Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die großtechnische Produktion von aus Fett gewonnenen Stroma-/Stammzell-Sphäroiden (ASC) unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems zur Aussaat der Zellsuspension, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Diese ASC-Sphäroide können als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze verwendet werden.

Zusammenfassung

Adipose-abgeleitete Stromal-/Stammzellen (ASCs) sind eine Subpopulation von Zellen, die in der stromalen vaskulären Fraktion des menschlichen subkutanen Fettgewebes vorkommen und als klassische Quelle mesenchymaler Stroma-/Stammzellen anerkannt sind. Viele Studien wurden mit ASCs für gerüstbasierte Tissue-Engineering-Ansätze veröffentlicht, die hauptsächlich das Verhalten dieser Zellen nach ihrer Aussaat auf bioaktiven Gerüsten untersuchten. Es entstehen jedoch gerüstfreie Ansätze, um Gewebe in vitro und in vivo zu entwickeln, hauptsächlich durch die Verwendung von Sphäroiden, um die Einschränkungen von gerüstbasierten Ansätzen zu überwinden.

Sphäroide sind 3D-Mikrogewebe, die durch den Selbstorganisationsprozess gebildet werden. Sie können die Architektur und Mikroumgebung von nativem Gewebe besser nachahmen, hauptsächlich aufgrund der Vergrößerung von Zell-zu-Zell- und Zell-zu-extrazellulärer Matrix-Interaktionen. In jüngster Zeit werden Sphäroide hauptsächlich als Krankheitsmodelle, Arzneimittelscreening-Studien und Bausteine für den 3D-Bioprinting untersucht. Für 3D-Bioprinting-Ansätze sind jedoch zahlreiche Sphäroide in Größe und Form erforderlich, um komplexe Gewebe- und Organmodelle bioherzustellen. Darüber hinaus besteht bei der automatischen Herstellung von Sphäroiden die Wahrscheinlichkeit einer mikrobiologischen Kontamination gering, was die Reproduzierbarkeit der Methode erhöht.

Die großtechnische Produktion von Sphäroiden gilt als erster obligatorischer Schritt für die Entwicklung einer Biofabrikationslinie, die im 3D-Bioprinting-Prozess fortgesetzt wird und in der vollständigen Reifung des Gewebekonstrukts in Bioreaktoren endet. Die Anzahl der Studien, die die groß angelegte ASC-Sphäroidproduktion untersuchten, ist jedoch immer noch gering, zusammen mit der Anzahl der Studien, die ASC-Sphäroide als Bausteine für den 3D-Bioprinting verwendeten. Daher zielt dieser Artikel darauf ab, die großtechnische Produktion von ASC-Sphäroiden unter Verwendung einer nicht klebenden mikrogeformten Hydrogeltechnik zu zeigen, die ASC-Sphäroide als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze ausbreitet.

Einleitung

Sphäroide gelten als gerüstfreier Ansatz im Tissue Engineering. ASCs sind in der Lage, Sphäroide durch den Selbstorganisationsprozess zu bilden. Die 3D-Mikroarchitektur des Sphäroides erhöht das Regenerationspotenzial von ASCs, einschließlich der Differenzierungskapazität in mehrere Linien ^1,2,3. Diese Forschungsgruppe hat mit ASC-Sphäroiden für Knorpel- und Knochengewebe-Engineering ^{gearbeitet 4,5,6}. Noch wichtiger ist, dass Sphäroide als Bausteine in der Biofabrikation von Geweben ....

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten ASCs wurden zuvor von gesunden menschlichen Spendern isoliert und kryokonserviert, wie beschrieben¹⁴ gemäß der Forschungsethikkommission des Clementino Fraga Filho Universitätskrankenhauses, Bundesuniversität von Rio de Janeiro, Brasilien (25818719.4.0000.5257). Weitere Informationen zu allen in dieser Studie verwendeten Materialien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle .

1. Trypsinisierung der ASC-Monoschicht bei Passage drei

1. Öffnen Sie den 175 cm^2-Kolben der Gewebekultur, der die Monoschicht aus ASCs bei 80% Zusammenflus....

Ergebnisse

Das automatische Pipettensystem kann die ASC-Zellsuspension in 15 Minuten in 12 Vertiefungen einer 12-Well-Platte einsäen. Mit dem 81 mikrogeformten nicht adhärent Hydrogel werden am Ende des Protokolls 972 Sphäroide hergestellt. Mit dem 256 mikrogeformten nicht adhärent Hydrogel werden am Ende des Protokolls 3.072 Sphäroide erzeugt. ASC-Sphäroide wurden auf die Homogenität ihrer Größe und Form analysiert. ASC-Sphäroide aus Mikroformen mit 81 Rezessionen zeigten während der Kulturperiode einen homogenen Durchm.......

Diskussion

Dieser Beitrag stellt die großtechnische Erzeugung von ASC-Sphäroiden mit einem automatisierten Pipettensystem vor. Der kritische Schritt des Protokolls besteht darin, die Software genau einzurichten, um das richtige Volumen der Zellsuspension, die Geschwindigkeit und den richtigen Abstand für das Pipettieren sicherzustellen. Die im Protokoll beschriebenen Parameter wurden nach einer Reihe von Versuchen bestimmt, um die Dosierung der ASC-Zellsuspension in die Vertiefungen von 12-Well-Platten mit mikrogeformten, nicht .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100