JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر ستارة الحمض النووي ، وهي تقنية تصوير أحادية الجزيء عالية الإنتاجية ، منصة للتصور في الوقت الفعلي لتفاعلات البروتين والحمض النووي المتنوعة. يستخدم البروتوكول الحالي تقنية ستارة الحمض النووي للتحقيق في الدور البيولوجي والآلية الجزيئية ل Abo1 ، وهو باز برومودومين يحتوي على فطريات الفصام يحتوي على AAA + ATPase.

Abstract

الكروماتين تركيب أعلى مرتبة يحزم الحمض النووي الحقيقي النواة. يخضع الكروماتين لتغيرات ديناميكية وفقا لمرحلة دورة الخلية واستجابة للمحفزات البيئية. هذه التغييرات ضرورية للسلامة الجينومية ، والتنظيم اللاجيني ، والتفاعلات الأيضية للحمض النووي مثل النسخ المتماثل والنسخ والإصلاح. يعد تجميع الكروماتين أمرا بالغ الأهمية لديناميكيات الكروماتين ويتم تحفيزه بواسطة مرافقي هيستون. على الرغم من الدراسات المكثفة ، فإن الآليات التي تمكن بها مرافقو الهستون من تجميع الكروماتين لا تزال بعيدة المنال. علاوة على ذلك ، فإن السمات العالمية للنيوكليوسومات التي ينظمها مرافقو الهستون غير مفهومة بشكل جيد. لمعالجة هذه المشاكل ، يصف هذا العمل تقنية تصوير فريدة من نوعها أحادية الجزيء تسمى ستارة الحمض النووي ، والتي تسهل التحقيق في التفاصيل الجزيئية لتجميع النيوكليوسوم بواسطة مرافقي الهستون. ستارة الحمض النووي هي تقنية هجينة تجمع بين سيولة الدهون ، وعلم الموائع الدقيقة ، والمجهر الفلوري الداخلي الكلي (TIRFM) لتوفير منصة عالمية للتصوير في الوقت الفعلي لتفاعلات البروتين والحمض النووي المتنوعة. باستخدام ستارة الحمض النووي ، يتم فحص وظيفة مرافقة هيستون ل Abo1 ، Schizosaccharomyces pombe bromodomain المحتوية على AAA + ATPase ، ويتم الكشف عن الآلية الجزيئية الكامنة وراء تجميع الهستون ل Abo1. توفر ستارة الحمض النووي نهجا فريدا لدراسة ديناميكيات الكروماتين.

Introduction

يتم حزم الحمض النووي حقيقي النواة في بنية أعلى مرتبة تعرف باسم الكروماتين 1,2. النيوكليوسوم هو الوحدة الأساسية للكروماتين ، والذي يتكون من حوالي 147 bp DNA ملفوفة حول الهستونات الأساسيةالثماني 3,4. يلعب الكروماتين دورا مهما في الخلايا حقيقية النواة. على سبيل المثال ، يحمي الهيكل المدمج الحمض النووي من العوامل الداخلية والتهديدات الخارجية5. يتغير هيكل الكروماتين ديناميكيا وفقا لمرحلة دورة الخلية والمحفزات البيئية ، وتتحكم هذه التغييرات في الوصول إلى البروتين أثناء معاملات الحمض النووي مثل النسخ المتماثل والنسخ والإصلاح6. ديناميكيات الكروماتين مهمة أيضا للاستقرار الجيني والمعلومات اللاجينية.

يتم تنظيم الكروماتين ديناميكيا من خلال عوامل مختلفة ، بما في ذلك تعديلات ذيل الهستون ومنظمات الكروماتين مثل أجهزة إعادة تشكيل الكروماتين وبروتينات مجموعة polycomb ومرافقي هيستون7. يقوم مرافقو هيستون بتنسيق تجميع وتفكيك النيوكليوسومات عن طريق ترسب أو انفصال الهستونات الأساسية 8,9. تؤدي العيوب في مرافقي الهستون إلى عدم استقرار الجينوم وتسبب اضطرابات في النمو والسرطان 9,10. لا يحتاج العديد من مرافقي الهستون إلى استهلاك الطاقة الكيميائية مثل التحلل المائي ATP لتجميع أو تفكيك النيوكليوسومات9،11،12،13. في الآونة الأخيرة ، أفاد الباحثون أن ATPases المحتوية على البرومودومين AAA + (ATPase المرتبط بالأنشطة الخلوية المتنوعة) تلعب دورا في ديناميكيات الكروماتين كمرافقين هيستون14،15،16،17. يعزز ATAD2 البشري (البروتين 2 المحتوي على مجال ATPase من عائلة ATPase) إمكانية الوصول إلى الكروماتين لتعزيز التعبير الجيني18. بصفته منظما مشاركا للنسخ ، ينظم ATAD2 كروماتين عوامل النسخ المسرطنة14 ، ويرتبط الإفراط في التعبير عن ATAD2 بسوء التشخيص في العديد من أنواع السرطان19. Yta7 ، Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) متماثل ATAD2 ، يقلل من كثافة النيوكليوسوم في الكروماتين15. في المقابل ، Abo1 ، متماثل Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) من ATAD2 ، يزيد من كثافة النيوكليوسوم16. باستخدام تقنية تصوير فريدة من نوعها أحادية الجزيء ، يتم تناول ستارة الحمض النووي ، سواء كان Abo1 يساهم في تجميع أو تفكيك النيوكليوزوم17,20.

تقليديا ، تم فحص الخواص الكيميائية الحيوية للجزيئات الحيوية من خلال تجارب مجمعة مثل مقايسة تحول الحركة الكهربائية (EMSA) أو الترسيب المناعي المشترك (co-IP) ، حيث يتم فحص عدد كبير من الجزيئات ، وتتميز متوسط خصائصها21,22. في التجارب السائبة ، يتم حجب الحالات الفرعية الجزيئية من خلال تأثير متوسط المجموعة ، ويتم تقييد التفاعلات الجزيئية الحيوية للبحث. في المقابل ، تتحايل تقنيات الجزيء الواحد على قيود التجارب المجمعة وتمكن من التوصيف التفصيلي للتفاعلات الجزيئية الحيوية. على وجه الخصوص ، تم استخدام تقنيات التصوير أحادية الجزيء على نطاق واسع لدراسة تفاعلات بروتين الحمض النووي والبروتينوالبروتين 23. إحدى هذه التقنيات هي ستارة الحمض النووي ، وهي تقنية تصوير فريدة من نوعها أحادية الجزيء تعتمد على الموائع الدقيقة والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) 24,25. في ستارة الحمض النووي ، يتم تثبيت مئات جزيئات الحمض النووي الفردية على طبقة الدهون المزدوجة ، والتي تسمح بالحركة ثنائية الأبعاد لجزيئات الحمض النووي بسبب سيولة الدهون. عند تطبيق التدفق الهيدروديناميكي ، تتحرك جزيئات الحمض النووي على طول التدفق على الطبقة المزدوجة وتعلق عند حاجز الانتشار ، حيث يتم محاذاتها وتمديدها. بينما يتم تلطيخ الحمض النووي بعوامل إقحام ، يتم حقن البروتينات الموسومة بالفلورسنت ، ويستخدم TIRFM لتصور تفاعلات البروتين والحمض النووي في الوقت الفعلي على مستوىجزيء واحد 23. تسهل منصة ستارة الحمض النووي مراقبة حركات البروتين مثل الانتشار والنقل والتصادم26،27،28. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام ستارة الحمض النووي لرسم خرائط البروتين على الحمض النووي مع المواضع والاتجاهات والطوبولوجيا المحددة أو تطبيقها على دراسة فصل الطور للبروتين والأحماض النووية29،30،31.

في هذا العمل ، يتم استخدام تقنية ستارة الحمض النووي لتقديم دليل على وظيفة المرافقين من خلال التصور المباشر لبروتينات معينة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن ستارة الحمض النووي عبارة عن منصة عالية الإنتاجية ، فإنها تسهل نطاقا من جمع البيانات يكفي للموثوقية الإحصائية. هنا ، يتم وصف كيفية إجراء مقايسة ستارة الحمض النووي بالتفصيل للتحقيق في الدور الجزيئي ل S. pombe bromodomain المحتوي على AAA + ATPase Abo1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد خلية التدفق

  1. قم بإعداد شريحة سيليكا منصهرة تم تنظيفها تحتوي على أنماط خندق نانوي وفقا للتقريرالمنشور سابقا 25.
    1. احفر فتحتين بقطر 1 مم في شريحة سيليكا منصهرة نظيفة (الشكل 1 أ) باستخدام مثقاب مطلي بالماس (انظر جدول المواد).
    2. قم بإيداع 250 نانومتر من الألومنيوم السميك (Al) على الشريحة باستخدام رش DC32 (انظر جدول المواد) مع 10 mTorr من غاز الأرجون.
    3. قم بتغطية طبقة بسمك 310 نانومتر من 4٪ 950K poly (ميثيل ميثاكريلات) (PMMA) (انظر جدول المواد) عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة واخبزها على طبق ساخن عند 180 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    4. ارسم أنماط الخنادق النانوية على طبقة PMMA بين الثقبين باستخدام الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون (ebeam)33 بتيار 0.724 nA عند 80 kV.
      ملاحظة: يتم عرض بنية وأبعاد أنماط الخنادق النانوية في الشكل 1A.
    5. قم بإزالة PMMA المكشوف عن طريق نقع الشرائح في المحلول النامي (نسبة 1: 3 من ميثيل إيزوبوتيل كيتون وأيزوبروبانول ، انظر جدول المواد) لمدة دقيقتين.
    6. حفر طبقات Al مع النقش الأيوني التفاعلي للبلازما المقترن بالحث (ICP-RIE) باستخدام غازات الكلور (Cl2) وثلاثي كلوريد البورون (BCl3).
      ملاحظة: يمكن لهذين الغازين إزالة Al من المناطق المعرضة للشعاع.
    7. نحت خنادق نانوية على الشرائح باستخدام رباعي فلوريد الكبريت (SF4) ورباعي فلورو الميثان (CF4) والأكسجين (O2) (انظر جدول المواد).
    8. قم بإزالة طبقة Al المتبقية عن طريق نقع الشرائح في Al etchant (مطور AZ 300 MIF ، انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق.
    9. بعد التصنيع ، شطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات و sonicate في الأسيتون لمدة 30 دقيقة باستخدام صوتنة من نوع الحمام.
    10. قم بتنظيف الشرائح في محلول Hellmanex III بنسبة 2٪ (انظر جدول المواد) لمدة يوم واحد على الأقل مع التحريك المغناطيسي.
    11. قم بتحريك الشرائح في الأسيتون لمدة 30 دقيقة و 1 متر هيدروكسيد الصوديوم لمدة 30 دقيقة متتالية.
    12. شطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات وجفف بغاز النيتروجين (N2).
  2. ضع ورقا نظيفا (5 مم × 35 مم) في وسط الشريط على الوجهين. قم بتوصيل الشريط فوق الشريحة لتغطية الفتحتين وأنماط النانو بالورق.
  3. قم باستئصال الورق باستخدام شفرة نظيفة (الشكل 1 أ).
  4. ضع غطاء زجاجي أعلى الشريط على الوجهين وافرك غطاء الغطاء باستخدام طرف ماصة لتشكيل غرفة الموائع الدقيقة (الشكل 1 أ).
  5. ضع خلية التدفق المجمعة بين شريحتين مجهريتين وقم بقصهما.
  6. تخبز خلية التدفق في فرن مفرغ من الحرارة 120 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  7. قم بتوصيل موصل السوائل (Nanoport) للتحليلات القائمة على الرقاقة (انظر جدول المواد) بكل فتحة مفتوحة باستخدام مسدس الغراء الساخن وقم بتوصيل خطي أنابيب قفل Luer.
  8. قم بتوصيل حقنة قفل Luer تحتوي على 3 مل من الماء منزوع الأيونات واغسل الغرفة.
  9. اغسل الحجرة ب 3 مل من المخزن المؤقت للدهون (20 مللي مول من Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 100 مللي مول من كلوريد الصوديوم) عبر اتصال قطرة بقطرة.
    ملاحظة: يربط اتصال قطرة قطرة جميع المحاقن بخلية التدفق لتجنب حقن فقاعات الهواء في الغرفة.
  10. حقن 1 مل من 0.04x الدهون البيوتينيلية في العازلة الدهنية في الغرفة في جرعتين مع حضانة 5 دقائق لكل حقنة.
    ملاحظة: تم وصف تحضير 1x مخزون الدهون البيوتينيلية في تقرير نشر سابقا34.
  11. اغسل الحجرة ب 3 مل من محلول الدهون واحتضانها لمدة 20 دقيقة حتى تنضج طبقة الدهون المزدوجة على سطح الشريحة.
  12. أضف 1 مل من المخزن المؤقت BSA (40 مللي مول من Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 50 مللي مول من كلوريد الصوديوم ، و 2 مللي مول من MgCl2 ، و 0.2 مجم / مل من BSA) واحتضانها لمدة 5 دقائق لتخميل سطح الشريحة.
    ملاحظة: يمكن أن تقلل هذه الخطوة من الارتباط غير النوعي للبروتينات بسطح الشريحة.
  13. حقن 0.025 ملغم / مل من الستربتافيدين في 1 مل من المخزن المؤقت BSA مع حقنتين وحضانة لمدة 10 دقائق لكل حقنة.
  14. اغسل الستربتافيدين المتبقي مع 3 مل من المخزن المؤقت BSA.
  15. حقن ~ 300 pM (30 μL) من الحمض النووي لعاثية لامدا البيوتينيلات في 1 مل من المخزن المؤقت BSA في الغرفة مع طلقتين وحضانة 10 دقائق لكل طلقة.
    ملاحظة: تم وصف تحضير الحمض النووي لامدا البيوتينيلاتي في تقرير نشر سابقا34.

2. توصيل خلية التدفق بنظام الموائع الدقيقة وتحميلها على المجهر

  1. تحضير المخزن المؤقت للتصوير Abo1 (50 مللي مول من Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 100 مللي مول من كلوريد الصوديوم ، و 1 مللي مول من DTT ، و 1 مللي متر من ATP ، و 2 مللي مول من MgCl2 ، و 1.6٪ جلوكوز ، و 0.1x من الجلوكسي ، انظر جدول المواد).
    ملاحظة: Gloxy هو نظام كسح الأكسجين الذي يقلل من التبييض الضوئي للأصباغ الفلورية. تم وصف تحضير مخزون 100x gloxy مع أوكسيديز الجلوكوز والكاتلاز في المرجع35.
  2. قم بتوصيل حقنة تحتوي على 10 مل من مخزن التصوير المؤقت بمضخة حقنة وإزالة الفقاعات في جميع خطوط الأنابيب في نظام الموائع الدقيقة.
  3. قم بإقران خلية التدفق المحضرة بنظام الموائع الدقيقة عبر اتصال قطرة إلى قطرة لتجنب حقن الفقاعة في خلية التدفق (الشكل 1 ب).
  4. قم بتجميع خلايا التدفق وحوامل خلايا التدفق وقم بتركيب التجميع على مجهر TIRF مصمم خصيصا (الشكل 1C).
    تنبيه: عند وضع خلية التدفق تحت المجهر ، اضبط ارتفاع العدسة الشيئية بعناية. يجب ألا تلمس خلية التدفق العدسة الموضوعية. هذا يمكن أن يتلف العدسة.
  5. قم بمطابقة الزيت بمؤشر الإسقاط في وسط خلية التدفق وضع منشور حمامة مصنوع خصيصا (انظر جدول المواد) على قطرة الزيت.

3. تجميع هيستون بواسطة Abo1 باستخدام ستارة الحمض النووي

  1. امزج 5 نانومتر من Abo1 و 12.5 نانومتر من ديمر هيستون H3-H4 المسمى Cy5 (Cy5-H3-H4) (انظر جدول المواد) في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير. تم تحضير جميع البروتينات بعد التقريرالمنشور سابقا 17.
  2. احتضان الخليط على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: لتجنب التبييض الضوئي ل Cy5 ، يجب أن تتم الحضانة في الظلام.
  3. حقن ~ 20 pM (2 μL) من صبغة YOYO-1 في المخزن المؤقت للتصوير من خلال 100 ميكرولتر من حلقة العينة لتلطيخ جزيئات الحمض النووي لامدا.
  4. قم بتشغيل برنامج التصوير (انظر جدول المواد) وقم بتشغيل ليزر 488 نانومتر للتحقق مما إذا كانت ستائر الحمض النووي جيدة التكوين.
    ملاحظة: إذا كانت ستائر الحمض النووي جيدة التكوين ، فإن جزيئات الحمض النووي ، الملطخة ب YOYO-1 ، تظهر كخطوط محاذاة عند حاجز في وجود تدفق. ترتد الخطوط الممتدة وتنتشر بعيدا عن الحاجز عند إيقاف تشغيل التدفق.
  5. حقن 2 مل من المخزن المؤقت عالي الملح (200 مللي مول من كلوريد الصوديوم و 40 مللي مول من MgCl2) للتخلص من صبغة YOYO-1 من الحمض النووي.
  6. بعد إزالة صبغة YOYO-1 ، قم بحقن عينة البروتين المحتضنة مسبقا.
  7. عندما تصل البروتينات إلى ستارة الحمض النووي ، قم بإيقاف تشغيل مضخة المحقنة ، وأغلق صمام الإغلاق ، واحتضان 15 دقيقة لتحميل الهستون بواسطة Abo1.
  8. اغسل Abo1 غير المنضم وبروتينات هيستون لمدة 5 دقائق.
  9. قم بتشغيل صمام الإغلاق واستأنف حقن التدفق.
  10. قم بتشغيل ليزر 637 نانومتر وصور البروتينات الفلورية أثناء تشغيل تدفق المخزن المؤقت.
  11. قم بإيقاف تشغيل التدفق المؤقت بشكل عابر للتحقق مما إذا كانت بروتينات الهستون محملة على الحمض النووي (الشكل 2C).
  12. اجمع صور ستارة الحمض النووي باستخدام برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: عندما يتوقف تدفق المخزن المؤقت بشكل عابر ، يرتد الحمض النووي خارج المجال الزائل للانعكاس الداخلي الكلي ، وتختفي البروتينات ذات العلامات الفلورية المرتبطة بالحمض النووي.

4. تحليل البيانات

  1. قم بتحويل الصور التي تم التقاطها بواسطة برنامج الحصول على الصور إلى تنسيق TIFF كتسلسلات صور.
    ملاحظة: تم تحليل جميع البيانات باستخدام الصورة J (NIH) كما هو موضح في المرجع20.
  2. اختر جزيء DNA واحدا من تتابعات الصور وارسم كيموجرافا.
    ملاحظة: يمكن أن يظهر الكيموغراف التغير في شدة التألق لكل بروتين هيستون مرتبط بجزيء DNA واحد كدالة للوقت.
  3. قم بإنشاء ملف تعريف شدة التألق من kymograph وتناسبه مع وظائف Gaussian المتعددة.
  4. اجمع إحداثيات مركز القمم من ملف تعريف شدة التألق. في هذه الخطوة ، يمكن الحصول على الحد الأدنى من شدة مضان هيستون.
  5. قسم جميع شدة الذروة التي تم جمعها من الملفات الشخصية على الحد الأدنى من الشدة. يقدر عدد ثنائيات H3-H4 المرتبطة بالحمض النووي في هذه الخطوة.
  6. نفذ الخطوات 4.2-4.5 لجزيئات الحمض النووي الأخرى.
  7. قم بإنشاء مدرج تكراري لتوزيع الربط لثنائيات H3-H4 بحجم حاوية 1 كيلوبايت. عدد الجزيئات التي تم تحليلها لا يقل عن 300.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يصف هذا العمل الإجراء الخاص بإعداد خلايا التدفق لمقايسة ستارة الحمض النووي (الشكل 1 أ). سهلت مقايسة ستارة الحمض النووي دراسة تجميع ديمر هيستون H3-H4 على الحمض النووي بواسطة Abo1. أولا ، تم فحص تكوين ستارة الحمض النووي عن طريق تلطيخ جزيئات الحمض النووي باستخدام YOYO-1 ، وهي صبغة مقح?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

كتقنية تصوير أحادية الجزيء ، تم استخدام ستارة الحمض النووي على نطاق واسع لاستكشاف تفاعلات التمثيل الغذائي للحمض النووي43. ستارة الحمض النووي هي نظام هجين يربط سيولة الدهون ، وعلم الموائع الدقيقة ، و TIRFM. على عكس تقنيات الجزيء الواحد الأخرى ، تتيح ستارة الحمض النووي تصورا عالي ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يقدر المؤلفون الدعم الكريم ل Abo1 و Cy5-H3-H4 من قبل البروفيسور جي جون سونغ ، كارول تشو ، دكتوراه ، وجوون جانغ ، دكتوراه ، في KAIST ، كوريا الجنوبية. يتم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية للبحوث (NRF-2020R1A2B5B01001792) ، وصندوق البحوث الداخلية (1.210115.01) التابع لمعهد أولسان الوطني للعلوم والتكنولوجيا ، ومعهد العلوم الأساسية (IBS-R022-D1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL luer-lock syringeBecktonDickinson301321
1' x 3' fused-silca slide glassG. Finkenbeiner1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PEAvanti870273This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PEAvanti880130This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringeBecktonDickinson302832
6-way sample injection valveIDEXMX series II
950K PMMAAll-resist671.04
AcetoneSAMCHUNA1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA2383
Aluminum (Al)TASCO, South KoreaLT50AI414Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
AmpicillinMbcellMB-A4128Antibiotics
AZ 300 MIF developerMerck10454110521Used for removing aluminum
BladeDORCODN5212 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3)UNIONGASPurity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
CatalaseSigmaC40-1gThis is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2)UNIONGASPurity: >99.99%
Clear double-sided tape3M313770
D-(+)-glucoseSigmaG7528
DC sputterSoronaSRM-120Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bitEurotoolDIB-211.00Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co. Ltd.1906-106Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
DrillDremelDremel 3000Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean LithographyNanobeam Ltd.NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)SigmaEDS-1KG
Fingertight fittingsIDEXF-300It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nutIDEXP-235It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOLLabogeneHC3110Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidaseSigmaG2133-50KUThis is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochlorideAcros Organics364790025
Hamilton syringeHamilton Company80065This syringe is used for sample injection
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrerCorningPC-420D
Hydrochloric acidSigmaH1759Used for Tris-HCl
Index matching oilZEISS444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etchingTop Technology Ltd.FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Glentham Life SciencesGC6586-100gUsed for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNANEBN0311
LB brothBD difco244610Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32IDEXP-659This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydratefisher bioreagentsBP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK)KAYAKU ADVANCED MATERIALSUsed for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslipMARIENFELD10114222 x 50 mm (No. 1)
Microscope slideDURAN GROUPDU.2355013Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
NanoportIDEXN-333-01
Objective lensNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WIImmersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC6060-03Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
PFA tubing naturalIDEX1512LIt is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche11359061001Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High ResolutionCytiva17-0584-01Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valveIDEXP-732
Sodium acetateSigma791741
Sodium chloride (NaCl)SigmaS3014
Sodium hydroxide (NaOH)Sigmas5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDaSpectrum laboratories132660
StreptavidinThermo Fisher ScientificS888
Sulfur tetralfluoride (SF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
Syringe pumpKD Scientific78-8210
Tetrafluoromethane (CF4)NOBLEGAS, South KoreaPurity: >99.99%
TritonX-100SigmaT9284
Trizma baseSigmaT1503Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715Used for FPLC (ion exchange)
Union assemblyIDEXP-760This connects tubings
UreaSigmaU5378
Vacuum ovenJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME)SigmaM6250

References

  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
  3. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  4. McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
  5. Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622(2013).
  6. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  7. Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658(2013).
  8. Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
  9. Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
  10. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  11. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  12. Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
  13. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  14. Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
  15. Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
  16. Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
  17. Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764(2019).
  18. Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
  19. Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
  20. Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
  21. Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
  22. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
  23. Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
  24. Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
  25. Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
  26. Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
  27. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
  28. Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
  29. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  30. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
  31. Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
  32. Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
  33. Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001(2009).
  34. Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320(2020).
  35. Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  36. Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13(2010).
  37. Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
  38. Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
  39. Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
  40. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  41. Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
  42. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  43. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  44. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  45. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  46. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  47. Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TIRFM Abo1 AAA ATPase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved