit einer Mikropipette, um die Sphäroide aus dem mikrogeformten, nicht anhaftenden Agarosehydrogel zu befreien.
20. Überprüfen Sie nach 5 min unter dem Mikroskop, ob die Sphäroide vollständig aus dem mikrogeformten, nicht anhaftenden Agarosehydrogel freigesetzt werden.
21. Sammeln Sie die Sphäroide manuell mit einer Mikropipette und geben Sie sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
22. Waschen Sie die Sphäroide mindestens zweimal mit 0,01 M PBS. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit und führen Sie biomechanische Analysen an den frischen Sphäroidproben durch. Für die morphologische Analyse (Histologie) werden die Sphäroidproben in 4% Paraformaldehyd in PBS für mindestens 18 h bei 2-8 °C inkubiert.

Ergebnisse

Das automatische Pipettensystem kann die ASC-Zellsuspension in 15 Minuten in 12 Vertiefungen einer 12-Well-Platte einsäen. Mit dem 81 mikrogeformten nicht adhärent Hydrogel werden am Ende des Protokolls 972 Sphäroide hergestellt. Mit dem 256 mikrogeformten nicht adhärent Hydrogel werden am Ende des Protokolls 3.072 Sphäroide erzeugt. ASC-Sphäroide wurden auf die Homogenität ihrer Größe und Form analysiert. ASC-Sphäroide aus Mikroformen mit 81 Rezessionen zeigten während der Kulturperiode einen homogenen Durchm...

Diskussion

Dieser Beitrag stellt die großtechnische Erzeugung von ASC-Sphäroiden mit einem automatisierten Pipettensystem vor. Der kritische Schritt des Protokolls besteht darin, die Software genau einzurichten, um das richtige Volumen der Zellsuspension, die Geschwindigkeit und den richtigen Abstand für das Pipettieren sicherzustellen. Die im Protokoll beschriebenen Parameter wurden nach einer Reihe von Versuchen bestimmt, um die Dosierung der ASC-Zellsuspension in die Vertiefungen von 12-Well-Platten mit mikrogeformten, nicht ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100